Name: İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin, HIV-1 suşlarının göreli replikasyon fitness'ını ikili büyüme rekabet analizi ile nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, viral klon oluşturma ve qPCR kullanarak hassas ölçümler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar, ABD Halk Sağlığı Hizmetleri hibeleri P01AI057005, R01AI047734, R01AI111806 ve Washington Üniversitesi AIDS Araştırma Merkezi'nin İşlevsel Profilleme ve Hesaplamalı Biyoloji Çekirdeği (P30 AI027757) tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Domingo, E., Holland, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+virus+mutations+and+fitness+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RNA virus mutations and fitness for survival.</a> Annu Rev Microbiol. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+viral+emergence%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of viral emergence.</a> Veterinary research. 41 (6), 38(2010).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Martinez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+resistance+mutations+and+fitness%3A+a+view+from+the+clinic+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reverse transcriptase inhibitor resistance mutations and fitness: a view from the clinic and ex vivo.</a> Virus Res. 134 (1-2), 104-123 (2008).</li>
<li>Troyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+fitness+impact+of+HIV-1+escape+mutations+to+cytotoxic+T+lymphocyte+%28CTL%29+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Variable fitness impact of HIV-1 escape mutations to cytotoxic T lymphocyte (CTL) response.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000365(2009).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-acid+co-variation+in+HIV-1+Gag+subtype+C%3A+HLA-mediated+selection+pressure+and+compensatory+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amino-acid co-variation in HIV-1 Gag subtype C: HLA-mediated selection pressure and compensatory dynamics.</a> PLoS One. 5 (9), e12463(2010).</li>
<li>Abraha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR5-+and+CXCR4-tropic+subtype+C+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+have+a+lower+level+of+pathogenic+fitness+than+other+dominant+group+M+subtypes%3A+implications+for+the+epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CCR5- and CXCR4-tropic subtype C human immunodeficiency virus type 1 isolates have a lower level of pathogenic fitness than other dominant group M subtypes: implications for the epidemic.</a> J Virol. 83 (11), 5592-5605 (2009).</li>
<li>Quinones-Mateu, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+infection%2Fcompetition+assay+shows+a+correlation+between+ex+vivo+human+immunodeficiency+virus+type+1+fitness+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dual infection/competition assay shows a correlation between ex vivo human immunodeficiency virus type 1 fitness and disease progression.</a> J Virol. 74 (19), 9222-9233 (2000).</li>
<li>Ball, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+ex+vivo+fitness+of+CCR5-tropic+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+of+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22B+and+C.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparing the ex vivo fitness of CCR5-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolates of subtypes.</a> B and C. J Virol. 77 (2), 1021-1038 (2003).</li>
<li>Lanxon-Cookson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+relative+fitness+measurements+in+pairwise+competition+assays+of+human+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Factors affecting relative fitness measurements in pairwise competition assays of human immunodeficiency viruses.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 7-13 (2013).</li>
<li>Garcia-Lerma, J. G., MacInnes, H., Bennett, D., Weinstock, H., Heneine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitted+human+immunodeficiency+virus+type+1+carrying+the+D67N+or+K219Q%2FE+mutation+evolves+rapidly+to+zidovudine+resistance+in+vitro+and+shows+a+high+replicative+fitness+in+the+presence+of+zidovudine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transmitted human immunodeficiency virus type 1 carrying the D67N or K219Q/E mutation evolves rapidly to zidovudine resistance in vitro and shows a high replicative fitness in the presence of zidovudine.</a> J Virol. 78 (14), 7545-7552 (2004).</li>
<li>Sharma, P. L., Crumpacker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+replication+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+with+a+didanosine-selected+reverse+transcriptase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuated replication of human immunodeficiency virus type 1 with a didanosine-selected reverse transcriptase mutation.</a> J Virol. 71 (11), 8846-8851 (1997).</li>
<li>Martinez-Picado, J., Savara, A. V., Sutton, L., D'Aquila, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+fitness+of+protease+inhibitor-resistant+mutants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replicative fitness of protease inhibitor-resistant mutants of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 73 (5), 3744-3752 (1999).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+reverse+transcriptase+mutants+G190S+and+G190A%2C+which+confer+resistance+to+non-nucleoside+reverse+transcriptase+inhibitors%2C+demonstrate+reductions+in+RNase+H+activity+and+DNA+synthesis+from+tRNA%28Lys%2C+3%29+that+correlate+with+reductions+in+replication+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 reverse transcriptase mutants G190S and G190A, which confer resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors, demonstrate reductions in RNase H activity and DNA synthesis from tRNA(Lys, 3) that correlate with reductions in replication efficiency.</a> Virology. 348 (2), 462-474 (2006).</li>
<li>Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+escape+mutations+on+HIV-1+fitness+in+the+context+of+the+cognate+transmitted%2Ffounder+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Impact of immune escape mutations on HIV-1 fitness in the context of the cognate transmitted/founder genome.</a> Retrovirology. 9 (89), (2012).</li>
<li>Ali, A., Yang, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+reporter+gene+and+HIV-1+fitness+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel small reporter gene and HIV-1 fitness assay.</a> Journal of Virological Methods. 133 (1), 41-47 (2006).</li>
<li>Maarseveen, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real-time+PCR+assay+to+determine+relative+replication+capacity+for+HIV-1+protease+variants+and%2For+reverse+transcriptase+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel real-time PCR assay to determine relative replication capacity for HIV-1 protease variants and/or reverse transcriptase variants.</a> J Virol Methods. 133 (2), 185-194 (2006).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cytotoxic+T-lymphocyte+epitopes%3A+fitness-balanced+escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Evolution of human immunodeficiency virus type 1 cytotoxic T-lymphocyte epitopes: fitness-balanced escape.</a> J Virol. 81 (22), 12179-12188 (2007).</li>
<li>Anastassopoulou, C. G., Ketas, T. J., Klasse, P. J., Moore, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+CCR5+inhibitors+caused+by+sequence+changes+in+the+fusion+peptide+of+HIV-1+gp41%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resistance to CCR5 inhibitors caused by sequence changes in the fusion peptide of HIV-1 gp41.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (13), 5318-5323 (2009).</li>
<li>Abraha, A., Troyer, R. M., Quinones-Mateu, M. E., Arts, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+HIV-1+ex+vivo+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods to determine HIV-1 ex vivo fitness.</a> Methods Mol Biol. 304, 355-368 (2005).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+real-time+PCR+based+assay+to+estimate+the+impact+of+amino+acid+substitutions+on+the+competitive+replication+fitness+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive real-time PCR based assay to estimate the impact of amino acid substitutions on the competitive replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 in cell culture.</a> J Virol Methods. 189 (1), 157-166 (2013).</li>
<li>Brumme, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+replication+capacity+of+NL4-3+recombinant+viruses+encoding+reverse+transcriptase-integrase+sequences+from+HIV-1+elite+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Reduced replication capacity of NL4-3 recombinant viruses encoding reverse transcriptase-integrase sequences from HIV-1 elite controllers.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 56 (2), 100-108 (2011).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+reductions+in+Gag-protease-mediated+HIV-1+replication+capacity+during+the+course+of+the+epidemic+in%5BTitle%5D)+AND+%22Japan.+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Significant reductions in Gag-protease-mediated HIV-1 replication capacity during the course of the epidemic in.</a> Japan. J Virol. 87 (3), 1465-1476 (2013).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+conserved-element+vaccines%3A+relationship+between+sequence+conservation+and+replicative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 conserved-element vaccines: relationship between sequence conservation and replicative capacity.</a> J Virol. 87 (10), 5461-5467 (2013).</li>
<li>Martinez-Picado, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+escape+mutations+in+p24+Gag+in+association+with+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of escape mutations in p24 Gag in association with control of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 80 (7), 3617-3623 (2006).</li>
<li>Brockman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+and+Compensation+from+Early+HLA-B57-Mediated+Cytotoxic+T-Lymphocyte+Pressure+on+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Gag+Alter+Capsid+Interactions+with+Cyclophilin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Escape and Compensation from Early HLA-B57-Mediated Cytotoxic T-Lymphocyte Pressure on Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Alter Capsid Interactions with Cyclophilin A.</a> J Virol. 81 (22), 12608-12618 (2007).</li>
<li>Miura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-associated+alterations+in+replication+capacity+of+chimeric+NL4-3+viruses+carrying+gag-protease+from+elite+controllers+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA-associated alterations in replication capacity of chimeric NL4-3 viruses carrying gag-protease from elite controllers of human immunodeficiency virus type 1.</a> J Virol. 83 (1), 140-149 (2009).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, PCR: The Polymerase Chain Reaction. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">http://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction</a> (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. 62 (Apr 20), (2012).</li>
<li>Basic Methods in Cellular and Molecular Biology, Restriction Enzyme Digests. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests">http://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests</a> (2014).</li>
<li>McClure, J., van't Wout, A. B., Tran, T., Mittler, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+colony-stimulating+factor+upregulates+HIV-1+replication+in+monocyte-derived+macrophages+cultured+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acquir+Immune+Defic+Syndr%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte colony-stimulating factor upregulates HIV-1 replication in monocyte-derived macrophages cultured at low density.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 44 (3), 254-261 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimatingfifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hyg%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimatingfifty percent endpoints.</a> Am J Hyg. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Nickle, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+and+ancestral+state+HIV+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consensus and ancestral state HIV vaccines.</a> Science. 299 (5612), 1515-1518 (2003).</li>
<li>Rolland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+function+of+ancestral+center-of-tree+human+immunodeficiency+virus+type+1+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins.</a> J Virol. 81 (16), 8507-8514 (2007).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Spira, A. I., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+donor+cells+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+replication+and+selection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effect of different donor cells on human immunodeficiency virus type 1 replication and selection in vitro.</a> J. Virol. 69 (1), 422-429 (1995).</li>
<li>Manocheewa, S., Swain, J. V., Lanxon-Cookson, E., Rolland, M., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+costs+of+mutations+at+the+HIV-1+capsid+hexamerization+interface%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fitness costs of mutations at the HIV-1 capsid hexamerization interface.</a> PLoS One. 8 (6), e66065(2013).</li>
<li>Zakeri, H., Amparo, G., Chen, S. M., Spurgeon, S., Kwok, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+height+pattern+in+dichloro-rhodamine+and+energy+transfer+dye+terminator+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Peak height pattern in dichloro-rhodamine and energy transfer dye terminator sequencing.</a> Biotechniques. 25 (3), 406-410 (1998).</li>
<li>Lalonde, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+oligonucleotide+ligation+assay+for+low-level+detection+of+nevirapine+resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+quasispecies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitive oligonucleotide ligation assay for low-level detection of nevirapine resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 quasispecies.</a> J Clin Microbiol. 45 (8), 2604-2615 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim. Burada ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve resmi ya da ABD Savunma Bakanlığı ya da Ordu Bölümü görüşlerini temsil olarak ele alınmamalıdır.

rekombinant HIV-1 molekül klonlar ve büyüme rekabet deneyleri yapımı: sunulan protokoller iki ana bölümden oluşuyordu. Bir ikili olarak enfekte edilmiş hücre kültürü içinde iki virüs ayırt etmek amacıyla, rekabet eden moleküler klonlar, bir RT-qPCR primeri-prob deneyi ile veya Sanger dizileme ile tespit edilebilir dizi etiketleri, ihtiva etmesi önemlidir. Bu protokol, HIV-1 NL4-3 Vif aynı bölgesini işgal eder ve aynı amino asit dizisini kodlayan, ancak altı ayn mutasyonla Vifa ve VifB etiketler, kullanır. Bu mutasyonlar etkilemediği gösterilmiştir edildi Viral replikasyon spor 20. Bu protokolde kullanılan PCR bazlı klonlama yöntemi kısıtlama sitesi tabanlı klonlama ile karşılaştırıldığında, klonlama siteleri seçiminde daha fazla esneklik sağlar. Bununla birlikte, PCR klonlama etkinliği uç boyutu arttıkça azalmaktadır. insert büyüklüğü akım limiti ~ 5 kb 34 olduğunu. PCR bazlı klonlama ve bölgeye yönelik mutagenesi içins, yüksek sadakat DNA polimeraz kullanılması ekstra mutasyonların olasılığını azaltmak için çok önemlidir. Ürünlerin yeterli miktarda elde etmek üzere gerekli olan PCR döngüsü az sayıda kullanılması da tavsiye edilir. Deneyimlerimize göre, burada tarif edilen PCR bazlı klonlama ve site-directed mutagenesis adımlardan sonra, herhangi bir ilave mutasyonlar tespit etmedi. Yine PCR ürünleri istenmeyen mutasyonlar kontrol etmek için sıralı olmalıdır. İdeal olarak, tüm HIV kodlama bölgesi yeniden dizilmesi gerekir. En az üç numune alma zaman noktaları üstel büyüme fazında 9 içinde muayene edilmelidir. Viral büyüme kinetiği ilk büyüme yarışma için uygun kültür dönemi ve örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için günlük örnekleme yöntemiyle kurulmalıdır. Viral büyüme kinetiği etkileyen bir faktör enfeksiyonu (İçişleri Bakanlığı) çokluğu olduğunu. Daha ro elde etmek üzere gösterildiği gibi bu protokol, monoinfection ve büyüme rekabet her ikisi için 0.005 bir toplam MOI kullanırAlt Mois 9 daha büstü sonuçlar. Bununla birlikte, alt Mois gerekirse daha uzun bir üstel büyüme fazı elde etmek için kullanılan, ancak sonuç kıvamında pahasına yapılabilir. Bu protokol virüslerinin spor farkları önceden genellikle bilinmemektedir olduğunu varsayarak, 50:50 başlangıç ​​enfeksiyon oranını göstermektedir. Viral replikasyon kinetiği önemli farklılıklar gösteren ilk veriler olduğunda Ancak, eşitsiz girdi oranlarının kullanılması uygundur. Bu gibi durumlarda, 70:30 bir enfeksiyon oranı daha az uygun bir virüs fazlalığı 9 yerleştirilir büyük bir spor farkın tespiti için ayrılması tavsiye edilir. viral büyüme kinetikleri, ve HIV-1 alt tip B kullanılarak rekabet tahlilleri optimize edilmiştir büyüme gerçekleştirmek için TCID50 belirlenmesi için protokol, PBMC, tek bir donörden NL4-3 COTB-p24 ve PBMC&#39;ler, HIV tutarlı duyarlılık göstermiştir in vitro olarak 1 enfeksiyonu. Kültür dönemive bu protokolde yer alan numune zaman noktaları, insan PBMC içinde, HIV-1 M grubu virüsleri incelemek için uygun olması muhtemeldir. Tek bir kaynaktan elde edilmiş PBMC&#39;ler kullanılarak yüksek viral replikasyon farklı bir donörden hücreleri 35 değişebilir tutarlı sonuçlar elde etmek için önerilmektedir. Bir ikame, aynı havuzu bütün deneylerde boyunca kullanıldığı sürece daha az tercih edilmesine rağmen, birden fazla vericilerden alınma toplanmış PBMC kullanılabilir. Diğer bir alternatif hücre çizgilerinin kullanımı. Burada sunulan protokol T-hücresi hattı CEMx174 23,36 ile başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bununla birlikte, tohumlanmıştır hücre sayısı yeniden optimize uyumlu hücre büyümesini başarmak için olması önemlidir. Büyüme rekabet adımlarla uygun örnekleme zamanı noktalarını belirlemek için, farklı hücre hatları değişir muhtemelen viral büyüme kinetikleri de, yeniden kurulmalıdır. Uygunluğu hesaplamak için viral oranını belirlemek için iki farklı yöntem protoc dahildirol. ilk önce, her bir numune toplama noktasında viral cDNA kopyası sayısı ölçmek için RT-qPCR kullanır. Viral replikasyon spor sonra cDNA kopyası sayısına bağlı viral oranı hesaplanmıştır. Alternatif olarak, virüs oranı VifAB etiketi bölgelerinde kromatogram tepe yüksekliğine oranı esas alınarak tespit edilebilir. iki yöntem benzer sonuçlar (Şekil 4) elde edildi. kromatogram doruk yüksekliği yöntemi tasarlanmış sekans etiketi olmadan diğer HIV-1 suşlarının uygulanabilir. RT-qPCR viral varyantları ayırt etmek primerler veya probların kullanımı ilk dikkatle değerlendirilmesi gerekmektedir İçin (20 bakınız). Bununla birlikte, RT-qPCR gibi üstel büyüme fazı içinde birinci zaman noktasında elde edilenler gibi viral RNA&#39;nın, az bir miktarda olan örnekler için daha iyi bir hassasiyet sağlar. Viral cDNA&#39;nın doğrudan ölçümü RNA ekstraksiyonu ve cDNA sentezi ile ilgili ortaya çıkabilecek teknik sorunlar saptanmasını sağlar. Dizi etiketleri ile moleküler klonlar kullanma maliyetli bir çözüm sunar tRT-qPCR yöntemleri o gibi primerlerin ve probların iki çifti birden fazla virüs incelemek için ihtiyaç vardır. Bu strateji aynı zamanda sıralama çalışmada tüm virüsler arasında aynı sitede yapıldığı gibi sırayla tepe yüksekliği varyasyon problemi, komşu üsleri 37 nedeniyle kromatogra- önler. RT-qPCR Sanger sekanslanması için üretilen PCR ürünleri aynı zamanda başka yöntemler ile kullanımı, tek tek klonlann 12,13 toplu dizilemesi STD 4,7,17,19 veya oligonükleotid ligasyon tahlili (OLA) 38 gibi viral oranını belirlemek için olabilir .

Viral replikasyon spor belirli bir ortamda 1 enfeksiyon döl üretmek için bir virüs kapasitesi olarak tanımlanır ve zaman üzerinde 2 nüfus düzeyinde bir virüs çeşidi yaygınlığını belirlemede önemli bir faktör olduğunu. In vivo spor çalışmaları, HIV-1 olarak patojenik insan virüsler, çeşitli in vitro ve birlikte mümkün değildir ex vivo çoğaltma spor deneyleri ilaç direnci ve bağışıklık kaçış mutasyonları, epistazi ve evrim kaynaklanan fitness etkilerini incelemek için geliştirilmiştir viral popülasyonları 3-6. Farklı spor deneyleri arasında, büyüme rekabet tahlilleri in vivo 1,7,8 oluşur olarak iki veya daha fazla viral varyantları, tam olarak aynı çevre koşullarında aynı hücre popülasyonu için rekabet olarak, spor farklılıkları daha duyarlı ve geçerli önlemleri elde etmek için kabul edilmektedir. Büyüme rekabet deneyleri başlayarak birkaç variab önceles enfeksiyonunun farklı çokluklar (İçişleri Bakanlığı), viral giriş oranı, ve analiz için numune alma zamanlaması kullanımı dahil, tespit edilmesi gerekmektedir. Biz viral büyüme kinetiği üzerine ve rekabet deneyleri sonucu bu parametrelerin etkilerini inceledik ve hücre kültürü 9 HIV-1 fitness sağlam ölçümleri için gerekli anahtar faktörleri tespit ettik. Deney değişkenleri ek olarak, büyüme rekabet deneyleri viral varyantları ölçülmesi için çeşitli yöntemler vardır. 10,11 Toplu veya klonal sıralama 12,13 faiz sitesinde (ler) nükleotid frekansları dayalı rekabet virüslerin oranını belirlemek için kullanılır olmuştur. Bağıl spor zaman bu oran değişiklik elde edilir. DNA dizileme hizmetleri yaygın olarak bulunmaktadır Bu yöntem uygundur. Paralel alel-spesifik dizilim (PASS) yöntemi birden fazla sitelerde sıralama ve rekombinantların 14 saptanmasına olanak </sup&gt;, Ama aynı zamanda özel olarak geliştirilmiş reaktifler ve saptama sistemlerini gerektirmektedir. Esas olarak, bu yöntemler, söz konusu bir bölge nükleotid farklılıklar az sayıda virüs suşu için geliştirilmiştir. Diğer yöntemler, küçük bir raportör gen sıralama ile yarışan virüsleri, heterodubleks izleme tahlilleri (HTA) 4,7,17,19 ayırt veya transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ters etiketleri gibi 15 veya eşanlamlı mutasyonları 4,16-18 kullanmak bağımsız olarak sekans benzerliği suşları rekabet çalışma için geçerli yapılabilir her biri (RT-qPCR) 15,16,18,20. Ek bir adım viral genomları içine etiketleri tanıtmak için gerekli ve RT-qPCR tahlil ayrıca belirli maddeler ve enstrümantasyon gerektirir. Biz bulduk toplu Sanger dizileme verimleri karşılaştırılabilir sonuçlar 9. Büyüme yarışma sonrasında, viral replikasyon spor göreli uygunluk veya t arasında fitness oranı olarak sunulmuşturvira varyantlar WO. bir virüs göreli spor aşı maddesi, ilk oran ya da iki rakip virüsler arasında net büyüme oranı farkı olarak normalleştirilmiş bir viral varyantın nihai oran olarak tanımlanabilmektedir. Biz ikinci yöntemi, sadece üstel büyüme fazında içinde uzunlamasına veri noktalarını kullanarak, en sağlam sonuçlar 9,20 ürettiğini gördük. Vitro fitness deneyleri, biyolojik klonlar 6-8 ve HIV-1 bulaşıcı moleküler klonlar incelemek için öncelikle kullanılır. İkincisi, genetik manipülasyon için uygun olan, genellikle belirli bir mutasyon veya ilgi duyulan 3-5,21,22 spesifik dizilerinden uygunluk üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır. Aşağıdaki protokoller viral büyüme kinetikleri, bir dizi etiketi içeren HIV-1 vektörleri kullanarak yeni tam uzunlukta bulaşıcı HIV-1 molekül klonlar inşa ilgi mutasyonlar tanıtarak, viral stokları yapma ve kurma açısından bir iş akışını açıklarGöreli uygunluğu büyüme rekabet tahlili yapılması ve hesaplanması için (Şekil 1). Optimize prosedürler kullanılarak, üç rekombinant HIV-1 mutantlar yarattı ve çoğaltma zindeliği belirledi. yeniden birleştirici molekül klonun ilk sentetik COTB (Merkez-of ile pNL4-3, HİV-1 laboratuar sarmalı NL4-3 tam uzunlukta enfeksiyon genomunu ihtiva eden bir plazmid HIV-1 Gag-p24 gen bölgesine değiştirilmesiyle yapılmıştır Ağaç, alt tip B) gag-p24 dizisi 23 prototip gerginlik yaratır. Tek amino değişiklikleri (T186M, T242N ve I256V) daha sonra üç mutant klonlar oluşturmak tanıtıldı. Her mutant verilen genetik arka planda her mutasyonun fitness etkisini gözlemlemek için prototip virüsüne karşı yarıştı edildi. Üç mutantlar prototip virüsü daha hafif anlamlı derecede düşük çoğaltma fsitness çeşitli düzeylerde göstermişlerdir. T242N mutasyonu, daha önce bir orta fitne olduğu bildirilmiştirss Bu çalışmada gösterilen sonuca benzer 24-26, maliyet. Diğer iki mutasyonun spor maliyeti, daha önce bildirilmemiştir.

<table><tbody><tr><td>Rekombinant klonların</td><td></td><td></td><td></td>yapımı</tr><tr><td>Kimerik primer/Mutajenik/Dizileme primerleri</td><td>IDT</td><td></td><td>Özel DNA oligoları</td></tr><tr><td>pNL4-3VifA ve pNL4-3VifB plazmidi</td><td></td><td></td><td>Lütfen Dr. James I Mullins (jmullins@uw.edu) ile iletişime geçin</td></tr> <tr><td>Yüksek Kaliteli DNA polimeraz</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek kaliteli tampon</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>Uygulamalı Biyosistemler&reg; GeneAmp&reg; PCR Sistemi 9700</td></tr><tr><td>DNA yükleme boyası</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0631</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA merdiveni</td><td>Invitrogen</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DpnI enzimi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>TOP10 kimyasal olarak yetkin Escherichia coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Luria Suyu baz tozu</td><td>Invitrogen</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Araştırma Ürünleri Uluslararası</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Transfeksiyon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T-17</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>http://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>0.22 &# 956; m filtre üst tüp</td><td>VWR Uluslararası</td><td>89220-716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Iscove & prime; s Modifiye Dulbecco & prime; s Orta (IMDM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medya</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>Fitohemaglutinin (PHA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R30852801</td><td></td></tr><tr><td>İnsan İnterlökin-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>JR Scientific</td><td>43640</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve Streptomisin</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plaka</td><td>VWR Scientific</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>48 kuyulu plaka</td><td>VWR Scientific</td><td>62407-338</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu düz tabanlı plaka</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-3015-4</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu yuvarlak tabanlı plaka</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Mt. Baker Bio</td><td>MBD-1500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tüpler, O-ringli</td><td>VWR Scientific</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C-3317-6</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-HIV-1 SF2 p24 antiserum</td><td>NIH AIDS Reaktif Programı</td><td>4250</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan HRP</td><td>KPL</td><td>474-1516</td><td></td></tr><tr><td>TMB Microwell Peroksidaz Substratı</td><td>KPL</td><td>52-00-01</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300-500</td><td>Tüm maruz kalma yollarında ciddi yanıklara neden olur. Kişisel koruyucu ekipman kullanın. Yalnızca kimyasal çeker ocak altında kullanın. Hemen bol su ile en az 15 dakika yıkayınız.</td></tr><tr><td>HIV p24 standart</td><td>AIDS ve Kanser Virüsü programı (NCI-Frederick)</td><td>Sipariş detayları için lütfen Julian Bess, Jr. (bessjw@mail.nih.gov)</td><td></td> ile iletişime geçin; http://ncifrederick.cancer.gov/Programs/Science/Acvp/bio/Bess.aspx</tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>VMax Kinetik ELISA Mikroplaka Okuyucu</td></tr><tr><td>RNA izolasyonu cDNA sentezi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAxtractor</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/sample-prep/qiaxtractor</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Bioline</td><td>Bio-39026</td><td></td></tr><tr><td>SuperscriptIII</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Birinci iplikli tampon&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080-085</td><td></td></tr><tr><td>Rnaze inhibitörü</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>RnaseH</td><td>Invitrogen</td><td>18021-071</td><td></td></tr><tr><td>qPCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı qPCR makinesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>Uygulamalı Biyosistemler 7300 Gerçek Zamanlı PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>TaqMan&reg; Gen İfadesi Master Mix</td><td>Life Teknolojileri</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>İleri, geri astar</td><td>IDT</td><td></td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>Prob</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>optik 96 kuyulu reaksiyon plakası</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>I19N3Q216</td><td></td></tr><tr><td>PCR + dizileme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraz (Biolase)</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>NH4 tamponu&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Bioline</td><td>Bio-21043</td><td></td></tr><tr><td>Dizileme astarı</td><td>IDT</td><td></td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>QIAxcel</td><td>Qiagen</td><td></td><td>http://www.qiagen.com/products/catalog/automated-solutions/detection-and-analysis/qiaxcel-advanced-system</td></tr><tr><td>DNA dizileme servis sağlayıcısı</td><td>http://www.htseq.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRC web aracı</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/grc/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChromatQuan web aracı</td><td>http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/cgi-bin/chromatquant.cgi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan İmmün yetmezlik virüs çoğaltma fitness belirlenmesi için İkili büyüme rekabet analizi

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro uygunluk testleri, HIV-1 gibi virüsler için viral replikasyon uygunluğunu belirlemek için gerekli araçlardır. Viral replikasyon uygunluğunu tahmin etmek için, enfeksiyöz birim başına viral partikül sayısından, hücre kültüründeki büyüme hızına ve çok döngülü büyüme rekabeti testlerinden türetilen göreceli uygunluğa kadar çeşitli ölçümler kullanılmıştır. Büyüme rekabeti tahlilleri, virüsler aynı büyüme koşulları altında hücresel hedefler için rekabet ettiğinden, özellikle hassas bir uygunluk ölçümü sağlar. Enfeksiyon çokluğu (MOI), örnekleme süreleri ve viral tespit ve uygunluk hesaplama yöntemleri dahil olmak üzere büyüme rekabeti testleri yapılırken dikkate alınması gereken birkaç deneysel faktör vardır. Her faktör nihai sonucu etkileyebilir ve bu nedenle deney tasarımı sırasında dikkatli bir şekilde düşünülmelidir. Burada sunulan protokol, yeni bir rekombinant HIV-1 klonu oluşturmaktan büyüme rekabeti testlerinin gerçekleştirilmesine ve deneysel sonuçların analiz edilmesine kadar olan adımları içerir. Bu protokol, tutarlı ve sağlam sonuçlar vermek için daha önce gösterilen deneysel parametre değerlerini kullanır. Bazı parametrelerin hücre tipine ve çalışılan virüslere göre ayarlanması gerektiğinden alternatifler tartışılmaktadır. Protokol, cihazların, reaktiflerin ve uzmanlığın mevcudiyeti laboratuvarlar arasında farklılık gösterdiğinden esneklik sağlamak için iki alternatif viral tespit yöntemi içerir.

HIV-1 Gag-p24 olarak tek bir amino asit değişikliklerinin spor etkisini incelemek için, HIV-1 COTB-p24 geni 23,32,33 ihtiva eden bir pNL4-3 plazmide mutasyonların katılması için oligonükleotid yönlendirilmiş mutagenez kullanılmıştır. Viral stoklar 293T hücrelerinin transfeksiyonu ile üretilir ve 48 saat sonra hasat edilmiştir. Biz Reed-Muench yöntemi 31, her bir virüs stokunun% 50 doku kültürü enfeksiyon dozu (TCID50) tahmin edilmiştir. Prototip TCID50 ve mutant virüsler, 10 4 10 5 IU / ml (Şekil 3A) arasında değişmektedir. Rekombinant virüslerin büyüme kinetikleri 0.005 MOl&#39;de tek bir donörden alınan PBMC içinde kurulmuştur. RT-qPCR altı gün boyunca günlük olarak, viral cDNA kopyası sayısını ölçmek için kullanılmıştır. Bütün mutant ve prototip virüsleri &lt;Viral RNA kopya sayısı artış azalan bir eğimi (belirtildiği gibi viral büyüme yavaşladı 2. ve 4. günde, aşağıdakiler arasında katlanarak büyüyenstrong&gt; Şekil 3B). cDNA azalma (inokulum karşılık gelir) gün 0 ve 2 arasında sayı hücreleri virüs emilmesi ve gün 1 yıkama (aşama 5.1.6) bağlanmamış virionlann çıkarılması nedeniyle kopyalama. Üslü büyüme fazında, üç mutant prototip virüsü (Şekil 3C), daha yavaş bir büyüme oranını (g) vardı. Her üç mutantlar 0.005 toplam İçişleri Bakanlığı büyüme rekabet deneylerinde prototip virüsüne karşı yarıştı bulundu. Ikili olarak enfekte kültürlerden viral büyüme kinetikleri monoinfection benzer olduğu; Viral üstel büyüme fazı gün 2 ve 4 arasında, ve virüs büyümesi günde 5 (Şekil 4A) etrafında bir düzlüğe ulaşmıştır. Viral büyüme oranı farklılıkları, zaman içinde, viral oranı değişikliği elde edilmiştir. Viral oran cDNA kopyası başvuru sayısı ve RT-qPCR kullanarak mutant virüslere ve karşılaştırarak zirve yükseklikleri ile hesaplanmıştırsırayla iki virüs (Şekil 4B) ayırt edici nükleotit siteleri kromatogra-. doruk yüksekliğini ve viral RNA kopya sayısı yöntemleri kullanılarak saptanmıştır büyüme oranı farklılıkları, benzer sonuçlar (Şekil 4C) vermiştir. Her üç mutantlar düşük uygunluğu (Şekil 4C) sahip mutant I256V ile prototip virüs daha düşük çoğaltma uygunluk vardı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52610/52610fig1.jpg" /> Şekil 1: Bu yazıda sunulan protokollerin akış diyagramı, viral stokların Virüs hazırlanması protokolleri endişe HIV-1 rekombinant klonların yapımı ve üretimi.. Fitness Tahliller protokoller viral büyüme kinetiği kurulması ve nispi viral uygunluğunu belirlemek için vardır. Kesik çizgiler protokoller için alternatif akımlarını gösterir. Örneğin, bir mutasyonun HIV-1 NL4-3 doğrudan sokulabilirbir rekombinant klonu oluşturmadan molekül klonu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig2.jpg" /> Şekil 2:. Örtüşme uzatma PCR (A) kullanılarak HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24 yeniden birleştirici molekül klonlarının kurulması kimerik primerler dizayn. 5 &#39;primer yarıları NL4-3 vektör dizisi içeren ve 3&#39; yarım uç dizisinin uçlarını içerir. (B), kimerik primerler uç fragmanını COTB Gag-p24 amplifiye edilmesi için kullanılır. (C) uç parçaları yeni bir rekombinant plazmidi üretmek için ikinci bir PCR için primerler olarak kullanılmıştır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig3.jpg" /> Şekil 3:. PBMC&#39;lerde viral büyüme özellikleri (A) Log 10 TCID 50 </sub&gt; viral stokların. (B) MOl&#39;de = 0.005 başlamış monoinfections viral büyüme kinetiği. Panel (B) elde edilen üslü büyüme fazında (gün 2-4) de dahil olmak üzere, altı gün boyunca (° C) Viral büyüme oranları. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95&#39;lik güven aralıklarını gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52610/52610fig4.jpg" /> Şekil 4: Viral büyüme ve bağıl spor tayinleri (A) dually enfekte PBMC kültürlerinde viral büyüme.. T242N ve prototip virüs (B) Oranlar RT-qPCR veya sıralama tepe yüksekliği metodu kullanılarak belirlenmiştir. (A) &#39;da gösterildiği gibi, (C) mutant ve ikili olarak enfekte kültürlere prototip virüsler arasında net, viral büyüme oranı farklılıkları (d),. d değerleri f hesaplandı(B) &#39;de gösterildiği viral oranı verilerini rom. Gösterilen değerler, bir deneyden üç kopyanın ortalamasını temsil eder. Hata çubukları,% 95&#39;lik güven aralıklarını gösterir.

Neredeyse izojenik virüsler arasındaki büyüme rekabeti, göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için hassas bir ölçüm sağlar. Burada açıklanan protokoller, rekombinant HIV-1 klonlarının oluşturulmasını, virüs yayılımını ve büyüme rekabetini ve hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için optimize edilmiş analiz yöntemlerini içerir.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen HIV-1 suşlarının göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen tam uzunluktaki HIV-1 dizilerini içeren viral moleküler klonların veya DNA plazmitlerinin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, DNA transfeksiyonu yoluyla her bir moleküler klon için viral stoklar üretmektir.Ardından, her bir HIV-1 suşunun büyüme kinetiği ve eksponansiyel büyüme evresi, mono-enfekte hücre kültürlerinin boylamsal örneklemesi ile belirlenir. Son adım, hücre kültürlerinde ikili büyüme rekabeti veya çift enfeksiyon gerçekleştirmektir. Nihayetinde, viral oranları belirlemek için ters transkripsiyon, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve Sanger DNA dizileme ile elde edilen DNA dizisi kromatogram pik yükseklikleri kullanılır; bu oranlar daha sonra göreceli viral replikasyon uygunluğunu hesaplamak için kullanılır.Bu tekniğin para-mono enfeksiyonu veya iki zaman noktalı çift enfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, iki viral suş arasındaki replikasyon kondisyonu (fitness) farkının daha hassas ve güvenilir ölçümlerini sağlamasıdır. Bu makalede sunulan protokoller; HIV-1 rekombinant klonların oluşturulmasını, bölgeye özgü mutagenez yoluyla ilgilenilen mutasyonların eklenmesini, viral stokların hazırlanmasını ve viral büyüme kinetiğini belirlemek ile göreli viral kondisyonu saptamak için kondisyon analizlerinin gerçekleştirilmesini kapsamaktadır. Bu video, büyüme rekabetini ve iki farklı yöntemi gösterecektir.Fitness hesaplaması için viral oranı belirlemek üzere, lütfen diğer tüm prosedürler için protokol metnine bakın. Büyüme rekabet testi hazırlığı için, 48 kuyucuklu düz tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa, toplam 500 µL hacimde 3 × 10⁵ PHA ile stimüle edilmiş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) ekleyin. Plakayı inokülasyona kadar 37 °C'de, %5 CO₂ atmosferinde tutun. Ardından, her bir virüs için 6.000 IU içeren 3 mL inokülüm hazırlayın.Tipik bir deneyde birden fazla mutant test edilir, ancak bu gösterim kapsamında prototip virüse karşı yalnızca bir mutant test edilecektir. Viral stoktaki enfeksiyöz titrenin çok yüksek olması durumunda seri dilüsyon gerekebileceği için viral inokülumun uygun şekilde hazırlanması bu prosedürde kritik bir adımdır. Çift enfeksiyon inokülumunu oluşturmak için her bir viral inokülumdan 1,5 mililitreyi steril bir tüpe aktarın.48 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa, PHA ile stimüle edilmiş PBMC'lere 500 µL çift inokulum ekleyin. Son kültür hacmi kuyucuk başına 1 mL'dir. RNA izolasyonu için, çift inokulumdan kuyucuk başına 200 µL olmak üzere iki adet 96 kuyucuklu plakaya paylaştırın. Plakaların birini yedek olarak saklayın. İnoküle edilen hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 atmosferinde 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. İnokülasyondan 16 ila 24 saat sonra kültürleri yıkayın, kültür süpernatandan 750 µL uzaklaştırıp atın ve 750 µL taze komple Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium veya cIMDM ekleyin.Plakayı streç filmle sarın ve 300 g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından plakayı çıkarın ve süpernatandan 750 µL alarak atın. 750 µL taze cIMDM ekleyin. Plakaları 37 °C'de, %5 karbondioksit atmosferinde inkübe edin. Örnekleme zamanları, viral eksponansiyel büyüme evresi içinde en az üç zaman noktasını içerecek şekilde seçilmelidir.Numune toplamak için, 500 µL kültür süpernatantını 1,8 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 3000 g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. RNA izolasyonu için hücreden arındırılmış süpernatantın 200 µL'sini iki adet 96 kuyucuklu numune plakasına aktarın. Bu aşamada plakaların birini yedek olarak saklayın. Süpernatantları RNA izolasyonuna kadar -80 °C'de saklayın.Her bir kültüre 500 µL taze cIMDM ekleyin ve plakayı bir sonraki örnekleme zamanına kadar inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, örneklerden RNA izole edilir ve bunu takiben CDNA sentezi gerçekleştirilir. Viral oranların belirlenmesi için iki yöntem gösterilecektir.Birincisi ters transkripsiyon, kantitatif gerçek zamanlı PCR veya RT qPCR kullanılarak ve ikincisi Kromatogram Pik Yükseklikleri kullanılarak gerçekleştirilir. qPCR için, mikrolitre başına 3x10⁶ kopyadan 30 kopyaya kadar her adımda on kat seyrelterek, pNL4-3VifA plazmidinin üç tekrarlı standart seri dilüsyon serisini hazırlayın. 96 kuyucuklu bir qPCR reaksiyon plakası hazırlayın.Her plak; en az bir negatif kontrol, standart dilüsyon serisinin üç tekrarı ve her bir cDNA örneğinin iki tekrarını içermelidir. Negatif kontrollerde, standart dilüsyon serisinde ve cDNA örneğinin bir tekrarında sinyalleri tespit etmek için vFIA primer probu kullanın. cDNA örneğinin diğer tekrarı ile vIFB primer probunu kullanın. Her qPCR reaksiyonu için 12,5 µL qPCR master mix, 0,2 µM qPCR probu, 0,8 µM ileri (forward) ve geri (reverse) primer ve 1 µL cDNA kullanın. Standart dilüsyon serisi için cDNA yerine pNL4-3VifA seri dilüsyonunu ekleyin; negatif kontroller için cDNA yerine su veya tampon çözelti kullanın. PCR döngü parametrelerini, qPCR cihazının kullanımına yönelik üretici talimatlarına göre ayarlayın. Standart dilüsyon serisinden elde edilen amplifikasyon verilerini kullanarak standart eğriyi hesaplayın.Kopya sayısını belirlemek için cDNA örneklerinin amplifikasyon verilerini standart eğri ile karşılaştırın. Göreceli viral uygunluğu hesaplamak için viral büyüme hızı hesaplamasını veya GRC web aracını kullanın. RT qPCR adımından elde edilen cDNA kopya sayısını gösterilen belirtilen formatta girin. Hesapla (calculate) seçeneği, rekabet halindeki iki virüs arasındaki net büyüme hızı farkını verecektir. Kromatogram pik yüksekliklerini kullanarak viral oranları belirlemek için, VIF ileri ve VIF geri primerlerini kullanarak VIFAB sekans etiketini içeren HIV-1 VIF fragmanlarını PCR ile amplifiye edin. Her PCR reaksiyonu için bir mikrolitre cDNA, 1X NH-4 tamponu, 1,5 milimolar MgCl2, 0,2 milimolar dNTP'ler, 2,5 U Taq polimeraz ve her bir primerden 0,45 mikromolar kullanın.Final hacim 50 µL olacak şekilde su ekleyin. PCR döngü parametrelerini; 94 °C'de bir dakika, 55 °C'de bir dakika ve 70 °C'de bir dakika olmak üzere üç döngü, ardından 94 °C'de 15 saniye, 58 °C'de 30 saniye ve 70 °C'de bir dakika olmak üzere 34 döngü ve son olarak 4 °C'de bekletme şeklinde ayarlayın. Ardından, PCR ürünlerini ticari olarak mevcut bir kit kullanarak saflaştırın ve saflaştırılmış PCR ürünlerini Sanger dizilemesi için bir DNA dizileme hizmet sağlayıcısına gönderin.Sekanslama hizmeti tarafından sağlanan ortalama okuma kalite skorunu kontrol edin. Eğer ortalama baz çağırma doğruluğu %85'ten düşükse PCR amplifikasyonunu, PCR ürünlerinin saflaştırılmasını ve Sanger sekanslamasını tekrarlayın. Her bir zaman noktasındaki viral oranı hesaplamak için Chromat kantitatif web aracını kullanın.Gerekli girdiler, lider dizi ve .ab1 formatındaki sekans kromatogram dosyasıdır. Araç, belirtilen bölgedeki pik yoğunluğunu ölçer.Pik yoğunluğu oranı, iki virüsün oranına karşılık gelir. Göreli viral fitness değerini hesaplamak için GRC web aracını kullanın. Giriş verisi, belirtilen formatta gösterilen Chromat kantitatif web aracı kullanılarak elde edilen sekans kromatogram pik yüksekliğidir. GRC web aracı, rekabet halindeki iki viral suş arasındaki net büyüme hızı farkını hesaplayacaktır; bir prototip ve üç HIV mutant virüsü oluşturulmuş ve bunların PBMC'lerdeki büyümesi karakterize edilmiştir. TCID 50 değeri mL başına 10⁴ ile 10⁵ IU arasında değişmiştir. Tüm virüsler ikinci ve dördüncü günler arasında eksponansiyel olarak büyümüştür.Eksponansiyel büyüme evresinde, her üç mutant da prototip virüsten daha yavaş bir büyüme hızına sahipti. Her bir mutant, toplam 0,005 MOI değerindeki büyüme yarışma deneylerinde prototip virüsle karşılaştırıldı; çift enfeksiyonlu kültürlerdeki viral büyüme kinetiği, tekli enfeksiyonunkiyle benzerdi. Viral eksponansiyel büyüme evresi ikinci ve dördüncü günler arasındaydı ve viral büyüme beşinci gün civarında bir platoya ulaştı.Viral büyüme hızı farkları, viral oranın zaman içindeki değişiminden türetilmiştir. Viral oran, RT-qPCR kullanılarak referans ve mutant virüslerin cDNA kopya sayılarına göre ve iki virüsü ayırt eden nükleotid bölgelerindeki sekans kromatogramlarının pik yükseklikleri karşılaştırılarak hesaplanmıştır; burada T242-N mutantı prototiple karşılaştırılmıştır. Bu örnekte, iki yöntem kullanılarak belirlenen büyüme hızı farkları benzer sonuçlar vermiştir.Her üç mutant da prototip virüsten daha düşük replikasyon uygunluğuna sahipti ve en düşük uygunluk I256-V mutantında görüldü. Bu videoyu izledikten sonra, HIV-1'in göreceli replikasyon uygunluğunu belirlemek için ikili büyüme yarışması deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

pairwise-growth-competition-assay-for-determining-replication-fitness

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Taç bölgesi yüzeyinde HIV-1 zarf glikoprotein (gp120) farklı V3 döngü dizilerinin yapısal pozisyonları siliko katlama birçok durumda karakterize edilebilir bir state-of-the-art kullanarak döngü 10 ila...

HIV-1 V3 döngü Taç R2 Sıra immünolojik İlgili Dinamik Tersiyer Yapısal Özellikler Değerlendirilmesi Ab initio Katlanır

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

HIV-1 patogenezi hem viral özellikler hem de konak genetik faktörleri ile tanımlanır. Burada, gag gen dizisi varyasyonunun virüsün in vitro replikasyon kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için tekrarlanabilir ölçümlere izin veren sağlam bir yöntemi açıklıyoruz.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

HIV-1 replikasyon döngüsünün entegrasyon sonrası adımlarını hedefleyen RNA moleküllerinin etkinliğini ve toksisitesini değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır. Bu yöntemler, yeni molekülleri taramak ve mevcut moleküllerin formatını optimize etmek için kullanışlıdır.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Bu iletişim kuralı radyasyon şartına yenidoğan NSG fareler içine insan hematopoetik kök hücre intrahepatic enjeksiyon yoluyla insanlaşmış fareler (hu-NSG) kurmak için bir yöntem sağlar. Hu-NSG fare duyarlı HIV enfeksiyonu ve kombinatorik antiretroviral tedavi (sepet) ve HIV çoğaltma ve gecikme süresi incelemeler için uygun bir patofizyolojik model olarak hizmet vermektedir.

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Burada, özellikle HIV-1 enfeksiyonuna vurgu yaparak, endoplazmik retikulum (ER) stresini ve katlanmamış protein yanıtı (UPR) aktivasyonunu belirlemek için bazı yerleşik yöntemleri açıklıyoruz. Bu makalede ayrıca ER stresi/UPR'nin HIV-1 replikasyonu ve virion enfektivitesi üzerindeki etkisini araştırmak için bir dizi protokol açıklanmaktadır.

HIV-1 ile Enfekte T Hücrelerinde Endoplazmik Retikulum Stresi ve Katlanmamış Protein Yanıtının Ölçülmesi ve HIV-1 Replikasyonundaki Rolünün İncelenmesi

Öğrenin, HIV-1 suşlarının göreli replikasyon fitness'ını ikili büyüme rekabet analizi ile nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, viral klon oluşturma ve qPCR kullanarak hassas ölçümler sağlar.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

Daha fazla video keşfet