Name: Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Öğrenin, fare indüklenebilir telomeraz allellerini in vivo ve in vitro manipüle etme yöntemini. Doku dejenerasyonu, yenilenme ve kanser araştırmalarında yaşlanma fenotiplerini hafifletmek için bu protokolü kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.H., NIH K99/R00 Bağımsızlığa Giden Yol Ödülü (5K99CA172700) ve NCI Beyin Kanseri SPORE Kariyer Geliştirme Ödülü (2P50CA127001) tarafından desteklenmektedir.

NOT: Bu protokol tüm adımlar UT MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır. MTERT-ER, alel 1 Üretimi <ol><li> Knock-tanıtılması ERT2-LBD (Ligant Bağlama Alanı) üst ve (intron 2 boyunca ekson 1) mTERT genomik sekans ile çerçeve içinde bir Lox ihtiva eden hedefleme vektörü - fare ES hücreleri içine Füme fragmanı (Şekil 1A) - pgk - neo elektroporasyon ile. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve vuruş-in alel güney lekesi ile onaylayın. </li><li> Ters bir mikroskop altında C57BL içine mikromanipulasyon kiti ile / 6 blastosistler% 95&#39;in üzerinde, normal kromozom iki ES hatları enjekte. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 fe yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mateerkek. </li><li> Güney blot heterozigot mTERT-ERneo hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> NeoR kaseti silmek için heterozigot mTERT-ERneo hayvanlar ve EIIa-Cre hayvanları Mate. Homozigosite oluşturmak için en az üç kez ve daha fazla arası bir cins heterozigot mTERT ER hayvanlar için, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate. </li></ol> LSL-mTERT alel 2. Üretim <ol><li> Knock-bir loxP ihtiva eden hedefleme vektörü sunulması - üç Tapa - Yeni - LoxP fragmanını ve elektroporasyon 23, fare ES hücreleri içerisine (ekson 1 ve intron 2, Şekil 1B arasında) mTERT genomik sekans. </li><li> Kültür 6-10 gün neomisin ES hücreleri. Neomisin dirençli klonlar almak ve 48 gözlü levhalar genleşir. Bir ticari kit kullanılarak genomik DNA ayıklayın ve güney blot 23 ile vuruş-in alel onaylayın. </li><li> Injeters bir mikroskop altında bir mikromanipulasyon kiti ile C57BL / 6 blastosist içine% 95 normal karyotipli ct iki ES hatları. Vekil annelerin 23 rahim içine blastosistler implante. C57BL / 6 kadın yüksek dereceli erkek Khimaira&#39;da (% 70-90) Mate. </li><li> Güney blot heterozigot LSL-mTERT hayvanların genotiplendirmesi onaylayın. </li><li> En az üç kez, C57BL / 6 hayvan için heterozigot hayvanlar Mate ve ayrıca arası cins heterozigot LSL-mTERT hayvanlar homozigosite üretir. </li></ol> In vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT Farelerde Telomeraz 3. Yeniden MTERT-ER <ol><li> Enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletler sterilize. </li><li> % 50 (h / h), oksijen /% 50 (hac / hac): diazot monoksit gazı karışım içinde izofluran odası (indüksiyon için% 4, muhafaza edilmesi için% 2) ile fareler anestezi. Ya da bir ketamin-ksilizin karışımı ile farelerin (100 m uyutmakg / kg vücut ağırlığı, + 10 mg / kg vücut ağırlığı). </li><li> Derin anestezi ulaşıldıktan sonra, indüksiyon odasından anestezi hayvan kaldırmak ve izofluran odasının (% 2) bağlı tüp içinde kendi kafa tutmak. </li><li> Hayvan derinden anestezi sağlamak için farelerin ayak pedleri sıkıştırın. Kurumasını gözleri önlemek için her iki göze merhem koy. Povidon-iyot çözeltisi ile farelerin arkasını silin. </li><li> Arka cilt altında hassas trokar (10 G) ile yavaş salan 4-OHT pelet enjekte edilir ve iki omuz arasındaki orta hatta pelet itin. </li><li> Yara klip uygulayıcı ile kesi Seal ve anestezi kurtarma için fareler izlemek. 10 gün sonra klipleri çıkarın. Prosedür kısaca bitmiş çünkü Ek ısı gerekli değildir. </li><li> 4-OHT topak ile muamele süresi çalışmanın amacı göre optimize edilmelidir. </li></ol> LSL-mTERT için &lt;ol&gt; <li> Tamoksifen (10 mg / ml mısır yağı içinde çözülmüş) (200 ul / 25 g / gün) karın içinden iki ardışık gün enjekte edilir. </li></ol> Nöral Kök Hücre ve In Vitro Telomeraz ve reaktivasyonu 4. İzolasyonu <ol><li> Fareler, karbon dioksit ile kurban edilir ve beyinleri çıkarılır. Üretici başına ticari olarak temin nöral doku ayrışma kiti protokolü izleyin. </li><li> Vorteks fazlası Çözüm 4 için hücre kültürü ortamı, 1 ml ile çözüm 4 etiketli şişe içinde liyofilize toz yeniden süspanse edin. Bu çözelti daha sonra alikotlandı ve daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanmalıdır. </li><li> Ön ısı kullanılmadan önce 15 dakika için 37 ° C &#39;de bir karışımı. </li><li> Çözüm 1 (50 ul) eklenmiş ve çözelti 2 (1900 ul): enzim karışımı 1 olun. Çözüm 3 (20 ul) eklenmiş ve çözelti 4 (10 ul): enzim karışımı 2 olun. </li><li> 400 mg doku ve vorteks için 1.950 ul enzim karışımı 1 hazırlayın. 37 ° C&#39;de karışım önceden ısıtmakKullanımdan önce 15 dakika. </li><li> 1-gün fare beyinleri çıkarıp, ve koku ampuller ve beyincik kaldırarak forebrains tutun. 4 ° C ve çıkartılması da mağaza çünkü soğuk kültür ortamı, 1 ml ön beyin dokuları tutun. 1 saat içinde nöral doku işlemek için emin olun. </li><li> Sindirim başına 400 mg sınırı aşıldı olmadığından emin olmak için doku ağırlığı belirlemek. 35 mm çaplı Petri kabı kapağının üzerine beyin yerleştirin ve bir neşter kullanılarak beyin ezmek. </li><li> HBSS 1 ml ekleyin, 1 ml pipet kullanarak (a / Ca / Mg o) ve arka bir 15 ml tüp içine pipetle parçalar. HBSS ile durulayın (ağırlık / Ca / Mg o). Santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 x g &#39;de ve dikkatli bir şekilde süpernatan aspire. </li><li> Önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 1950 ul (Solutions 1 ve 2) başına en fazla 400 mg doku ekleyin. Çevirici ya da tüpü her 5 dakika çalkalanarak karıştırılması, 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca, 15 ml bir tüp içinde inkübe edin. </li><li> 20 &amp; # ekleyerek doku örneği başına 30 ul enzim karışımı 2 hazırlayın956; Çözüm 4. 10 ul Çözüm 3 bundan sonra, örnek ilave edin. Karıştırmak için hafifçe ters çevirin. Vorteks etmeyin. </li><li> Mekanik yavaş yukarı ve aşağı pipetleme 10 kez ile geniş uçlu, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak doku ayırmak. Hava kabarcıkları oluşturan kaçının. </li><li> Tüpü her 3 dakikada bir ters çevirme, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Adımı 4.11 tekrarlayın ve dokular 200 mg daha büyük ise 4,12 adım. </li><li> 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden, hücre süspansiyonu uygulayın. Hücre süzgecinden 10 ml PBS uygulanır. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 g&#39;da hücre süzgeç ve santrifüj hücre süspansiyonu atın. Aspire tamamen süpernatanlarına. </li><li> Daha fazla uygulamalar için gerekli hacme kök hücre ortamı ile hücrelerin yeniden süspanse. </li><li> , LSL-mTERT NSC&#39;lerde telomeraz aktive iki gün için 100 mcM 4-OHT hücreleri tedavi için. 100 mcM 4 ile kültür ortamında hücreleri tutmak, mTERT-ER NSC&#39;lerde telomeraz etkinleştirmek için-OHT. </li></ol> 5. Telomer BALIK <ol><li> Kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozom hazırlayın. </li><li> FFPE (formalin içerisinde tespit edilmiş parafine gömülmüş) doku kesitleri ksilen içinde deparaffinize ve her biri 5 dakika (% 100,% 90,% 70,% 50 etanol) ve 5 dakika boyunca PBS ile etanol serileri içinde rehidre için. </li><li> Metanol sonrası düzeltme: asetik asit (3: 1) 1-2 saat karıştırıldı. 5 dakika her biri (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava soğuk etanol serisi içinde dehidre olmaktadır. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 1x PBS içinde yıkanır. </li><li> 2 dakika için 37 ° C &#39;de% 4 formaldehit içinde kromozom denatüre. Soğuk etanol serileri içinde her biri 5 dakika (% 70,% 90,% 100 etanol), ve kuru hava kurutmak. </li><li> Her slayt PNA melezleme karışımı 12-25 ul uygulayın. (Hibridizasyon karışımı:% 70 formamid, 0.06x SSC,% 0.2 BSA, 0.5 ng / ml tRNA, 0.5 ng / | il telomer veya sentromer problar) </li><li> Kauçuk çimento ile kapak kayma mühür. 4 m, 80 ° C&#39;de post-doğasını kromozom preparatlarıyla ve doku kesitleriiçinde. Oda sıcaklığında melezleşme veya nemli bir oda içinde, 2-4 saat boyunca 37 ° C. </li><li> Yıkama tamponu, 2 x 15 dakika oda sıcaklığında yıkanır. (Yıkama tamponu:% 70 formamid, 0.06x SSC, pH 7.2). PBST ile, oda sıcaklığında, 3 x 5 dakika yıkanır. Mikroskopik inceleme için DAPI veya uzak-kırmızı floresan ile Counter-leke slaytlar. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
<li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li>
<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
<li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li>
<li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%2C+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+surveys%22%5BJournal%5D)">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li>
<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri ve nasıl in vivo ve in vitro telomeraz etkinleştirmek için bir rapor oluşturma. mTERT-ER etkinliğini yeniden aktive edilmesi için kritik bir adım tamoksifen sürekli konsantrasyonunu tutmak, bu yüzden Amerika&#39;nın Yenilikçi Araştırma tarafından üretilen 4-OHT zaman salınımlı pelet kullanmayı tercih. Peletler 60 gün boyunca 1 ng / ml arasında bir sabit durum kan seviyesinde 4OHT serbest tutun. Bir önceki çalışmada, bu strateji ile telomeraz aktivitesini aktive böyle kök hücre bitkinlik, G4 mTERT ER / ER telomer disfonksiyon ile uyarıldığında birden fazla organda doku yaralanması yanıtları ve organ yetmezliği düşüklüğü gibi dejeneratif fenotipleri iyileştirmek mümkün olduğunu gösterdi farenin 20. Yaşlanma telomeraz işlevi çalışmak dışında, bu iki uyarılabilir telomeraz alelleri de kanseri çalışma için de kullanılabilir. Önceki çalışmalarda aldıBu alel avantajı genomları şekillendirme ve T-hücresi timik lenfoma 21 ve prostat kanseri 22 biyolojisini etkileyen telomer yıpratma ve telomeraz reaktivasyonu rolünü araştırmak için. Bu iki çalışma gösterdi ki geç nesil G4 Atm telomer disfonksiyon - / - mTERT ER / ER ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L fareler için erken mutajenik olayların satın körüklüyor bir mekanizma sağlar Tümör başlatma, henüz tam malign tümörlerin ilerlemesini önler. Telomeraz telomer bozukluğu kaynaklı genomik istikrarsızlık, DNA hasarı kontrol noktaları ve yaygın kromozomal istikrarsızlık bağlamında yeniden zaman böyle prostat kanseri 21 kemik metastazı ve Thymi beyin infiltrasyonu gibi yeni biyolojik özelliklere sahip malign tümörlerin tam ilerlemesini sağlıyordu, bastırıldıc lenfoma 21. Benzer durum daha önce de kolon kanseri ve pankreas kanseri (Dr. Haoqiang Ying Adam Boutin Ronald DePinho kişisel iletişim) dahil olmak üzere diğer kanser türlerinde gözlemlenmiştir. TERS-ER proteini kolayca hayvan tamoksifen veya araç ile muamele edilmiş olmasına bağlı olarak devletler ile kapatılabilir edilebildiği için, mTERT ER alel tarafından üretilen tümör modelleri, anti-telomeraz tedavi test etmek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, tümörler G4 Atm oluşturulan - / - mTERT ER / ER hayvanlar 4-OHT serbest bırakıldı; telomeraz tükenmesi üzerine, tümörler sonunda nedeniyle telomer disfonksiyonu kaynaklı kontrol noktaları 21 iadesi için küçüldü. Bununla birlikte, yanıt olarak direnç kazanmış bazı tümör Telomerlerin (ALT) mekanizmasının bir alternatif uzatılması etkinleştirerek sönme telomeraz için. Bu ALT + dirençli tümörlerin daha fazla karakterizasyonu bu t gösterdihey mitokondriyal sentezi ve oksidatif savunma PGC-1β bir ana regülatörü olmak üzere mitokondriyal biyoloji ve oksidatif savunma katılan genlerin anormal transkripsiyonunu var. Telomeraz + tümör hücreleri 21 nispeten sağlam kalır tutmak ise PGC-1β veya SOD2 (oksidatif savunma başka bir regülatör) demonte anlamlı ALT + tümör hücrelerini ortadan kaldırır. Bu iki knock-in alel bir sınırlama da telomeraz genin doğal odağı çünkü onlar sadece endojen düzeyde telomeraz reaktivasyonunu gelemez olduğunu. Çok insan kanserlerinde telomeraz aslında çok daha yüksek bir seviyede sentezlenmektedir. Telomeraz düzeyini artırmak için, düşünülebilecek bir modifikasyonu Rosa26 lokusuna PGK (fosfogliserat kinaz) promotörü gibi daha güçlü bir promotör ile mTERT ER yapı sokmaktır. Sonuç olarak, bu iki yeni uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri görülmemiş Genet sağlamakIC araçları, özellikle, önceden elde edilen telomer fonksiyon bozukluklarının neden olduğu genomik instabilite arka altında, yaşlanma ve doku homeostazında gibi tümör ilerlemesinde telomeraz fonksiyonlarını incelemek. mTERT ER alel, diğer tümör eğilimli fare modellerine geçen anti-telomeraz tedavi incelemek için kullanılabilir.

Telomeraz telomer korunmasından sorumlu bir enzimdir. Bunlar bütünlüğünü korumak kromozomların uçlarında tekrar eden diziler bulunmaktadır. telomeraz holoenzimin iç kısım bileşenleri, bir ters transkriptaz, katalitik alt birimi (TERT) ve 1,2 tekrar telomerik eklenmesi için bir şablon olarak hizmet eder, bir RNA alt ünitesi (TERC) &#39;dir. Genellikle farklılaşmış somatik hücrelerde engellenir birlikte, telomeraz sağlam aktivite sergiler ve germ hücreleri, kanser hücrelerinin önemli bir rol oynamaktadır ve kök hücreleri. mTERC ve mTERT knockout farelerde kök hücreleri ve kanser hem de telomeraz fonksiyonlarını incelemek için in vivo model sistemlerinde de büyük sağlar. mTERC ve mTERT fareler (G1) farelerde 3 telomerlerin uzun rezerv nedeniyle herhangi bir belirgin fenotipleri yoktu nakavt. Bununla birlikte, seri son nesil (G5-G6) mTERC ve mTERT fareleri birleştiği sonuçlandısonunda ilerici telomerlerin erozyon ve yüksek çoğalma dokuların 4 ciddi dejenerasyon yarattı. Geç nesil (G5-G6) mTERC - / - fareler nedeniyle testis ve germ hücre tükenmesi apoptoz yüksek oranlarda kısırdır. G5-G6 mTERC - / - farelerde de bağlı doku kök / progenitör hücre bölümlerinde 4 apoptoz ve kusurlu kendini yenileme yeteneği yüksek oranlarda kemik iliği, bağırsak ve deri gibi son derece proliferatif dokularda dejeneratif fenotipleri sergilerler. Geç nesil kemik iliği hematopoetik kök hücre mTERC - / - fareler çoğalma potansiyeli sergileyen kaybı, tehlikeye kendini yenileme özelliği, geliştirilmiş apoptoz ve fonksiyonel olarak tükenme 5,6. - / - Farelerde 7,8 Benzer şekilde, bağırsak kript giderek artan apoptotik cisimler G1-G6 mTERC her bir ardışık üretimi gözlendi. TO işlevsiz telomerlerin zararlı etkilerini ciddi geç nesil (G4-G5) engelli edildi vitro yetişkin nöral kök hücrelerin çoğalmasında ve in vivo nöron hem beri yüksek ciro dokulara sınırlı olması mTERC görünmüyor - / - farelerde 9 . Kök hücrelerin telomeraz rolü daha bazı açılardan 10,11 yaşlanma erken benzer bir nadir insan genetik bozukluk Diskeratosis konjenitanın (DKC), bulgular tarafından desteklenmektedir. DKC dyskerin, çekirdek telomeraz alt birimini, ve diğer dyskerin bağlı proteinler 12 şifreleyen TERC, TERT mutasyonlar ve gen neden olur. Ortalama olarak, DKC hastalarında telomer yaştaki kontrollerin daha kısa 99% vardır. hastalığın önemli morbidite hematopoietik kök hücrelerin kusurlu bakım neden olduğu aplastik anemi, kaynaklanmaktadır. Örneğin oral lökoplaki, tırnak distrofisi, zihinsel retardati gibi hastalık diğer yönleritestis atrofi ve akciğer komplikasyonları, tüm telomeraz nakavt farelerin geç nesil doku kök hücreleri ve progenitör hücreler 10, bu yakın anlaşma bulguların fonksiyonlarını engelli öneririz. DKC hastalar miyelodisplastik sendrom eğilimli ve malign mukozal neoplazmlar bir artış prevalansı. Bu nedenle, insan hastalarda telomeraz eksikliği geç nesil telomeraz nakavt farelerde gözlenen kök hücre fonksiyonları ve tümör yatkınlık kusurları tartışıldı. Kısa telomerlerin ve yüksek telomeraz aktivitesi kanseri özellikleridir. Normal veya premalign hücreler bölmek gibi, DNA çift sarmallı-tatili (DSBs) 13 provoke benzer telomerlerin ve hücresel kontrol noktalarının aktivasyonu nihai erozyon düşük ya da hiç telomeraz aktivitesi sonuçları. Klasik DSBs gibi, telomer bozukluk, yaşlanma ve / veya apoptosi gibi hücresel tepkileri, p53 uyardığı gösterilmiştir ve ilişkilendirilmiştir14,15 s. P53 mutasyon inaktive üzerine, hücre bisiklet ve hücre sağkalım translokasyonları ve bölgesel büyütmesi ve silmeler 16,17 ile karakterize bir yanlısı kanserojen mutator mekanizma sağlar telomer disfonksiyonu olan hücrelerde geliştirilmiştir. Aynı zamanda, telomer disfonksiyonu (hatta p53 boş hücreler) ilişkili yaygın kromozomal instabilite devam Bu tür kanserlerin tam habis ilerlemesi sınırlamak gibi görünmektedir. Örneğin, geç nesil G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - fareler nedeniyle telomer yıpratma Ink4a / Arf boş fareler ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış lenfoma insidansı gösterdi. Başka bir çalışmada ise, G4 mTERT daha gelişmiş adenomatöz lezyonlar - / - APC dk fareler büyük ölçüde nedeniyle önemli bir büyüme yakalanması ve apoptoz 18,19 APC dk fareler ile karşılaştırıldığında bastırıldı.telomer genomik istikrarsızlık disfonksiyonu-uyardığını gözlem tümör ilerlemesi telomeraz aktivasyonu kanser hücre canlılığı ve / veya nötralize p53-bağımlı-bağımsız denetim noktası ya mekanizmaları ile uyumlu bir seviyeye genomik istikrarsızlık bastırılması kısmen malign ilerlemesini sağlayacak olabileceği spekülasyonları ister engeller. Telomeraz reaktivasyonu durdurmak ve hatta kök hücrelerin yaşlanma ters ve telomeraz reaktivasyon genomik istikrarsızlık fonunda tümörogenez teşvik edip edemeyecekleri incelemek amacıyla, iki uyarılabilir kemirgen telomeraz allelleri oluşturdu. İlki 4-hidroksitamoksifen olan (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) füzyon knock-alel. 4-OHT yokluğunda, mTERT-ER (amacına mTERT ER / ER) için homozigot fareler, telomeraz aktivitesi eksikliği ve geleneksel mTERT veya m ile aynı sitogenetik ve hücre fenotipleri sürdürmekTERC nakavt modeli. 4-OHT yapılan uygulamadan sonra, ters-ER proteini aktivitesi doğal TERT proteini 20, 21 denk düzeylerde geri yüklenebilir. İkinci alel yeni bir uyarılabilir TERS knock-bir intronik loxp-Durdurucu-loxP kaseti içeren alel (LSL- olan mTERT); LSL eksizyonu Cre-aracılı üzerine, mTERT endojen ifade kontrol mekanizmaları 22 altında yeniden ifade edilir.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Mikromanipülasyon Kiti</td><td>Leica</td><td>Teklif</td><td></td></tr> başına <tr><td>Leica DMI6000 B ters mikroskop</td><td>Leica</td><td>Teklif başına</td><td></td></tr><tr><td>Neomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>izofluran buharlaştırıcı</td><td>Veteriner Anestezi Sistemleri</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ketamin-ksilazin karışımı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pelet</td><td>Amerika'nın Yenilikçi Araştırması</td><td>Özelleştirilmiş</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Trochar (10 Ölçer)</td> <td>Amerika'nın Yenilikçi Araştırması</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>yara klipsi Uygulayıcı</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>klips</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Nöral Doku Ayrışma Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ksilen</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA telomer probu</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA sentromer probu</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Bilimsel</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>kauçuk çimento</td><td>Walmart</td><td>Elmer'in</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

doku dejenerasyonu / yenilenme ve kanser araştırmaları murin İndüklenebilir telomeraz allelleri kullanılması

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomer yaşlanma sırasında doku dejenerasyonu neden köklü sürücüler genom bütünlüğü ve ilişkili DNA hasarı sinyalizasyon ve kontrol noktası tepkilerin kaybı olan disfonksiyonu kaynaklı. Insidans oranları büyük ölçüde yaş arttıkça kanser, kısa telomer uzunlukları ve yüksek telomeraz aktivitesi ile karakterize edilir. Yaşlanma ve kanser telomer disfonksiyonu ve telomeraz reaktivasyonu rollerini incelemek için, protokol, iki kemirgen uyarılabilir telomeraz oluşturmak nasıl gösterir knock-allelleri 4-hidroksitamoksifen (4-OHT) -inducible TERS-Östrojen Reseptör (mTERT-ER) ve Lox -Stopper-Lox TERS (LSL-mTERT). protokol telomer disfonksiyonu neden ve in vivo mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerde telomeraz aktivitesini yeniden etkinleştirmek için prosedürleri açıklar. Örnek veri telomeraz aktivitesinin yeniden aktive telomer işlev bozukluğunun neden olduğu doku dejeneratif fenotipleri iyileştirebilir göstermektedir. Ord içindeer tümörijenez üzerindeki telomeraz reaktivasyonu etkisini belirlemek için, biz prostat oluşturulan tümör modeli G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L ve timus T-hücreli lenfoma modeli G4 Atm - / - mTERT ER / ER . temsili veriler büyük ölçüde tümörogenez artırabilirsiniz telomer disfonksiyonu tarafından uyarılan genomik istikrarsızlık fon bu telomeraz reaktivasyonu göstermektedir. protokol aynı zamanda nöral kök hücreler mTERT-ER ve LSL-mTERT farelerinden (NSC&#39;lerde) izole ve in vitro NSC&#39;lerde telomeraz aktivitesini sokmak için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. temsili veriler telomeraz reaktivasyonu in vitro kendini yenileme yeteneği ve nörogenezi geliştirmek olduğunu göstermektedir. Son olarak, protokol, her iki fare FFPE üzerine telomer FISH (floresan in situ hibridizasyon) gerçekleştirmek için prosedürleri açıklar (Formalin Sabit ve parafınfin Gömülü), beyin dokuları ve kültür hücrelerinin metafaz kromozomları.

stratejiler sıçangil mTERT-ER oluşturmak ve LSL-mTERT knock-allelleri Şekil 1A ve 1 B &#39;de tanımlanmıştır. Spesifik olarak, bir loxP - üç Stoper - Yeni - LoxP fragmanı LSL-mTERT bir alel yaratmak için, ekson 1 ve mTERT lokusunun ekson 2 arasına yerleştirilmiştir. MTERT ER bir alel yaratmak için, mTERT gen ile çerçeve içinde ERT2-LBD nüfuz alanıyla Biz gösterdi ekson 1 N-ucuna yerleştirilmiş olduğu telomeraz geçici 4, 4-OHT peletleri ile muamele edilerek telomer disfonksiyon farelerde yeniden zaman hafta, dejeneratif fenotip birden beyin (Şekil 2A) gibi organ ve testisler (Şekil 2B) &#39;de düzeltilebilir olabilir. Geç kuşak G4 LSL-mTERT ve G4 mTERT in vitro olarak kültürlenen hücrelerde telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, izole nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde)-ER fareler. Biz telomeraz telomer işlevsiz NSC&#39;lerde yeniden ne zaman, NSC&#39;lerde kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde de anlamlı (Şekil 3B) geliştirilmiş oldu (Şekil 3A) artmış, ve in vitro nöron olduğunu gösterdi. Telomer disfonksiyon bağlamında ur gelişimi üzerindeki etkileri telomeraz aktive etkisini belirlemek amacıyla, üretilen PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L (prostat tümör modeli) ve ATM - / - mTERT ER / ER (timik T-hücreli lenfoma modeli) geç nesil kohortlara. Telomeraz 8 haftalık (Şekil 4B) süreyle, enjeksiyon (Şekil 4A) ya da 4-OHT peletler ile bu farelerde tamoksifen tarafından yeniden zaman, tümör oluşumu büyük ölçüde iki prostat tümör modeli (Şekil 4A) ve timus T-hücreli lenfoma modeli olarak geliştirilmiştir ( <strong&gt; Şekil 4B). Son olarak, biz FFPE fare beyin dokularında telomer FISH gerçekleştirme protokolleri (Şekil 5) ve metafaz kromozomları (Şekil 5, ek) bildirdi. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Şekil 1: (A) mTERT-ER knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; ER, tadil edilmiş östrojen reseptörü (ERT2) ligandı bağlanma alanı; DT, dyphteria A toksin gen. (B) LSL-mTERT knock-strateji. Hedefleme vektörü televizyon; AWT vahşi tip alel; KI, knock-in alel; LA, sol kol; RA, sağ kol; E1, ekson 1 &#39;dir; E2, ekson 2; neo pgk neomisin dirençli gen promotör-tahrikli; DURDURUCU, üç tekrarlanan transkripsiyon bitiş dizileri; DT, dyphteria A toksin gen. <pfo class = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within sayfa = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Şekil 2: Temsilcisi veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için organların dejeneratif fenotipleri iyileştiren beyin Temsilcisi görüntüleri (solda). ve testisler (sağ) plasebo ya da 4 hafta boyunca 4-OHT ile tedavi G0 ve G4 mTERT-ER farelerin. Ölçek çubukları 50 um göstermektedir. Yeniden baskı 20 izniyle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Şekil 3:. Temsilci veri telomeraz reaktivasyonu göstermek için kendini yenileme ve in vitro nöral kök hücrelerin nörogenezi artırır (A) nöral kök hücre Temsilcisi görüntüleriG4 LSL-mTERT izole s (üst panel) ve G4 mTERT ER (alt panel), araç ya da 4-OHT ile muamele kök hücre ortamında yetiştirilmesi. (B), farklılaşma ortamında kültürlendi G4 mTERT-ER izole nöral kök hücrelerinin in vitro nöron (Tuj1 +) ve Örnek görüntü (% 1 FBS), araç ya da 4-OHT ile işlemden geçirildi. Ölçek çubukları 100 mikron göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Şekil 4:. Telomeraz yeniden aktivasyonunu gösteren Örnek veri genomik instabilite fonunda tümörogenez artırır, (A) / l, p53 L / L LSL-mTERT G0 PB-Cre4 PTEN L kesilmiş prostat tümörlerinin Örnek görüntüleri +/- G4 PB- Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT- / -, Ve G4 PB-Cre4 PTEN L / L, p53 L / L LSL-mTERT L / L tamoksifen ile işlemden geçirildi. 22 izniyle yeniden yazdırın. (B), G0 ATM kesilerek timus T-hücresi lenfomaları temsili görüntüleri - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER araç ile muamele edilmiş ve G4 Atm - / - mTERT ER / ER 4- ile işlemden geçirildi 8 hafta boyunca OHT. Ölçek çubukları 1 cm göstermektedir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Şekil 5: FFPE fare beyin dokusu ve metafaz (içerlek) üzerine telomerik ve sentromerik FISH Temsilcisi görüntüleri. Kırmızı, yeşil telomer boyama gösterir, DNA gösterir, ve mavi ce gösterirntromere lekelenmesi. Ölçek çubukları 1 mm göstermektedir.

Telomer ve telomeraz yaşlanma ve tümör oluşumunda önemli roller oynar. Bu protokolün amacı, murin ile indüklenebilir iki telomeraz knock-in alelinin nasıl oluşturulacağını ve bunların doku dejenerasyonu/rejenerasyonu ve kanser çalışmalarında nasıl kullanılacağını göstermektir.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku dejenerasyonu ve rejenerasyonu ve kanser çalışmaları için in vivo ve in vitro olarak iki murin ile indüklenebilir mase vuruntu alelini manipüle etmektir. Bu, in vivo mase'yi yeniden etkinleştirmek için hidroksi tamoksifen tabletlerinin hayvanlara implante edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, nöral kök hücreler hayvanlardan izole edilir ve daha sonra in vitro mase'yi yeniden etkinleştirmek için hidroksi tamoksifen ile muamele edilir.Daha sonra, C'de telomer floresansı, iki hibridizasyon veya balık, mazın aktivitesini kontrol etmek için hem kültürlenmiş hücreler hem de formal ve sabit parafin gömülü beyin dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Sonuçlar, hidroksi tamoksifen tedavilerinin, hem yaşlanma fenotiplerini hafifletebilen hem de histopatolojik incelemeye dayalı olarak tümör oluşumunu teşvik edebilen mase aktivitesini sağlam bir şekilde yeniden aktive edebildiğini gösterdi. Bu yöntem, yaşlanma ve kanser alanlarında, TH travma aktivitesini modüle ederek yaşlanma sürecini yavaşlatıp yavaşlatamayacağımız veya kanseri tedavi etmek için Thomas'ı özel olarak nasıl hedefleyeceğimiz gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan eğitmen Dr.Takashi Shingu ve bir teknisyen April Un olacak. Bu prosedüre Turt ER'nin oluşturulmasıyla başlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi turt alellerini kilitleyin, enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin, metin protokolünde açıklandığı gibi fareleri uyuşturmaya devam edin. Derin anesteziye ulaşıldıktan sonra, anestezi uygulanmış hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve başını izo flor odasına bağlı tüpün içinde tutun.Hayvanın derin anestezi altında olduğundan emin olmak için farelerin ayak pedlerini sıkıştırın. Ayrıca her iki göze de merhem sürün Gözlerin dışarı çıkmasını önlemek için, farelerin arkasını povidon iyot çözeltisi ile silin. Daha sonra, sırt derisinin altına hassas bir trokar ile yavaş salınan bir hidroksi tamoksifen peleti enjekte edin.Ve peleti iki omuz arasındaki orta çizgiye kadar itin. İnsizyonu bir yara klipsi uygulayıcısı ile kapatın ve farelerin iyileşmesini izleyin. Anestezi için.Bir günlük fare beyinlerini çıkarın ve koku ampullerini ve beyinciği çıkararak dört beyni koruyun. Dört beyin dokusunu bir mililitre soğuk kültür ortamında tutun ve dört santigrat derecede saklayın. Nöral dokuyu bir saat içinde işlediğinizden emin olun.Sindirim başına 400 miligram sınırının aşılmadığından emin olmak için dokunun ağırlığını belirleyin. Beyni 35 milimetre çapında bir Petri kabının kapağına yerleştirin ve bir neşter kullanarak beyni ezin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, bir mililitre Hank'in denge tuzu çözeltisi veya HBSS ekleyin.Daha sonra, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de HBSS santrifüjü ile duruladıktan sonra parçaları 15 mililitrelik bir tüpe geri pipetleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim ekleyin. 400 miligrama kadar doku başına bir tane karıştırın.Numuneyi 15 mililitrelik tüpte 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tüpü her beş dakikada bir ters çevirerek veya sallayarak numuneyi karıştırın. Daha sonra 30 mikrolitre enzim hazırlayın 20 mikrolitre çözelti, üç ila 10 mikrolitre çözelti dört ekleyerek doku örneği başına iki tane karıştırın.Daha sonra numuneye ekleyin, karıştırmak için hafifçe ters çevirin, geniş uçlu, ateşle cilalanmış macun pipeti kullanarak dokuyu mekanik olarak ayırın, hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 kez karıştırın. 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve tüpü her üç dakikada bir ters çevirin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecine uygulayın.Hücre süzgecinden 10 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS uygulayın. Daha sonra hücre süzgecini atın ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben oda sıcaklığını ayarlayın, süpernatanı tamamen aspire edin.Kilitlerde tele diziyi etkinleştirmek, kilitleri durdurmak için daha sonraki uygulamalar için kök hücre ortamı ile hücreleri gerekli hacme yeniden askıya alın. Turt nöral kök hücreleri. Emaz ve diğer nöral kök hücreleri aktive etmek için hücreleri iki gün boyunca 100 mikromolar hidroksi tamoksifen ile tedavi edin.Telomer balığı gerçekleştirmek için hücreleri 100 mikromolar hidroksi tamoksifen ile kültür ortamında tutun. İlk olarak, formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülü veya FFPE doku bölümleri için kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozomlarını hazırlayın. Numuneyi ksilen içinde ayırın ve her biri beş dakika boyunca bir etanol serisinde ve beş dakika boyunca PBS'de rehidrat edin.Ardından, bölümleri bir ila iki saat boyunca üç ila bir oranında metanol / asetik asit şeklinde sabitleyin. Bölümleri soğuk bir etanol serisinde her biri beş dakika kurutun ve bir XPBS'de 37 santigrat derecede beş dakika havayla kurutun. Doğada bir sonraki adımda, kromozomlar iki dakika boyunca 37 santigrat derecede %4 formaldehittir.Soğuk bir etanol serisindeki bölümleri daha önce olduğu gibi kurutun ve kuruduktan sonra havayla kurutun, her slayta 12 ila 25 mikrolitre peptit nükleik asit hibridizasyon karışımı uygulayın. Kapak kızağını kauçuk çimento ile kapatın, doğa kromozomal preparatlarını ve doku bölümlerini dört dakika boyunca 80 santigrat derecede yerleştirin. Daha sonra nemli bir odada iki ila dört saat boyunca oda sıcaklığında veya 37 santigrat derecede hibridize edin.Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında iki kez 15 dakika yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında PBS ile beş dakika yıkayın ve 23 kez karıştırın. Son olarak, mikroskobik inceleme için slaytları DPI veya uzak kırmızı floresan ile boyayın.Telomer disfonksiyonel farelerde telomer geçici olarak yeniden aktive edildiğinde, dejeneratif fenotipler, telomer reaktivasyonunun hücreler üzerindeki etkisini belirlemek için beyin ve testisler gibi birçok organda iyileştirilebilir. Kültürlenmiş in vitro nöral kök hücreler, geç nesil G dört kilit durdurma kilidi, TURT ve G dört turt ER farelerinden izole edildi. Telomer disfonksiyonel nöral kök hücrelerinde telomer yeniden aktive edildiğinde, kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde artmıştır.Telomer disfonksiyonu bağlamında mase reaktivasyonunun tümör oluşumu üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro nörojenez de önemli ölçüde arttırıldı, bir prostat tümör modelinde tamoksifen tedavisi ile mase reaktivasyonu gerçekleştirildi. Endotik T hücreli lenfoma modeli. Tedavi, her iki modelde de büyük ölçüde artmış tümör oluşumu ile sonuçlandı.Son olarak telomer balığı FFPE, fare beyin dokuları ve metafaz kromozomları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu görüntülerde kırmızı, DNA yeşili telomer boyamasını ve camgöbeği sentromer boyamasını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, mTOR ER'de travma aktivitesini nasıl aktive edeceğinizi ve durdurma kilitlerini, mTOR hayvanlarını ve hücre hatlarını nasıl kilitleyeceğinizi ve bunları kanser ve ajan konusundaki sorularınızı incelemek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Bu protokol, kas veya cilt dokusundan miyojenik ve fibroblast hücre hatlarının canlı hücre izolasyonu ve birincil kültürü için teknikleri açıklar.  Bu hücre dizilerinin ölümsüzleştirilmesi için bir teknik de tarif edilmiştir.  Toplamda, bu protokoller, aşağı akış uygulamaları için hastadan türetilen hücreleri oluşturmak ve korumak için güvenilir bir araç sağlar.

Hastalık Modelleme için kas biyopsisi Hasta türetilmiş Hücre Hatları İzolasyonu ve Ölümsüzleştirme

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Biz bir roman somatik gen aktarım sistem RIP-etiket kullanmak göstermek için bir iletişim kuralı mevcut; RIP-tva metastaz genlerinde fonksiyonu çalışmaya fare modeli. Kuş Retrovirüsler gen transferi önceden Malign, invaziv olmayan lezyonlar yetişkin farelerde pankreas β hücrelerinin içine sağlamak için intracardiacally teslim edilir.

Kimlik ve metastatik faktörler gen transferi ile karakterizasyonu roman RIP-etiketinin içine; RIP-tva fare modeli

Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.

Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Neoplazi anlayışı için baş ve boyun kanseri hastalarında mutasyona uğramış spesifik genler ile murine modellerinin geliştirilmesi gereklidir. Burada, belirli genomik değişikliklerile murine HNC hücre hatları oluşturmak için adeno-ilişkili bir virüs-Cas9 sistemi kullanarak primer minür dil hücrelerinin in vitro dönüşümü için bir protokol salıyoruz.

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Bu makale, fare rahmine 1-3 dakika içinde %95 etanol enjekte ederek çok düşük mortalite oranı ve minimal intrauterin adezyonlara sahip güvenilir ve tekrarlanabilir bir ince endometriyum üretmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

İnce Endometriyumun Fare Modelinin Oluşturulması

Bu protokol, in vitro/in vivo fonksiyonel tahliller, transkriptomik ve hesaplamalı analiz dahil olmak üzere murin CAF'lerini kültürleme, manipüle etme ve analiz etme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, insan meme kanseri tümörlerinden oluşan bir koleksiyondan lazer yakalama mikro diseke stromal ve epitel bileşenlerinin halka açık transkriptomlarını analiz etmek için geliştirilen web tabanlı bir platformu tanımlar.

Moleküler ve Hesaplamalı Çalışmalar için Araçlar Olarak Fare Meme Tümörlerinden Kanserle İlişkili Fibroblastlar

Öğrenin, fare indüklenebilir telomeraz allellerini in vivo ve in vitro manipüle etme yöntemini. Doku dejenerasyonu, yenilenme ve kanser araştırmalarında yaşlanma fenotiplerini hafifletmek için bu protokolü kullanın.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Daha fazla video keşfet