CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilerleyen karaciğer inflamatuar hastalığında lökositlerin göçünü ve etkileşimini takip etmektir. Bu hücrelerin karaciğer dokusuna nasıl alındığının altında yatan olayların sırasını ve immünopatolojiye potansiyel katılımlarını daha iyi anlamak. Bu, önce farenin solunumu üzerinde kontrol sahibi olmak için bir trakeotomi yapılarak elde edilir, bu da hayvanın uzun süreli hayatta kalmasını sağlamak için çok önemli bir adımdır.

İkinci adım olarak, fare, karaciğeri cerrahi olarak açığa çıkarmak için laparotomidir ve çoklu foton mikroskobu ile organa erişim sağlar. Daha sonra, hareket artefaktlarını en aza indirmek için karaciğer sabitlenir ve ortaya çıkarılarak konumlandırılır. Görüntüleme, birkaç saat boyunca gerçekleştirilebilir ve bu da bireysel lökositlerin alımı, konumlandırılması ve etkileşimindeki değişiklikleri takip eden yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış sekanslara yol açar.

Karaciğer iltihabı geliştirme sürecinde, Bu yöntem, lökosit alımı, hücre hücresi etkileşimleri veya immünopatoloji mekanizmaları gibi akut ve kronik karaciğer iltihabı alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin konvansiyonel mikroskopiye kıyasla ana avantajı, multifokal mikroskopinin, düşük tay ağartma veya fototoksisite ile neredeyse hiç numune pertürbasyonu olmadan uzun süreli görüntülemeye ve ayrıca dokunun derinliklerine 100 mikrometreye kadar optik dilimlere izin vermesidir ve bu, uzak kırmızı lazer ışığının lazerinin benzersiz fiziğinden kaynaklanmaktadır. Bu yöntem karaciğer hastalığı hakkında fikir verebilir.

Diğer sistemlere kolayca adapte edilebilir. Stabilizasyon ve sabitleme yöntemi olduğundan, doku intravital mikroskopinin hemen hemen tüm sorularına uygulanabilir, böylece dalak, böbrek ve hatta deri altı tümörleri gibi organları akıcı ilgili hücreler kullanarak kolayca görüntüleyebilir. Tüm lökosit alt kümelerini görselleştirmek ve etkileşimlerini ve karaciğer iltihabını göndermek de mümkündür.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, küçük hayvan cerrahisinin aşırı karmaşıklığı nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, kendi deneyimlerimiz nedeniyle, bu sadece birkaç hafta için sınırlayıcı bir faktördür ve sadece rutin olarak biraz el becerisi gerektirir Karaciğer dokusunun kırılganlığı nedeniyle, hazırlık adımlarının öğrenilmesi zordur ve yöntemin görsel olarak gösterilmesi esastır. Anestezikleri ayarladıktan sonra, fare aro aşamasını %3 aros ile doldurun ve 40 derecelik bir açıyla dökün.

Ardından, gerekli tüm aletler vb. gibi cerrahi çalışma alanının da tamamen dezenfekte edildiğinden emin olun. Daha sonra fareyi anestezik bir kokteylin intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Beş dakika sonra, hayvanın reflekslerini kontrol edin ve ardından cildi dezenfekte edin ve gözlere oftalmik merhem sürün.

Şimdi, fareyi hazırlık masasına sabitleyin. Bant kullanarak, boynu hafifçe gererek ventral tarafı ortaya çıkaracak şekilde konumlandırın. Kesici dişlere takılan bir lastik bant bunu başarabilir.

Şimdi, ilk kesiyi çenenin altında yaklaşık 0,5 ila bir santimetre uzunluğunda gerçekleştirin. Daha sonra tükürük bezleri arasındaki bağ dokusunu dikkatlice inceleyin ve trakeayı çevreleyen kas tüpünü bulun. Trakeayı ortaya çıkarmak için kasları nazikçe yırtın.

Soluk borusunun altına bir iplik çekin, ardından kesi içine T şeklinde bir kesi kullanarak trakeayı mikro makasla açın. Havalandırma tüpünü yaklaşık yarım santimetre yerleştirin. Küçük anatomik forsepsler kullanarak tüpü ilerletin.

Ardından tüpü dikişlerle sabitleyin. Daha sonra daha fazla güvenlik için, tüpü cilde dikin, derideki kesiği siyanoakrilat kullanarak kapatın ve tüpü hayvanın kafasına sabitleyin. Yapışkan bant kullanarak, sürekli %2 iso flor akışı kullanarak anesteziyi koruyun.

Fareyi ameliyata hazırladıktan sonra, sternumun altında küçük bir cilt kesisi yapın ve kesiği her iki taraftaki kaburgaların altında yanal olarak uzatın. Bu süreçte açıkta kalan tüm kan damarlarını koterize edin. Kanamayı en aza indirmek için, karın boşluğuna erişmek için doğrusal dirsekte küçük bir ilk kesim yapın.

Kesimi yatay olarak uzatın, tüm kan damarlarını kapatın ve karaciğere erişim sağlayın. Şimdi, fareyi tarım aşamasına aktarın ve yerinde kalmasına yardımcı olmak için hayvanın her iki tarafına slaytlar koyun. Bu yığınlar farenin yüksekliğine uygun olmalıdır, böylece daha sonra yerleştirilecek olan karaciğer sahnesi karın üzerine aşırı baskı uygulamaz.

Şimdi, sternumdaki dikişleri kullanarak, kaburgaları geri çekin. Dört sıfır dikiş yeterli olacaktır Kaburgaları geri çektikten sonra, karaciğeri ve diyaframı birbirine bağlayan bağları aorta kadar kesin, ancak damarı yırtmamak veya kesmemek için ekstra dikkatli olun. Ayrıca karaciğer ve GI yolunu birbirine bağlayan bağı da kesin.

Daha büyük karaciğer lobuna erişimi iyileştirmek için fareyi 45 derece çevirin. Standart bir kapak fişi alın ve keskin olmaması için kenarları boyunca bantlayın. Karın boşluğunun üzerine yerleştirin.

Bu, karaciğerin karaciğeri sahneye yerleştirmesi için bir aşama görevi görecektir. Karaciğerin altına çift bilyeli bir prob ucu probu veya yastıklı bir spatula dikkatlice kaydırın ve organın üst kısmını tutun. Nemli bir doku mekaniği kullanarak, basınç karaciğer dokusunu anında lezyona uğratır, bu nedenle organı dikkatli bir şekilde kullanmak önemlidir.

Ardından lobu sürgünün üzerine kaldırın ve yavaşça çekerek yerine oturtun. Lob genellikle hafifçe bükülür veya katlanır, dokuyu ince bir spatula veya nemli bir doku ile kaldırarak kenarları açmaya çalışın. Ardından, kapak kızakları veya slaytlar şeklinde yanal destekler ekleyin.

Kapak fişlerini karaciğer lobu ile aynı yükseklikte olacak şekilde istifleyin. Karaciğerin evrelemesi ve fiksasyonu protokoldeki en önemli adımdır. Herhangi bir mekanik stres, burulma veya basınç, sinüzoidal damarlarda anında doku hasarına veya en azından kan akışının bozulmasına yol açacaktır.

Şimdi, yanal destekler tarafından desteklenen karaciğer lobunun üzerine bantlanmış kenarları olan büyük bir örtü astarı koyun. Bu kapak kızağını mümkün olduğunca düz bir şekilde konumlandırın. Karaciğeri sıkmamalıdır.

Beyaz doku, görüntüleme hızlı bir şekilde ilerlemedikçe kan akışının bozulduğunu gösterir. Artık uzun süreli anestezi sağlamak için iki bağımsız intraperitoneal kateter yerleştirmek ve G beş uygulamak gerekir. Bunlar 27 gauge iğne ve esnek silikon borudan monte edilmiştir.

Ardından şırınga pompalarını kullanarak akışlarına başlayın. Kateterleri arka bacakların yakınındaki alt karın bölgesine yerleştirin. Hayati monitörleri fareye taktıktan sonra, bir XPBS'de 100 mililitre% 3 aros hazırlayın.

Aros 41 santigrat dereceye soğuduğunda, 18 gauge iğne ile beş mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğeri içine gömün. Aeros soğuduktan sonra, fazlalığı gidermek ve karaciğeri taramak için yeterince büyük bir görüş alanını ortaya çıkarmak için bir heideman spatula kullanın. Ardından taramaya devam edin.

Görüş alanı hazırlandıktan sonra, zaman atlamalı görüntüleme için uygun tarama alanlarını seçmek üzere fareyi mikroskop altında hareket ettirin. Karaciğer dokusu, yeterli kan akışı ve minimum numune pertürbasyonu olan temsili alanları tanımlayan harici bir beyaz ışık kaynağı kullanılarak gözle taranır: CXCR, altı GFP heterozigot fare, bir deney olarak intravital T-P-L-S-M görüntülemeye tabi tutuldu. Bazılarına akut karaciğer hasarını indüklemek için intraperitoneal tetraklorür enjeksiyonu verildi.

GFP'yi ifade eden modal hücreler video ile izlendi ve hücresel hareketliliğin anlık görüntüsünü elde etmek için izleri üst üste bindirildi. Parçalar daha sonra normalleştirildi. Normal karaciğerlerde rastgele göç modellerine sahip hücreler vardı.

CCI dört ile enjekte edilen karaciğerler, hücresel göçte bir bozulma gösterdi. Kökenlerinden toplam yer değiştirme ölçüldüğünde, hepatosellüler hasar bölgesinde CCI dört tedavisinden 36 saat sonra hücre sıkışması olduğu açıktı. Karaciğer hasarının neden olduğu bozulmuş göç, zaman içinde tek tek hücrelerin göç hızının çizilmesiyle, 18 saat sonra kısmi bir arrest ve 36 saat sonra tam göç durması gösterilerek de gösterilebilir.

Göç eden hücrelerin hızındaki azalmanın, hücreler popülasyonlar olarak karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı olduğu da gösterilebilir. Bu nedenle, bu yaklaşım, gelişmekte olan karaciğer hastalığında hücre göçü ve konumlandırmadaki değişiklikleri izlemek için uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, bir farenin karaciğerini intra vital çoklu foto mikroskopi için nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

Burada sunduğumuz yöntem, hayvanı uzun süreli hayatta kalma için stabilize etmemize ve sağladığımız nazik fiksasyon yöntemi sayesinde hareket artefaktlarını en aza indirmemize olanak tanır. Maskelendikten sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık bir saat içinde yapılabilir Bu prosedür sırasında, hayvanların sıcaklık, kalp atış hızı, oksijen ve CO2 seviyelerini stabilize eden hayati parametrelerini kontrol etmek önemlidir. Bu, nekrozun derinliğini ve solunumu uyarlayarak başarılabilir.

Doku veya infiltrasyon sonrası hücreler tarafından salgılanan infiltre eden bağışıklık hücrelerinin veya mediatörlerin fenotipi gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi analizi veya lazer yakalama mikro diseksiyonu gibi diğer prosedürler uygulanabilir. Bu teknikler, araştırmacıların karaciğerdeki lökosit trafiğinin ve hücresel etkileşimlerin dinamikleri hakkında fikir edinmelerini sağlayarak, enflamatuar karaciğer hastalıklarına yol açan olayların sırasını incelemeye izin verdi. Lütfen çoklu foto mikroskopi için kullanılan yüksek enerjili darbeli kızılötesi lazer ile görüntüleme yaparak lazer güvenlik yönergelerine uyun.

Bu deneyi gerçekleştirirken lazer radyasyonunun hiçbir yansımasının gözleriniz ve cildiniz için tehlike oluşturmayacağından emin olun.