Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

Bu prosedürün genel amacı, servikal omuriliğin frenik motor nöronları tarafından diyaframın hem fonksiyonel hem de morfolojik innervasyonunu kantitatif olarak değerlendirmektir. Bu, ipsilateral frenik sinirin supra maksimal stimülasyonunu takiben anestezi uygulanmış hayvanlarda hemi diyaframından bileşik kas aksiyon potansiyeli kaydı yapılarak gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, bireysel nöromüsküler kavşakların innervasyonunu morfolojik olarak değerlendirmek için tüm mount diyafram immünohistokimyasını yapmaktır.

Sonuç olarak, bileşik kas aksiyon potansiyeli ve nöromüsküler kavşak analizlerinin birleştirilmesi, CNS ve PNS hastalığının kemirgen modellerinde diyafragma innervasyonunu kantitatif olarak incelemek için güçlü bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem, omurilik yaralanması alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin diyafram fonksiyonunu başarılı bir şekilde eski haline getirmek için terapötik müdahaleler kullanılabilir mi? Bu tekniğin etkileri, travmatik omurilik yaralanması ve ILS gibi hastalıkların tedavisine kadar uzanır, çünkü diyafragmatik solunum fonksiyonu, bu zayıflatıcı koşulların her ikisinde de hasta sonuçlarında önemli bir rol oynar, Prosedürü göstermek, laboratuvarımda doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr.Kali, Dr.Wright'ın laboratuvarında bir lisans öğrencisi olan Melanie Martin olacak. ve laboratuvarımda araştırma teknisyeni olan Tamara holla.

Hayvanı uyuşturduktan sonra, sırt tarafı aşağı bakacak şekilde cerrahi tahtaya yerleştirin ve ön ayakları tahtaya sabitleyin. Daha sonra ventral yüzeyi kafatasının tabanından orta hattın her iki tarafında karın bölgesine doğru tıraş edin. Cilt temizlendikten sonra, elektrotları yerleştirin, toprağı kuyruğa takın ve referans elektrodu deri altından karşı alt karın bölgesine yerleştirin.

Kayıt elektrodu, kendinden yapışkanlı kısım üzerinde iletken jel ile hazırlanmalı ve daha sonra tek taraflı kostal kenar boyunca tutturulmalıdır. Şimdi uyarıcı elektrotları, transkutanöz yarım santimetre aralıklı, trakeanın yanına ve klavikulanın üstüne yerleştirin. Cilde dik olarak girmeli ve yaklaşık bir santimetre derinliğe inmelidirler.

Bu elektrotlar iyi bir şekilde sabitlenmeli, en iyi şekilde elle yapılmalıdır. Tüm elektrotları uygun stimülatörlerine ve amplifikatörlerine bağlayın. Toplanan veriler bir bilgisayara kaydedilmelidir.

Analiz için, tek kutuplu stimülasyonun uyaran parametrelerini 0,5 milisaniyeye, bir hertz süper maksimum darbeye ayarlayın. Genlik altı ila sekiz volt arasında değişebilir. İlgi stimülasyon süresini 30 saniyeye ayarlayın ve istenirse her hayvandan haftada bir kez taban çizgisinden zirveye kadar genlik kaydını kullanarak ardışık 10 stimülasyondan elde edilen yanıtın ortalamasını alın.

Hayvanların idaresi metin protokolünde detaylandırılmıştır. Aşırı dozda enjekte edilebilir anestezi kullanarak bir hayvana ötenazi yaptıktan sonra, neşter veya makas kullanarak laparotomi yapın. Ksifoid süreçten orta hat boyunca coddly bir kesi yapın.

Daha sonra bir neşter ve forseps kullanarak, cildi ve bağ dokusunu kas sisteminden dikkatlice ayırın. Ksifoid işlemini yukarı çekerek ve diyaframı çevreleyen kemikten keserek diyaframı çıkarın. Diyafram kasına zarar vermemeye dikkat edin.

Diyaframın üst tarafını bir stereoskop altında PBS'de %4 paraform aldehit ile doldurulmuş bir silikon hat kabına aktarın. Diyaframı gergin bir şekilde gererek diyaframı çevreleyen dokuyu sabitleyin. Daha sonra forseps ve makas kullanarak bağ dokusunu üst yüzeyden çıkarın.

Sabitleyicinin 20 dakika çalışmasına izin verin ve ardından PBS'de 10 dakikalık üç yıkama kullanarak çıkarın. Daha sonra, 30 dakika boyunca PBS'de% 2 BSA ile 0.1 molar glisin uygulayın. Daha sonra diyaframı çubuk Domine konjuge alfa bungalov toin çözeltisinde 15 dakika inkübe edin.

Bungalov toksinini, fiksatif için yapıldığı gibi PBS ile yıkayın. Daha sonra, banyoyu soğuk metanol ile değiştirin ve dokuyu eksi 20 santigrat derecede beş dakika soğutun. Beş dakika sonra derhal metanolü çıkarın ve dokuyu daha önce olduğu gibi PBS ile yıkayın.

Şimdi, bir saat boyunca% 0.2 TBP çözeltisi kullanarak bir blok uygulayın. Çözeltiyi% 0.2 TBP'de birincil antikora değiştirin ve dokunun hafif çalkalama ile gece boyunca dört santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Ertesi gün, birincil antikoru çıkarmak için% 0.2 TBP'de 10 dakikalık üç yıkama kullanın ve daha sonra dokuyu ikincil antikor çözeltisinde bir saat boyunca sallanarak ve daha sonra karanlıkta inkübe edin, ikincil antikoru çıkarmak ve dokuyu karanlıkta tutmak için PBS'de üç yıkama kullanın.

Daha sonra bir stereoskop altında, kasın üst yüzeyinde daha fazla bağ dokusu çıkarın. Temizlendikten sonra, dokuyu dik bir epi floresan mikroskobu altında monte edin, monte edin ve görüntüleyin, lekeli hemi diyaframın morfolojisini kantitatif olarak analiz edin. 20 ve 40 x büyütme kullanın Çünkü diyafram bütün bir montaj olarak analiz edilir.

Floresan lekelenmenin çoğu odak dışındadır. Standart bir mikroskop kullanarak, analizi gerçek zamanlı olarak yapmak en iyisidir. Bireysel NM js'nin morfolojisini doğru bir şekilde puanlamak için, omuriliğin topografik innervasyon modellerine dayalı analiz için kası üç bölüme ayırın.

Ventral mosts bölgesinden başlayarak, kas lifleri boyunca tüm görünür njs'yi analiz edin, yüzeyden ilk üç ila dört liften daha derini analiz etmeyin, çünkü antikor penetrasyonu hiçbir zaman tamamlanmaz. Sağlam bir NMJ, kalın bir pre terminal aksona sahiptir ve sinir terminalinin tüm bölgeleri, altta yatan kas asetilkolin reseptörleri ile tamamen örtüşür. Kısmen sinirlenmemiş bir NMJ, altta yatan asetilkolin reseptörlerinin bazı bölgelerini boş tutacaktır.

Tamamen denerve edilmiş bir NMJ, sinir terminalindeki asetilkolin reseptörleri ile hiçbir yazışma göstermez. Bölgedeki diğer nj'ler başka bir morfoloji veya antikorların başarısını göstermelidir Birden fazla pre terminal akson bir NMJ'yi innerve ederse penetrasyon söz konusu olacaktır. NMJ çarpılır.

Bu durumda innerve denervasyon meydana gelmiş olabilir, bunu reinnervasyon takip eder. Sinir terminalinde altta yatan asetilkolin reseptörleri ile örtüşme varsa ve pre terminal akson çok inceyse, NMJ ince bir şekilde innerve edilir. Bu aynı zamanda bir reasyon göstergesidir.

Erişkin spra içeren bir deneyde, Dolly sıçan kontrollerine laminektomi uygulanırken, diğerlerine tek taraflı hemi kontüzyon SCI uygulandı. C dörtte. Beş hafta sonra, hemi diyafram ipsilateralinden laminektomi veya yaralanma bölgesine kadar pik cmap amplitüdü kaydedildi.

SCI sıçanlarında, mutasyona uğramış insanı eksprese eden sıçanları içeren farklı bir deneyde laminektomi kontrol sıçanlarına kıyasla önemli ölçüde azalmıştır, bu nedenle bir LS'nin modeli olarak hizmet etmek için bir proteini D'ye sahiptir. Hemi diyaframındaki NMJ morfolojisi, vahşi tip kontrol hayvanlarında tamamen sağlamdı. Bununla birlikte, transgenik sıçanlarda, njs önemli patoloji gösterdi. Bazıları ok ucu ile işaretlenmiş tam denervasyon gösterdi.

Diğer nj'ler, ok ucu ile işaretlendiği gibi kısmen denerve edildi ve sağdaki NMJ'de görüldüğü gibi, diğer nj'ler çok sayıda innerve edildi ve diğerlerinde burada bir ok başı ile işaretlenmiş ince pre terminal aksonlar vardı. Bu videoyu izledikten sonra, diyaframın frenik motor nöronlar tarafından hem fonksiyonel hem de morfolojik innervasyonunu kantitatif olarak nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve tüm deneylerinizde iyi şanslar.