Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doku dejenerasyonu ve rejenerasyonu ve kanser çalışmaları için in vivo ve in vitro olarak iki murin ile indüklenebilir mase vuruntu alelini manipüle etmektir. Bu, in vivo mase'yi yeniden etkinleştirmek için hidroksi tamoksifen tabletlerinin hayvanlara implante edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, nöral kök hücreler hayvanlardan izole edilir ve daha sonra in vitro mase'yi yeniden etkinleştirmek için hidroksi tamoksifen ile muamele edilir.

Daha sonra, C'de telomer floresansı, iki hibridizasyon veya balık, mazın aktivitesini kontrol etmek için hem kültürlenmiş hücreler hem de formal ve sabit parafin gömülü beyin dokuları üzerinde gerçekleştirilir. Sonuçlar, hidroksi tamoksifen tedavilerinin, hem yaşlanma fenotiplerini hafifletebilen hem de histopatolojik incelemeye dayalı olarak tümör oluşumunu teşvik edebilen mase aktivitesini sağlam bir şekilde yeniden aktive edebildiğini gösterdi. Bu yöntem, yaşlanma ve kanser alanlarında, TH travma aktivitesini modüle ederek yaşlanma sürecini yavaşlatıp yavaşlatamayacağımız veya kanseri tedavi etmek için Thomas'ı özel olarak nasıl hedefleyeceğimiz gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan eğitmen Dr.Takashi Shingu ve bir teknisyen April Un olacak. Bu prosedüre Turt ER'nin oluşturulmasıyla başlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi turt alellerini kilitleyin, enjeksiyondan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin, metin protokolünde açıklandığı gibi fareleri uyuşturmaya devam edin. Derin anesteziye ulaşıldıktan sonra, anestezi uygulanmış hayvanı indüksiyon odasından çıkarın ve başını izo flor odasına bağlı tüpün içinde tutun.

Hayvanın derin anestezi altında olduğundan emin olmak için farelerin ayak pedlerini sıkıştırın. Ayrıca her iki göze de merhem sürün Gözlerin dışarı çıkmasını önlemek için, farelerin arkasını povidon iyot çözeltisi ile silin. Daha sonra, sırt derisinin altına hassas bir trokar ile yavaş salınan bir hidroksi tamoksifen peleti enjekte edin.

Ve peleti iki omuz arasındaki orta çizgiye kadar itin. İnsizyonu bir yara klipsi uygulayıcısı ile kapatın ve farelerin iyileşmesini izleyin. Anestezi için.

Bir günlük fare beyinlerini çıkarın ve koku ampullerini ve beyinciği çıkararak dört beyni koruyun. Dört beyin dokusunu bir mililitre soğuk kültür ortamında tutun ve dört santigrat derecede saklayın. Nöral dokuyu bir saat içinde işlediğinizden emin olun.

Sindirim başına 400 miligram sınırının aşılmadığından emin olmak için dokunun ağırlığını belirleyin. Beyni 35 milimetre çapında bir Petri kabının kapağına yerleştirin ve bir neşter kullanarak beyni ezin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanarak, bir mililitre Hank'in denge tuzu çözeltisi veya HBSS ekleyin.

Daha sonra, oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de HBSS santrifüjü ile duruladıktan sonra parçaları 15 mililitrelik bir tüpe geri pipetleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, 1.950 mikrolitre önceden ısıtılmış enzim ekleyin. 400 miligrama kadar doku başına bir tane karıştırın.

Numuneyi 15 mililitrelik tüpte 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tüpü her beş dakikada bir ters çevirerek veya sallayarak numuneyi karıştırın. Daha sonra 30 mikrolitre enzim hazırlayın 20 mikrolitre çözelti, üç ila 10 mikrolitre çözelti dört ekleyerek doku örneği başına iki tane karıştırın.

Daha sonra numuneye ekleyin, karıştırmak için hafifçe ters çevirin, geniş uçlu, ateşle cilalanmış macun pipeti kullanarak dokuyu mekanik olarak ayırın, hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek 10 kez karıştırın. 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve tüpü her üç dakikada bir ters çevirin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikronluk bir hücre süzgecine uygulayın.

Hücre süzgecinden 10 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS uygulayın. Daha sonra hücre süzgecini atın ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben oda sıcaklığını ayarlayın, süpernatanı tamamen aspire edin.

Kilitlerde tele diziyi etkinleştirmek, kilitleri durdurmak için daha sonraki uygulamalar için kök hücre ortamı ile hücreleri gerekli hacme yeniden askıya alın. Turt nöral kök hücreleri. Emaz ve diğer nöral kök hücreleri aktive etmek için hücreleri iki gün boyunca 100 mikromolar hidroksi tamoksifen ile tedavi edin.

Telomer balığı gerçekleştirmek için hücreleri 100 mikromolar hidroksi tamoksifen ile kültür ortamında tutun. İlk olarak, formalin ile sabitlenmiş ve parafine gömülü veya FFPE doku bölümleri için kültürlenmiş hücrelerden metafaz kromozomlarını hazırlayın. Numuneyi ksilen içinde ayırın ve her biri beş dakika boyunca bir etanol serisinde ve beş dakika boyunca PBS'de rehidrat edin.

Ardından, bölümleri bir ila iki saat boyunca üç ila bir oranında metanol / asetik asit şeklinde sabitleyin. Bölümleri soğuk bir etanol serisinde her biri beş dakika kurutun ve bir XPBS'de 37 santigrat derecede beş dakika havayla kurutun. Doğada bir sonraki adımda, kromozomlar iki dakika boyunca 37 santigrat derecede %4 formaldehittir.

bir etanol serisindeki bölümleri daha önce olduğu gibi kurutun ve kuruduktan sonra havayla kurutun, her slayta 12 ila 25 mikrolitre peptit nükleik asit hibridizasyon karışımı uygulayın. Kapak kızağını kauçuk çimento ile kapatın, doğa kromozomal preparatlarını ve doku bölümlerini dört dakika boyunca 80 santigrat derecede yerleştirin. Daha sonra nemli bir odada iki ila dört saat boyunca oda sıcaklığında veya 37 santigrat derecede hibridize edin.

Daha sonra, numuneleri oda sıcaklığında iki kez 15 dakika yıkama tamponu ile yıkayın. Daha sonra oda sıcaklığında PBS ile beş dakika yıkayın ve 23 kez karıştırın. Son olarak, mikroskobik inceleme için slaytları DPI veya uzak kırmızı floresan ile boyayın.

Telomer disfonksiyonel farelerde telomer geçici olarak yeniden aktive edildiğinde, dejeneratif fenotipler, telomer reaktivasyonunun hücreler üzerindeki etkisini belirlemek için beyin ve testisler gibi birçok organda iyileştirilebilir. Kültürlenmiş in vitro nöral kök hücreler, geç nesil G dört kilit durdurma kilidi, TURT ve G dört turt ER farelerinden izole edildi. Telomer disfonksiyonel nöral kök hücrelerinde telomer yeniden aktive edildiğinde, kendini yenileme yeteneği büyük ölçüde artmıştır.

Telomer disfonksiyonu bağlamında mase reaktivasyonunun tümör oluşumu üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro nörojenez de önemli ölçüde arttırıldı, bir prostat tümör modelinde tamoksifen tedavisi ile mase reaktivasyonu gerçekleştirildi. Endotik T hücreli lenfoma modeli. Tedavi, her iki modelde de büyük ölçüde artmış tümör oluşumu ile sonuçlandı.

Son olarak telomer balığı FFPE, fare beyin dokuları ve metafaz kromozomları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu görüntülerde kırmızı, DNA yeşili telomer boyamasını ve camgöbeği sentromer boyamasını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, mTOR ER'de travma aktivitesini nasıl aktive edeceğinizi ve durdurma kilitlerini, mTOR hayvanlarını ve hücre hatlarını nasıl kilitleyeceğinizi ve bunları kanser ve ajan konusundaki sorularınızı incelemek için nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.