CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilerleyen karaciğer inflamatuar hastalığında lökositlerin migrasyonunu ve etkileşimini takip etmektir. Bu hücrelerin karaciğer dokusuna nasıl çekildiğinin altında yatan olaylar dizisini ve immunopatolojideki potansiyel rollerini daha iyi anlamak hedeflenmektedir. Bu işlem, öncelikle hayvanın uzun süreli sağkalımını sağlamak için kritik bir adım olan ve farenin solunumunun kontrol altına alınmasını sağlayan bir trakeotomi gerçekleştirilerek sağlanır.

İkinci adım olarak, çok fotonlu mikroskopla organa erişim sağlamak için karaciğeri cerrahi olarak açığa çıkarmak amacıyla fareye laparotomi uygulanır. Ardından, hareket artefaktlarını en aza indirmek için karaciğer, bir rozet içerisine gömülerek sabitlenir ve konumlandırılır. Birkaç saat boyunca gerçekleştirilebilen görüntüleme işlemi; bireysel lökositlerin göçü, konumlanması ve etkileşimindeki değişiklikleri takip eden yüksek çözünürlüklü, zaman ayarlı dizilerin elde edilmesini sağlar.

Karaciğer inflamasyonunun gelişme sürecinde bu yöntem; lökosit göçü, hücre-hücre etkileşimleri veya immunopatoloji mekanizmaları gibi akut ve kronik karaciğer inflamasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin konvansiyonel mikroskopiye göre temel avantajı, uzak kırmızı lazer ışığının benzersiz fiziği sayesinde, çok odaklı mikroskobinin düşük odak ağartması veya fototoksisite ile numuneye neredeyse hiç müdahale etmeden uzun süreli görüntüleme sağlamasının yanı sıra dokunun 100 µm derinliğine kadar optik kesitler alabilmesidir. Sonuç olarak, bu yöntem karaciğer hastalıklarına dair derinlemesine bilgi sağlayabilir.

Diğer sistemlere kolayca uyarlanabilir. Stabilizasyon ve fiksasyon yöntemi sayesinde, doku hemen hemen tüm intravital mikroskopi sorularına uygulanabilir; böylece akışkanla ilişkili hücreler kullanılarak dalak, böbrek veya hatta deri altı tümörleri gibi organlar kolayca görüntüleyebilir. Ayrıca tüm lökosit alt kümelerini görselleştirmek ve bunların etkileşimlerini ve karaciğer inflamasyonunu izlemek de mümkündür.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler küçük hayvan cerrahisinin aşırı karmaşıklığı nedeniyle zorluk yaşayacaktır. Ancak, kendi deneyimlerimize göre bu durum yalnızca birkaç hafta için kısıtlayıcı bir faktördür ve sadece biraz pratik rutin gerektirir. Karaciğer dokusunun hassasiyeti nedeniyle hazırlık aşamalarının öğrenilmesi zordur ve yöntemin görsel olarak gösterilmesi temel bir gerekliliktir. Anestetikler hazırlandıktan sonra, fare sahnesini 40 derecelik bir açıyla dökerek %3'lük aos ile doldurun.

Ardından, cerrahi çalışma alanının yanıca gerekli tüm aletlerin ve diğer ekipmanların tamamen dezenfekte edildiğinden emin olun. Daha sonra, fareyi intraperitonal bir anestezik kokteyl enjeksiyonu ile anestezi altına alın. Beş dakika sonra hayvanın reflekslerini kontrol edin ve ardından cildi dezenfekte edip gözlere oftalmik pomad uygulayın.

Şimdi, fareyi hazırlık masasına sabitleyin. Bant kullanarak, boynu hafifçe gererek ventral tarafı açığa çıkaracak şekilde konumlandırın. Kesici dişlere takılan bir paket lastiği ile bu işlem gerçekleştirilebilir.

Şimdi, çenenin altına yaklaşık 0,5 ile 1 cm uzunluğunda ilk kesiyi yapın. Ardından, tükürük bezleri arasındaki bağ dokusunu dikkatlice diseke edin ve trakeayı çevreleyen kas tüpünü bulun. Trakeayı açığa çıkarmak için kası nazikçe yırtın.

Trakeanın altına bir ip çekin, ardından T şeklinde bir insizyon yaparak trakeayı mikro makasla açın. Ventilasyon tüpünü yaklaşık yarım santimetre kadar yerleştirin. Tüpü küçük anatomik pensler kullanarak ilerletin.

Ardından tüpü sütürlerle sabitleyin. Daha fazla güvenlik sağlamak için tüpü cilde sütüre edin, ciltteki insizyonu siyanoakrilat kullanarak kapatın ve tüpü hayvanın başına sabitleyin. Yapışkan bant kullanarak, %2 izofluranın sürekli akışıyla anesteziyi sürdürün.

Fare cerrahiye hazırlandıktan sonra, sternumun altına küçük bir cilt insizyonu yapın ve kesiyi her iki yanda kaburgaların altına doğru lateral olarak genişletin. Bu işlem sırasında açığa çıkan tüm kan damarlarını koterize edin. Kanamayı en aza indirmek için, abdominal kaviteye erişim sağlamak amacıyla linea alba bölgesinde küçük bir başlangıç kesisi yapın.

Kesiş boyunca yatay olarak genişleterek tüm kan damarlarını mühürleyin ve karaciğere erişim sağlayın. Şimdi, fareyi agro sahnesine aktarın ve hayvanın sabit durmasına yardımcı olmak için her iki yanına lamlar dizin. Bu lam yığınları farenin yüksekliğiyle uyumlu olmalıdır, böylece daha sonra yerleştirilecek olan karaciğer sahnesi abdomen üzerine aşırı basınç uygulamaz.

Şimdi, sternumdaki sütürleri kullanarak kaburgaları geri çekin. 4-0 sütür yeterli olacaktır. Kaburgaları geri çektikten sonra, karaciğeri ve diyaframı birbirine bağlayan ligamentleri aortaya kadar kesin ancak damarı yırtmamaya veya kesmemeye ekstra özen gösterin. Ayrıca karaciğeri ve gastrointestinal sistemi birbirine bağlayan ligamenti de kesin.

Daha büyük olan karaciğer lobuna erişimi kolaylaştırmak için fareyi 45 derece döndürün. Standart bir lamel alın ve kenarlarının keskin olmaması için kenarlarına bant yapıştırın. Bunu abdominal boşluğun üzerine yerleştirin.

Bu, karaciğerin üzerine yerleştirileceği bir platform görevi görecektir. Çift uçlu küresel bir stylus probunu veya yumuşak uçlu bir spatulayı dikkatlice karaciğerin altına kaydırın ve organın üst kısmından tutun. Nemli bir doku kullanıldığında, mekanik basınç karaciğer dokusunda anında lezyona yol açacaktır, bu nedenle organın dikkatle taşınması esastır.

Ardından lobu lam üzerine kaldırın ve nazikçe çekerek konumlandırın. Lob genellikle bükülmüş veya katlanmış durumda kalacaktır; ince bir spatula veya nemli bir doku yardımıyla dokuyu kaldırarak kenarları nazikçe açmaya çalışın. Daha sonra, lamel veya lamlar şeklinde yan destekler ekleyin.

Lamelleri karaciğer lobu ile aynı yüksekliğe gelecek şekilde üst üste dizin. Karaciğerin konumlandırılması ve fikse edilmesi, protokoldeki en kritik adımdır. Her türlü mekanik stres, torsiyon veya basınç; anında doku hasarına veya en azından sinüzoidal damarlarda kan akışının bozulmasına yol açacaktır.

Şimdi, kenarları bantlanmış büyük bir kapatma camını, yan desteklerle sabitlenmiş karaciğer lobunun üzerine yerleştirin. Bu kapatma camını mümkün olduğunca düz bir şekilde konumlandırın. Karaciğeri sıkıştırmamalıdır.

Görüntüleme işlemi hızlıca tamamlanmayacaksa, beyaz doku bozulmuş kan akışına işaret eder. Uzun süreli anestezi sağlamak ve G beş uygulamak için iki bağımsız intraperitoneal kateter yerleştirmek gerekir. Bunlar, 27 gauge iğneler ve esnek silikon borulardan monte edilir.

Ardından şırınga pompalarını kullanarak akışlarını başlatın. Kateterleri arka ekstremitelerin yakınındaki alt karın bölgesine yerleştirin. Fareye yaşamsal bulgu monitörlerini bağladıktan sonra, bir XPBS içerisinde 100 mililitre %3 aros hazırlayın.

Aros 41 °C'ye soğuduğunda, 18 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğeri içine gömün. Aeros soğuduktan sonra, fazlalıkları temizlemek ve karaciğeri tarayacak kadar geniş bir görüş alanı oluşturmak için bir heideman spatülü kullanın. Ardından tarama işlemine geçin.

Görüş alanı hazırlandıktan sonra, zaman ayarlı görüntüleme için uygun tarama alanlarını seçmek amacıyla fareyi mikroskobun altına yerleştirin. Karaciğer dokusu, yeterli kan akışına sahip ve örnek perturbasyonunun minimum olduğu temsili alanlar belirlenerek harici bir beyaz ışık kaynağı kullanılarak gözle taranır. Deney kapsamında, CXCR6-GFP heterozigot farelere intravital TPLSM görüntüleme uygulanmıştır. Bazı farelere, akut karaciğer hasarı oluşturmak için intraperitonal tetraklorür enjeksiyonu yapılmıştır.

GFP eksprese eden modal hücreler video ile takip edildi ve hücresel mobiliteye dair bir anlık görüntü elde etmek için izleri üst üste bindirildi. Ardından izler normalize edildi. Normal karaciğerlerde hücrelerin rastgele migrasyon modelleri sergilediği görüldü.

CCI four enjekte edilen karaciğerlerde hücresel migrasyonda bozulma görülmüştür. Başlangıç noktalarından itibaren toplam yer değiştirme ölçüldüğünde, CCI four uygulamasından 36 saat sonra hepatosellüler hasar bölgesinde hücre hapsinin olduğu açıkça görülmüştür. Karaciğer hasarına bağlı migrasyon bozukluğu, tekil hücrelerin zaman içindeki migrasyon hızı grafiğe dökülerek de gösterilebilir; bu grafikte 18 saatten sonra kısmi bir durma ve 36 saat sonra tam migrasyonel durma gözlemlenmiştir.

Göç eden hücrelerin hızındaki azalmanın, hücreler popülasyon olarak karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı olduğu da gösterilmiştir. Bu nedenle, bu yaklaşım gelişen karaciğer hastalığında hücre göçü ve konumlanmasındaki değişikliklerin takibi için uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, bir farenin karaciğerinin intravital çok foton mikroskobisi için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Burada sunduğumuz yöntem, sunduğumuz nazik fiksasyon tekniği sayesinde hareket artefaktlarını minimize etmemize ve hayvanın uzun süreli hayatta kalması için stabilize edilmesine olanak tanır. Maskeleme işleminden sonra, doğru şekilde uygulandığında bu teknik yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür sırasında hayvanların vücut sıcaklığı, kalp atış hızı, oksijen ve CO2 seviyeleri gibi hayati parametrelerinin kontrol edilmesi önemlidir. Bu, nekroz derinliğinin ve solunumun ayarlanmasıyla sağlanabilir. Bu tekniği takiben.

İnfiltre olan bağışıklık hücrelerinin fenotipi veya gelişim sonrası doku veya infiltre olan hücreler tarafından salgılanan mediyatörler gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi analizi veya lazer yakalama mikrodisseksiyonu gibi diğer prosedürler uygulanabilir. Bu teknikler, araştırmacıların karaciğerdeki lökosit trafiğinin dinamikleri ve hücresel etkileşimler hakkında bilgi edinmelerini sağlayarak enflamatuar karaciğer hastalıklarına yol açan olaylar dizisinin çözümlenmesine imkan tanımıştır. Çok foton mikroskobisi için kullanılan yüksek enerjili darbeli bir kızılötesi lazer ile görüntüleme yaparken lütfen lazer güvenlik kılavuzlarına uyunuz.

Bu deneyi gerçekleştirirken, lazer radyasyonunun hiçbir yansımasının gözlerinize ve cildinize zarar vermediğinden emin olun.