Name: Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Keşfedin medüller timik epitel hücrelerinin 3D organotipik kültürde proliferasyon ve farklılaşmasını. Bu yöntem, promisküöz gen ekspresyonunun korunmasını sağlayarak immunoloji araştırmalarını geliştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ), AB konsorsiyumu "Tolerage", Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) ve Landesstiftung Baden-Württemberg tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma Regierungspräsidium Karlsruhe etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bütün hayvanlar, Almanya Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ), spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi. Yaş 1 ila 7 gün arasında değişen tüm kültür deneyleri fare yavrular için kullanılmıştır. Timustan mTECs 1. izolasyonu Not: aşağıdaki gibi bazı modifikasyonlar ile, steril koşullar altında, daha önce tarif edildiği gibi 1, aşağıdaki sindirim adımları uygulandı. <ol><li> Fare yavrular başını kesmek ve timus çıkarın. RPMI 1640 ortamı (% 5 FCS ihtiva eden) ihtiva eden bir petri plakası buz üzerinde Thymi yerleştirin. </li><li> ~ 5-30 ml RPMI ortamı ile bir yuvarlak tabanlı tüp içinde ince, küçük parçalar ve yerine Thymi kesin ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile bir mıknatıs kullanılarak karıştırılmıştır hafifçe. </li><li> Bundan sonra, özellikle timositleri içeren süpernatant süzün ve collagena bir yuvarlak kalan doku sırayla sindirmek37 ° C&#39;de 25 dakika her biri için kolajenaz / dispaz (0.2 mg / ml ile 1.2 U / ml nihai konsantrasyon), ardından 37 ° C&#39;de her biri için (0.2 mg / ml ve son konsantrasyonu, dağılışı 57 U / ml), 15 dakika boyunca se tip IV, Thymi kadar manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde Cı tamamen sindirilir. Üç Thymi ikiye 1 ml enzim kullanın. </li><li> Dokuya Pasteur pipeti ile bir kez her 7-10 dakikada bir çalkalayın. Kollajenaz / dispase fraksiyonları havuzu ve 70 mikron gazlı süzülür. </li><li> Manyetik hücreye sıralama (MACS) tarafından mTECs zenginleştirin. Daha önce, 11 tarif edilen ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, ayırma, manyetik hücre tarafından mTECs arıtılmasını gerçekleştirin. NOT: anti-CD80-PE (16-10A1, 1 at kullanımı: 100 seyreltme) ve (1 at G8.8, kullanımı: 100 seyreltme), anti-EpCAM-bio 12 mTECs manyetik sıralama için aşağıdaki antikorları kullanılmıştır. MACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı: CD45 - EpCAM + CD80 - ve CD45 - CD80 + respectively. </li><li> Aşağıdaki (Bölüm 2.3) açıklandığı gibi MACS saflaştırma (olgunlaşmamış mTECs saflığı = 83.1 ± 6.3% ve olgun mTECs = 79,23 ± 3.42%) ardından, organotipik kültürlerinin üzerine mTECs tohum. </li><li> Alternatif olarak, CD45 MACS tükenmesi sonrasında (100 mikron memesi kullanarak) FACS sıralama mTECs aşağıdaki antikorlar kullanılarak: Anti-CD45-PerCP (30-F11, 1 at kullanımı: 100 seyreltme), anti-Ly51-FITC (6C3, 1 de kullanmak : 100 seyreltme), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1 ile kullanımı: 500 oranında seyreltilmiş) ile 1 anti-CD80-PE (16-10A1, kullanımı: 100 seyreltme). (Gün 4): propidium iyodür (5,000 1) kullanılarak ölü hücreleri hariç. Sırasıyla EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 - EpCAM + CD80 - ve PI - CD45 - Ly51 PI: FACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı. </li></ol> 2. 3D Organotipik Co-kültürler (OTC) NOT: keratinocyt ve organotipik ekimi için 3D-dermal yapılarDaha önce tarif edildiği gibi 9,13 es hazırlandı. Tüm adımlar da hücreler, 2, 37 ° C de inkübe edildi ve% 5 bulundu. Şöyle mTECs kullanılarak OTC küçük değişiklikler ile hazırlandı. <ol><li> Insanlara özgü fibroblastlar hazırlanması Not: daha önce tarif edildiği gibi, 9, insan dermal fibroblastları de-epidermised dermişin eksplant kültürleri elde edildi. <ol><li> Kısaca, insan cildi (~ 5 cm uzunluğunda) şeritler kesildi ve termolisin, 4 ° C&#39;de, O / N (10 mM Hepes, pH 7.4 ile birlikte tuzlu su içinde 0.5 mg / ml) ile tedavi. </li><li> Bundan sonra, forseps kullanarak dermis epidermis ayırın. </li><li> İnce 10 cm&#39;lik petri plakasında küçük parçalar yerine dermis kesilir ve steril bir hava akımı altında 1-2 saat boyunca kurumaya bırakılır. DMEM% 20 FBS içeren düzenli eksplantlar tamamlayın. </li><li> Out büyüyen fibroblastlar bölmek zaman konfluent eksplantlar ileri con plakaya uymak devam emin% 0.1 tripsin kullanarak (genellikle yaklaşık 3 hafta)akıbet ardışık mermi. </li><li> Kadar DMEM 3 kat% 10 FBS aynı eksplantlardan fibroblastlar genişletin ve onları 14 cryo-korumaktadır. Her bir deney serisi için fibroblastlar aynı toplu kullanın. NOT: fibroblastlar dermal eşdeğeri set-up için ışımaya değildi. </li></ol></li><li> İskele hazırlanması <ol><li> Tam 12 iyi filtre ekler uyması için keskin bir 11 mm çaplı metal zımba kullanarak iyi sınırlı, çevrelerin içine 0.4-0.6 mm kalınlığında viskon, dokunmamış lifli malzeme (excel sayfasını destekleyen ürün detay) kesin. Sonra bir iskele olarak 12- kuyu filtre elemanı (polyester kılcal gözenek membran 3 mikron gözenek boyutu) içine yerleştirin. Steril 12 oyuklu plaka içine komple filtre setup yerleştirin. </li><li> Fibrinojen ve trombin bir kombinasyonundan oluşan cerrahi bir fibrin yapışkan, fibrin jel kiti kullanılarak hazırlanır. Fibrinogen- olarak 8 mg / ml ve 10 kit trombin bileşeni önceden seyreltinsırasıyla birim / ml. Aşağıdaki gibi, bir 12-kuyucuklu plaka tek bir oyuk için devam edin. <ol><li> Ca2 + ve Mg + 2, pH 7.0, 100 ul olmayan fibrinojen 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile (8 mg / ml) ile seyreltilir. 270.000 fibroblastlar içeren 100 ul FCS ile 100 ul trombin (10 birim / ml) ile seyreltilir. </li><li> 2 mg / ml ve 2.5 ünite / ml trombin fibrinojen bir nihai konsantrasyonu ile sonuçlanan, (1 karışımı 1) 200 ul fibrinojen ekleme fibroblastlar iskele üzerine hücre-karışımı ihtiva eden trombin 200 ul için koyun. İyice karıştırın ve yumuşak pipetleme (Gün 1) ile iskele bütün alana eşit dağıtın. NOT: 37 ° C&#39;de 30 dakika sonra fibroblastlar kuşatan bir pıhtı, tamamen iskele iç boşlukları dolduran ve düzgün bir üst yüzey oluşturan, meydana gelmiş olacaktır. </li></ol></li></ol></li><li> MTECs ile ortak kültür <ol><li> Ön kültür için organ kültürleri daldırılmasıBir değiştirilen ortam içinde% 10 FBS, 50 ug / ml L-askorbik asit ve 1 ng / ml TGF-β1 ile DMEM, 4-5 gün süre ile her gün. </li><li> Mtec tohumlama gününde, rFAD medyumla yerine (1: 1 DMEM + DMEM / F12),% 10 FBS ile, 10 -10 M kolera toksini, 0.4 mg / ml hidrokortizon, 50 ug / ml L-askorbik asit, RANK bağı nedenle fibroblastlar tarafından salgılanan serin proteaz ile erken fibrinolizi önlenmesi (0.1 ug / ml) ve 500 birim / ml Aprotinin,. </li><li> 7-8 saat sonra, 250,000 mTECs tohumlayarak ko-kültürler-ayarlamak (tam mTECs, ya CD80 LO ve CD80 yüksek alt-gruplar), fibroblast iskele üst oyuk başına 100 ul&#39;lik bir hacim içinde. Bir Neubauer odası (gün 4) kullanarak hücreleri sayın. NOT: timüs 3D organotipik kültürler hava kaldırdı olan cilt OTC aksine medyada submersed tüm zamanlarda. </li><li> 24 saat inkübasyondan sonra, şimdi containi (adım 2.3.2) yukarıda belirtildiği gibi orta kültürleri (toplam orta değişimi) kaynağıng Aprotininin miktarlarda 250 ünite / ml (Gün 5) azalır. </li><li> MTECs proliferatif aktivitesini değerlendirmek için, kültürler tahliye edilmeden önce 4 saat OTC (yani 6.7 uM / ml, / de 10 uM) edu ekleyin. Her kültürün numunesinin veya akışla iki bölüm halinde ya sayma K14 + Edu + hücreler tarafından, mTECs çoğalma endeksleri belirleyin keratin 14. co-boyanması ile birlikte Edu Görüntüleme Kit açıklandığı gibi OTC cryo bölümlerin boyama yapın sitometri (EDU akış sitometri, Bölüm 1.7 yerine Ly51-FITC bir 1&#39;deki CDR1-PB 15 kullanın: 100 seyreltme ve 2.3.6.4). </li><li> Ko-kültür 4-7 gün sonra, RNA izolasyonu, cryo-kesit veya FACS analizi (Gün 8-11) için OTC&#39;leri ve işlemi sonlandırmak. <ol><li> Bir forseps kullanarak kuyu ucun filtreden iskele / dermal eşdeğer ayıran kültürleri sonlandırın. </li><li> Cryo-kesit için, Ekim bileşik bütün OTC embed ve li dondurmacryo-kesit önce sterlin azot buharı. Kullanılana kadar -20 ° C &#39;de, bir kriyostat ve mağaza kullanılarak 5-7 mikron kalınlığında OTC bölümleri hazırlayın. Antikorlar: (100 seyreltme oranı: 1 de GP53, kullanım), ve anti-vimentin: cryo-kesitsel OTC immüno-histokimya için, anti-keratin 14 (1000 seyreltme AF64, kullanım 1 de) kullanın. İlgili ikincil antikorlar kullanılarak dolaylı immüno histokimya boyama gerçekleştirin. </li><li> RNA izolasyonu için çözelti, 2 ml RNazsız tüpün vidalı kapak olarak (fenol ve guanidinyum tiyosiyanat ihtiva eden) Denatüre edici 1 ml. Bir neşter ile parçalar halinde tüm OTC kesin ve denatüre çözeltisi içeren tüp içine ekleyin. Mekanik bir 6.0 hızda 30 saniye boyunca iki kez FastPrep aleti ile OTC&#39;leri parçalamak, 2 dakika boyunca (örnek, bu noktadan sonra -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde arasında yerleştirin. -80 ° C&#39;de donduruldu durumunda, buz üzerinde eritin. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 11,500-13,000 rpm tüpler santrifüjleyin. Bir tüpe süpernatantı aktarın RT ve f de 5 dakika boyunca inkübeüretici tarafından tarif edildiği gibi asit guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak ollow RNA izolasyonu protokolleri. </li><li> FACS analizi için, iskele kaldırmak ve fibrin / fibroblast / mtec jelden membran ayırın. İnce bir neşter ile jel kesilmiş ve ~ bir FACS tüpü içinde 20 dakika o sindirimi ya da tamamen manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de kolajenaz / dispaz, 2 ml ile sindirilmiş kadar. Bir kez, bir Pasteur pipeti her 5 dakikada enzim çözeltisi çalkalayın. Tam bir sindirimden sonra, 70 um filtre üzerinden bir hücre süspansiyonu filtre; 1,7 anlatılan ve akış sitometrisi ile analiz edildiği üzere antikorlar kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu leke. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li>
<li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li>
<li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li>
<li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li>
<li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li>
<li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaggregate+thymus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Dermatol+Symp+Proc%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li>
<li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li>
<li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li>
<li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li>
<li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li>
<li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li>
<li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li>
<li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar mali veya ticari çatışması beyan ederim.

RTOCs yanı sıra, 3D OTC TEC farklılaşma ve PGE bakım / indüksiyon diğer (i) ile karşılaştırıldığında (Tablo 1) &#39;basitleştirilmiş 3D kültürlerin&#39; kullanımı açısından çok daha üstün tarafından olmuştur - fibroblastlar yalnız iskele olmaksızın; (Ii) 2 D sistemleri kullanan -, (iii) 3T3-J2 hücreleri TEC klonlar geliştirmek olup, burada, TECS 10 ile birlikte kültürlenmiş fibroblast / besleyici hücreleri ama PGE kaybolur (iv) Matrigel veya (v) ECM bileşenleri (yayınlanmamış veriler). PGE 3D...

Geri kalan% 2 toplu timik stroma oluşturan çeşitli hücreler oluşur ise geliştirilmesi timositleri, timüs yaklaşık% 98 kadar olmak (yani, epitel hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar, B hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri). Dış kortikal epitel hücreleri (cTECs) multipotent öncesi T hücreleri ve öz-MHC olumlu seçiminde kemik iliği, T hücre soyu indüksiyon yanlısı T hücrelerinin göçü temin olgunlaşmamış timositleri kısıtlı. İç medüller timik epitelyum hücreleri (mTECs) indükleyen negatif seçim ya da regülatör T hücre soyu içine sapma ya göre kendinden peptit / MHC kompleksleri için bir yüksek afiniteli TCR olan timositlerin tolerans indüksiyonu katılmaktadırlar. Merkezi tolerans indüksiyonu bağlamında, mTECs Böylece periferik öz yansıtma dokuya sınırlı bir kendi antijenlerine (TRA) çok geniş bir yelpaze ifade etmeleri açısından benzersizdir. Bu olay karışık gen ifadesi olarak adlandırılır (PGE)1,2. Çeşitli kısa vadeli 2B kültür sistemleri değişmez ilk 2 gün içinde 3-6 MHC sınıf II, FoxN1 ve Aire gibi PGE kaybı ve anahtar düzenleyici moleküllerin sonuçlandı olarak bu büyüleyici hücre tipine En güncel çalışmalar, ex vivo izole hücrelerde güveniyor . Özellikle takımlar ve timus bozulmamış 3D ağda özellikleri 2B modellerinde eksik olan, ancak belirsiz kaldı. Yeniden birikme timik organ kültürü (RTOC) sağlam bir timik mikro-7, şu ana kadar, diğer yandan, sadece 3D, bir yandan, T hücresi gelişiminin çalışma sağlar sistemi ve stromal hücre biyolojisi, olmuştur. Bununla birlikte, RTOCs zaten fetal stromal hücrelerin bilgi girişini içerir ve 5-10 günlük bir maksimum kültür dönemi tahammül bir hücre kompleks bir karışımı içeren, örneğin, bazı sınırlamaları vardır. in vitro kültür sistemlerinde indirgemeci eksikliği çalışma engellemiştirT hücre gelişimi ve timus organogenez çeşitli yönleri az değil moleküler PGE düzenlenmesi ve mTECs gelişimsel biyoloji ile ilişkisi. Deri ve timus epitel hücrelerinin yapısal kuruluşun yakın ilişkililik sayesinde, in vitro keratinositlerin farklılaşması taklit ve böylece dermal eşdeğer oluşturmak için başlangıçta geliştirilmiş olan 3D organotipik kültürü (OTC) sistemi için seçti. OTC sistem keratinositler 8,9 numaralı seribaşı olan üzerine fibrin jel, içinde sıkışıp kalırlar dermal fibroblastlar ile kaplanmış inert iskele matriks oluşur. Burada, biz saflaştırılmış mTECs ile keratinositler yerini aldı. Bu modelin temel özellikleri korurken, biz belirli parametreleri optimize edilmiş. MTECs çoğaldı kabul OTC modelinde, böylece yakından in vivo mTECs geliştirme taklit terminal farklılaşma yapıldı ve mtec kimlik ve PGE muhafaza <sup&gt; 10. Bu teknik not timus OTC aşamalı set-up sağlayan ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>Hamile C57BL / 6 fare&nbsp;</td><td>Charles Nehri WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Mikro boncuklar, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 ve -biotin)</td> <td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pasifik</td><td>Mavisi Referans 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin 14 antikoru</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antikoru</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 konjuge AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-konjuge AffiniPure F (ab ') 2 Parça Keçi anti-Gine Domuzu IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, Alexa Fluor 488 konjuge</td><td>Moleküler Problar (Invitrogen GmbH)</td> <td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Görüntüleme Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Akış Sitometrisi Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu filtre ekleri (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, İtalya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinojen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombin TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Arotinin (Trasilol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Kolera toksini</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Seromlu (Biyokrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R& D sistemleri</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Termolizin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Bileşik</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Denatüre edici çözelti - Asit guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu)</td><td>Invitrojen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0.2 mg / ml ve 57U / ml nihai konk.</td></tr><tr><td>Nötral Proteaz (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0.2 mg / ml ve 1.2U / ml nihai konsantrasyon.</td></tr><tr><td>DNaz I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 & mikro; g/ml son kons.</td></tr></tbody></table>

medüller timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve promiscuous gen İfade destekleme 3d organotipik co-kültür modeli

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-timik T hücre gelişimi, çeşitli stromal hücrelerin, yani olmayan T hücrelerden oluşan karmaşık bir üç boyutlu ağ örgüsü gerektirir. Sırayla, yani T hücre reseptör repertuarı oluşturma ve seçim ardından T hücre soyu taahhüt önce çevre içine ihracat, zorunlu kontrol noktaları geçerken timositleri son derece koordineli zamansal ve mekansal için bu iskelesi travers. Bu iskele oluşturan iki ana yerleşik hücre tipleri (cTECs) kortikal ve medüller timik epitel hücreleri (mTECs) bulunmaktadır. MTECs önemli bir özelliği, bir çok dokuya sınırlı bir antijenlerin olarak adlandırılan rasgele ifadesidir. Bu dokuya sınırlı antijenler, sırasıyla kendi kendine tolerans sonuçlanan mTECs ya timik dendritik hücreler tarafından doğrudan veya dolaylı olarak timositleri olgunlaşmamış sunulmaktadır. CTECs ve mTECs gelişim yollarını ve fonksiyonlarını taklit in vitro uygun modeller şu anda lak vardırkral. Yeterli deneysel modellerin eksikliği, örneğin hala tam olarak hücresel ve moleküler düzeyde anlaşılmaktadır karışık gen ifadesinin, analiz engelliyordu. Biz ex vivo izole mTECs kültürüne 3D organotipik ko-kültür modeli uyarladı. Bu model, ilk olarak in vitro olarak, bir cilt eşdeğer üretmek üzere bir şekilde keratinosit yetiştirmek için geliştirilmiştir. , CD80 hi, Aire-pozitif mTECs, RANKL (ii) tepki ve FoxN1 (iii) sürekli ifadeye (i) çoğalması ve CD80 lo, Aire-negatif terminal farklılaşma: 3D model mtec biyoloji temel fonksiyonel özellikler korunmuş Aire ve CD80 hi mTECs doku kısıtlı genler.

Biz aslında keratinositlerde 9 in vitro uzun vadeli kültürü için geliştirilmiş olan 3D organotipik ko-kültür modeli (3D OTC) kabul etti. MACS zenginleştirilmiş mTECs (MACS zenginleştirme şeması Şekil 1 e bakınız), bir fibrin jel ve tutulu fibroblastlar içeren bir yapı iskelesi üzerine ekilmiştir. fibroblastlar in vitro mTECs destekleyen temel hücre dışı matriks (ECM) sağlarlar. MTECs hava maruz kalan in vivo ortamı (OTC set-up şeması Şekil 2) taklit...

Medüller timik epitel hücrelerinin in vitro olarak incelenmesi, mevcut 2D kültür sistemleri in vivo senaryoyu taklit etmediği için büyük ölçüde başarısız olmuştur. Burada tarif edilen 3D kültür sistemi - modifiye edilmiş bir cilt organotipik kültür modeli - mTEC proliferasyonunu, farklılaşmasını ve rastgele gen ekspresyonunun sürdürülmesini özetlemede üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Bu prosedürün genel amacı, timik medüller epitelyal hücreleri veya mtech hücrelerini üç boyutlu organotipik bir kültür veya OTC sisteminde kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle lifli iskele materyalinin 12 kuyucuklu bir filtre insertine yerleştirilmesi ve ardından insan deri fibroblastları içeren taze hazırlanmış bir fibrin jel tabakasının eklenmesiyle gerçekleştirilir. Dört ila beş günlük ön kültürden sonra, MTS iskele üzerine yerleştirilir ve daldırma kültür koşulları altında kültüre edilir.Son olarak, CED Mtech gelişimini değerlendirmek için ko-kültürlerde immünohistokimya, RNA izolasyonu ve gerçekler gerçekleştirilebilir. 3D organotipik ko-kültür sistemlerinin mevcut 2D kültür sistemlerine karşı temel avantajı, mtech farklılaşmasını, proliferasyonunu ve karışık gen ekspresyonunun sürdürülmesini yeniden oluşturmada çok daha üstün olmalarıdır. Bugün bu tekniği, iş birliği laboratuvarımızdan teknisyen Iris Martin gösterecek.İnsan dermal fibroblastları konfluens seviyesine ulaştığında, 0,4 ila 0,6 milimetre kalınlığındaki viskon dokunmamış lifli malzeme parçalarını kaynatıp, kurutup ve ütüleyerek iskele liflerini hazırlayın. Bunları 11 milimetrelik daireler şeklinde kesmek için metal bir delgeç kullanın. Kesilmiş lifli malzemeyi iki lam arasında yerleştirin, lamları folyoya sarın ve otoklavlayın.Sterilizasyon işleminden sonra, insertleri steril bir 12 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara, ardından her bir iskeleyi ilgili insertin içine yerleştirin. Sonra, iskele başına 100 µL taze dilüe edilmiş trombin içerisine, 100 µL fetal calf serum içindeki 2,7 × 10⁵ fibroblastı karıştırın. Trombin-fibroblast karışımını her bir iskelenin üzerine ekleyin ve ardından 200 µL taze dilüe edilmiş fibrinojen ilave edin.Ardından, her kuyucuktaki hücre karışımını, çözeltiyi nazik pipetleme ile tüm iskele üzerine eşit şekilde dağıtarak karıştırın. Görüntü, insan dermal fibroblastlarının fibrin jel ile birlikte kültürün birinci ve dördüncü günlerindeki büyümesini göstermektedir. Pıhtıların oluşumunu ve süresini aynı zamanda takip etmek için, iskele içermeyen bir kontrol kuyucuğunda test jeli hazırlayın.Fibroblastlar pıhtılaştıktan sonra, pıhtı oluşumunu bir pipet ucu kullanarak veya plakayı ters çevirerek değerlendirin; ardından organ kültürlerini, sorbik asit ve TGF beta one ile desteklenmiş besiyeri içinde dört ila beş gün boyunca bekletin. MTEC ekim gününde, erken fibrinolizi önlemek için bu besiyerini, mililitrede 500 ünite aprotin içeren RFAD besiyeri ile değiştirin. Yedi ila sekiz saat sonra, 100 µL RFAD içinde süspande edilmiş 2,5 × 10⁵ MTEC'i her bir iskelenin üzerine ekleyin ve ko-kültürleri 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, besiyerini mililitrede 250 ünite aprotin içeren taze besiyeri ile değiştirerek dört ila yedi gün daha kültüre edin.Kültür sonunda m Texs gelişimini immünohistokimya ile değerlendirmek için, bir pens yardımıyla iskele dermal eşdeğerini her birinin filtresinden ayırın. OTC'leri OCT bileşiğine yerleştirin ve gömün. O-T-C-R-N-A'yı izole etmek için OTC'leri sıvı azot üzerinde gaz fazında dondurun.İskele dokusunu filtrelerden ayırdıktan sonra, OTC'leri parçalara bölmek için bir bistüri kullanın ve parçaları bir mililitre denatüre çözelti içeren iki mililitrelik RNA içermeyen bir tüpe aktarın. Bir fast prep cihazı kullanarak, OTC'leri 6,0 hızda, her seferinde 30 saniye olacak şekilde iki kez mekanik olarak parçalayın; her parçalama işlemi arasında buz üzerinde iki dakikalık bir dinlenme süresi bırakın. Ardından, üretici tarafından tarif edilen şekilde, asit guanidinyum tiyosiyanat fenil kloroform ekstraksiyonu kullanarak RNA'yı izole edin.OTC'leri akış sitometrisi ile analiz etmek için membranı çıkarın ve iskelesini fibrin fibroblast mtech jelinden ayırın. Ardından, jeli az önce gösterildiği gibi bir skapel ile kesin. Dokuyu bir faks tüpüne aktarın.İki mililitre kollajenaz ezmesi eklemeye devam edin. Ardından tüpü, manyetik karıştırmalı 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosuna 20 dakika boyunca yerleştirin. Doku tamamen sindirilene kadar her beş dakikada bir pipetle karıştırın.Elde edilen hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir süzgeçten filtreleyin ve hücreleri gösterildiği gibi uygun antikorları kullanarak boyayın. MTS'ler, keratin 14 ekspresyonları ile tanımlanabilir, bu da onları menton pozitif fibroblastlardan kolayca ayırt etmeyi sağlar. İlginç bir şekilde, olgunlaşmamış ve olgun M Tex'ler kültürde farklı ancak yüksek derecede tekrarlanabilir büyüme modelleri sergiler.Örneğin, olgunlaşmamış CD 80 D düşük M Tex'ler tipik olarak fibroblastlarla yakın temas halinde çift katmanlar oluştururlar. CD 80 D yüksek MTS'ler fibroblastlar tarafından sınırlandırılmış kompakt hücre agregatları oluşturma eğilimindeyken, mtech alt kümeleri, EDU inklüzyonlarının kanıtladığı üzere, gösterilen 3D OTC koşulları altında sadece hayatta kalmakla kalmaz, aynı zamanda prolifere olurlar. İlginç bir şekilde, CD 80 düşük MT tech'ler, rankl varlığında daha yüksek bir hızda prolifere olurlar.CD 80 yüksek MT tekn.leri için durum bunun tersiyken, bu videoyu izledikten sonra 3D OTC'ler kullanılarak MT tekn.lerinin nasıl kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, tekn. diferansiyasyonu ve PGE bakımı ile indüksiyonu açısından 2D kültür sistemlerini kullanmaktan çok daha üstündür ve çeşitli parametrelerin incelenmesi veya manipüle edilmesi potansiyeline sahiptir.

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video hazırlanması 2-dGuo tedavi timus kültürler gösterilmiştir reaggregate.

Thymus Kültürler Reaggregate

Bu video, diseksiyon ve fetal timus çıkarılması de 2-dGuo ile tedavi edilen timus ex vivo kültürlerin hazırlanmasında gösteriyor.

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

Bu video, üç boyutlu bir timik kültür sistemi kullanarak iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinden fonksiyonel antijene özgü T hücreleri oluşturmak için bir protokolü gösterir. iPSC'den türetilmiş olgunlaşmamış T hücrelerinin endojen lenfosit tükenmiş fareler fetal timik loblarla birlikte kültürlenmesi, T hücrelerinin CD8αβ + MHC sınıf I + iPSC'den türetilmiş timik göçmenler (iTE'ler) oluşturmak üzere başarılı bir şekilde olgunlaşmasıyla sonuçlandı.

iPSC'den türetilmiş timik göçmenler oluşturmak için üç boyutlu timik kültür sistemi

Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Bu akış sitometrisi ile bir arada, T hücrelerinin gelişmekte olan pozitif ve negatif seçim modeli için kullanılabilir, timik dilimlerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Timik dilimler de timosit göç, yerelleşme yerinde analizi için uyarlanmış ve immünfloresans ve iki foton mikroskobu ile sinyal olabilir.

Hazırlık ve Organotipik Timik Dilim Kültürler Uygulamaları

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Burada, timik epitel hücresi (TEC) olgunlaşmasını ve uzun süreli bakımı ve ayrıca in vitro timopoezi desteklemeyi amaçlayan 3D fibrin hidrojellerde büyütülen insan iPSC'den türetilmiş timus organoidlerinin oluşumu için bir protokol açıklıyoruz.

Üç Boyutlu Fibrin Hidrojellerinde İnsan Timus Organoidlerinin Oluşumu

CD8 T hücresinin farklılaşmasını ve işlevini in vitro incelemek için, CD8 T hücreleri fareden izole edilip önceden oluşturulmuş enfekte fare vajinal epitelyal organoidleriyle uzun süreli birlikte kültürlenebilir. Burada, bu süreci tanımlıyoruz ve ortak kültür sırasında yerleşik hafıza T hücresi belirteçlerinin edinilişini değerlendiriyoruz.

In Vitro Epitelyal organoid-T hücre ko-kültür sistemi kullanılarak yerleşik bellek CD8 T hücresi farklılaşması

Keşfedin medüller timik epitel hücrelerinin 3D organotipik kültürde proliferasyon ve farklılaşmasını. Bu yöntem, promisküöz gen ekspresyonunun korunmasını sağlayarak immunoloji araştırmalarını geliştirir.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Daha fazla video keşfet