Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

Bu video, zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) kullanarak bir stereo mikroskop altında doku onarım dinamiklerinin nasıl yakalanacağını gösteren bir yöntemi sunmaktadır. Bu işlem, öncelikle zebra balığı embriyolarının, kuyruk yüzgecinin amputasyonların kolayca gerçekleştirilebileceği bir boyuta yeterince ulaştığı larva aşamalarına kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Bu durum genellikle yumurtadan çıkış sonrası aşamada sağlanır.

İkinci adım, bir şırınga iğnesi kullanarak kuyruk yüzgecinin ampute edilmesidir. Üçüncü adım, larvaların bir görüntüleme haznesine yerleştirilmesi ve bir stereo mikroskop altında zaman atlamalı (time-lapse) bir video çekilmesidir. Son adım ise Bit Plains S veya açık kaynaklı ImageJ gibi görüntüleme analiz yazılımları kullanılarak kuyruk yüzgeci rejenerasyonunun nicelleştirilmesidir. Merhaba. Laboratuvarım, model olarak zebra balığı kullanarak yara iyileşmesi ve doku rejenerasyonu üzerine çalışmalar yürütmektedir.

Bugün, parlak alan stereo mikroskopisi kullanarak bu süreçlerin dinamiklerini gerçek zamanlı olarak yakalayan bir yöntemi göstereceğiz. Bugün, zebra balığı larva kuyruk yüzgecini kullanarak doku rejenerasyonunun erken süreçlerini yakalayan bir yöntemi göstereceğiz. Sunulan görüntüleme yöntemi, zaman atlamalı görüntüleme yeteneklerine sahip herhangi bir stereo mikroskoba kolayca uyarlanabilen basit bir mikroskop düzeneğinde, tüm doku ölçekli davranışların gözlemlenmesi ve analiz edilmesi için bir fırsat sunmaktadır.

Öyleyse başlayalım. Zebrafishlerin larva aşamasına kadar büyütülmesi. Kuyruk yüzgecindeki yara onarımı, kuyruk yüzgecinin bu süre zarfında yeterince gelişmiş olması ve amputasyonların omuriliğe veya diğer dokulara zarar vermeden kolayca gerçekleştirilebilmesi nedeniyle, kuluçka sonrası aşamalardan sonra en iyi şekilde gözlemlenebilir.

Yumurtaları yakın bir konumda toplayın ve bir gece boyunca 28 °C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi sabah, ölü embriyoları uzaklaştırın ve %0,03'lük anlık okyanus akvaryum tuzu çözeltisi içeren embriyo medyumu ile durulayın. Larvaların pigmentasyonunu önlemek için gerekirse kaba %0,003'lük fenotirozin içeren embriyo medyumu ekleyin.

Bu gösterim için, larvalar kons preparatlarından çıktığında, embriyoların inkübatörde döllenmeden sonra iki gün boyunca gelişmelerine izin veriyoruz. Bu adımda, görüntüleme odasının oluşturulması için iki yöntem sunuyoruz. Birinci yöntem, herhangi bir hırdavatçıdan temin edilebilen, içme suyu kalitesinde PVC veya Teflon borulardan yapılmış bir görüntüleme odasını içerir.

Lamel tutturma için uygun boyuta sahip olduğundan, 25 mm dış ve 20 mm iç çaplı boru kullanın. Boruyu, mümkün olduğunca eşit olacak şekilde 10 mm kalınlığında halkalar oluşturacak şekilde kesin. Kenarları düzeltmek için zımpara kağıdı kullanın ve ardından su ile etanol ile durulayın.

Haznenin hava ile kurumasını bekleyin. İkinci yöntem, önceden üretilmiş mat teknoloji cam tabanlı, cam üstlü bir görüntüleme haznesi kullanmaktan veya küçük bir Petri kabından görüntüleme haznesi yapmaktan oluşur. Kendi görüntüleme haznenizi yapmak için, 35 veya 50 milimetrelik bir Petri kabı kullanın ve kapağına 10 milimetrelik bir delik açın.

Ardından, lamelin dış kısmına silikon gres uygulanır ve montaj aygıtının sıkıca tutunmasını sağlamak için temiz bir pipet ucu yardımıyla 25 by 25 milimetrelik kare veya yuvarlak bir lamel dış kısma sabitlenir. Görüntüleme prosedürü sırasında, lamelin iç kısmına ince bir plastik ağ yerleştirin. Bu işlem, ağı iç halka çapındaki boyutta kestikten sonra ağın ortasına larvaların boyutunun yaklaşık üç katı büyüklüğünde küçük bir dikdörtgen keserek gerçekleştirilebilir.

Yaralanma öncesi larvaların montajı ve görüntülenmesi. Bu adım, yüzgeç rejenerasyonunun daha sonraki nicelleştirilmesi için uygundur. Öncelikle, örneğin immobilizasyonu için embriyo ortamında %0,5'lik düşük erime noktalı agar çözeltisi hazırlayın ve anestezi altındaki larvayı 42 °C'de tutulan agar çözeltisine aktarın.

Bir ısıtma bloğu içinde, larvaları bir damla agros ile küçük bir Petri kabına aktarın ve larvaları yan tarafına yerleştirin. Kapaklı bir mikro yükleyici uç kullanarak agrosun katılaşmasını sağlayın ve trica solüsyonu ekleyin. Daha sonra kullanılacak olan stereo mikroskoba geçiniz.

Zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) için, gösterim amacıyla bir zeiss discovery V 12 stereo mikroskop ve Axio vision yazılımı kullanıyoruz. İlk olarak, görüntüleme için uygun objektif ve büyütmeyi seçerek mikroskop ayarlarını yapın. Ardından, alvis yazılımındaki mikroskop üzerinden kamera algılama modunu seçin.

Larvayı ekranda görüntülemek için canlı modu seçin. Parlaklığı otomatik olarak belirlemek ve mikroskobun transillüminasyon tabanındaki kontrastı manuel olarak ayarlamak için özellikler penceresini açın. Larvaları görüş alanının dışına çıkarın ve gölgelendirme düzeltme özelliğini seçin.

Arka plan gürültüsünü minimize etmek için larvaları tekrar görüş alanına yerleştirin ve bir fotoğraf çekin. Yaralama işlemine hazırlanmak için görüntüyü kaydedin. Önce baş kısmındaki aerosları sıyırarak larvaları aeroslardan ayırın.

Bu işlem, başın kalan aeros amputasyon assay'inden nazikçe çekilmesiyle larvaların aeros'tan kayarak çıkabilmelerini sağlar. Anlık okyanus tuzu çözeltisi kullanarak %1,5'luk bir aeros plakası hazırlayın. Stereomikroskop altında larvaları yan şekilde katılaşmış aeros üzerine yerleştirin ve kuyruk yüzgecinin distal kısmını 23 gauge şırınga iğnesi ile ampute edin.

Larvaların zaman aşımı (time-lapse) görüntüleme için sabitlenmesi. İki farklı zaman aşımı görüntüleme yöntemi sunacağız. İlk yöntemde, larvaların sabitlenmesinin ardından, oda halkası (chamber ring) içerisinde nasıl görüntüleneceğini göstereceğiz.

Distal kuyruk yüzgecinin etrafında katılaşmış agrozları, kapaklı bir mikro yükleyici pipet ucuyla dikkatlice kazıyın. Bu, uygun yara iyileşmesi veya doku rejenerasyonu sağlar. Dokuyu sabitlemeden, yüzgece tekrar tekrar zarar vermemeye çalışın. Bu prosedür sırasında, eski solüsyonu değiştirerek görüntüleme işlemini engelleyen istenmeyen kalıntıları odağdan uzaklaştırın.

Taze Trica solüsyonu kullanarak, haznenin üst kısmına silikon gres sürün ve hazne halkasını taze trica solüsyonu ile doldurun. Hazneyi kapatmak için üst kısma bir lamel yerleştirin (yöntem iki). Bu yöntemde, cam kapaklı bir Petri kabındaki larvaların nasıl görüntüleneceğini göstereceğiz.

Larvaları kapak üzerine, lamel üzerine sabitleyin ve kapağı trica solüsyonu ile doldurun. Kuyruk yüzgecindeki agrosları kazıyarak temizleyin.

Ardından, alt haznenin üst kenarına silikon gres uygulayın ve hazneyi trica çözeltisiyle doldurun. Trica çözeltisini kapaktan dikkatlice süzün ve larvayı alt haznedeki trica çözeltisine daldırmak için kapağı hafif bir açıyla ters çevirin. Hava boşluklarını önlemek için, 28 °C'lik uygun sıcaklığın korunduğundan emin olmak amacıyla hazne silikon gres ile kapatılarak zaman ayarlı görüntüleme yapılacaktır.

Yalıtım için karton ve balonlu naylondan yapılmış, ısı kaynağı olarak ise tavuk yumurtası inkübasyonunda kullanılan telli bir kubbeden oluşan ısıtmalı bir inkübasyon odası hazırlayın. İnkübasyon odasını mikroskobun etrafına yerleştirin ve sıcaklığı 28 °C olarak ayarlayın. Yaklaşık 10 ila 20 dakika boyunca veya sıcaklık stabilize olana kadar, ısıtmalı inkübasyon odasının ön kısmını açın ve görüntüleme odasını mikroskobun üzerine yerleştirin.

Lamelli objektife bakacak şekilde yukarıya doğru yerleştirin. Görüntüleme prosedürü boyunca yüzgecin büyüme ve rejenerasyonunun kaydedilebilmesini sağlamak için, görüş alanının üçte ikisinin boş kalacağı şekilde larva yüzgecini konumlandırın. Yazılımın 60 çok boyutlu kazanım penceresinde larvaları yeniden konumlandırmaya gerek kalmadan, Zack sekmesindeki Z stack ve time-lapse seçeneğini ve dilim modunu (slice mode) seçin.

Kesit kalınlığını seçin ve ardından başlat-durdur modunu belirleyin. Time-lapse tablosunda yığının üst ve alt konumlarını tanımlayın. Filmin aralığını ve süresini seçin, ardından kaydı başlatmak için başlat düğmesine basın.

İlk bir saat içinde, larvaların sınırlarını kontrol edin. Gelişim veya agar kompozisyonundaki farklılıklar nedeniyle kayma meydana gelmiş olabileceği için, gerekirse larvaları zaman içinde yeniden konumlandırın. Time-lapse kaydının sonunda dosyayı kaydedin ve ardından post-processing (son işlem) ve kantifikasyon adımları ile veri analizine geçin.

Bu bölümde, imas yöntemiyle elde edilen verileri analiz etmenin çeşitli yollarını tartışıyoruz. İlk olarak, imas yazılımı ile yüzgeç büyümesinin nasıl belirleneceğini ele alacağız. Amaris yazılımında zaman dizilimli (time-lapse) videoyu açın ve dosyaları MRS dosya formatında kaydedin.

Yazılım performansını artırmak için, videoyu bir projeksiyon olarak görüntülemek üzere ortogonal görünümü seçin. Kanat uzunluğunu ölçmek için sol üst araç çubuğundaki yeni ölçüm noktaları ekleme seçeneğini belirleyin. Görünür istatistik değerleri listesini yapılandır kısmından, çizgi modunda görüntülenecek istatistik değerlerini seçin.

Ayarlar sekmesi altında, etiketler özelliklerinden çiftleri seçin, noktalar A ve B arasındaki mesafeyi ölçüm çizgisinin yanında görüntülemek için isim ve mesafe seçeneklerini belirleyin, düzenleme moduna geçin ve distal yüzgeçteki ilk noktayı seçmek için shift tuşuna basılı tutun. Ardından, akorun distal ucundaki ikinci noktayı seçmek için aynı yapılandırmayı kullanın. Mesafe görüntüde görüntülenecek ve istatistikler sekmesi altından dışa aktarılabilecektir.

Sağ alttaki tümünü dışa aktar disk butonunu seçerek işlemi gerçekleştirin. Ölçüm noktaları seçeneğine alternatif olarak, dilim görünümü modunda mesafeleri ölçmek için dilim görüntüleyici kullanılabilir. İstenen konuma kaydırın ve farenin sol tuşuyla birinci ve ikinci konumların üzerine tıklayın; mesafe görüntülenecektir.

Ancak bu seçenek, veri dışa aktarımına izin vermemektedir. Şimdi, açık kaynaklı Image J yazılımını kullanarak yüzgeç alanının nasıl belirleneceğini kısaca ele alacağız. Zeiss Axio vision dosya formatını tanıyan bir eklenti kullanarak TimeLapse filmini Image J'de açın.

Alternatif olarak, sıkıştırılmamış bir TIFF dizisi yükleyin. Bu işlem, dosya bilgileri içerisinde korunmamışsa, mesafe ve pikseller ile bilinen mesafeyi tanımlamak için "analyze" (analiz) altındaki "select set scale" (ölçek belirle) kısmından dosya bilgilerinin kaydedilmesini sağlayacaktır. Ayrıca, birim uzunluğu mikrometre olarak ayarlayın.

Araç çubuğundan serbest el seçim aracını seçin ve sol fare düğmesini basılı tutarak yaranın çevresini çizin. Yara kenarları boyunca çizim yaparken.

Yara temsilci sonuçlarının alanını görüntülemek için analiz altındaki ölçüm seçeneğine tıklayın. Yüzgecin amputasyonu, amputasyonu takip eden 36 saatlik süre boyunca kısmi bir rejenerasyona yol açar. Yüzgeç alan ölçümleri, yüzgeç amputasyonunun, muhtemelen hücre ölümü nedeniyle amputasyon sonrası yaklaşık 14 saate kadar yüzgeç dokusunda bir azalmayı tetiklediğini ve bunu ince bir rejenerasyon uzunluğunun izlediğini göstermektedir.

Ampute edilen ve rejenerasyona uğramış yüzgecin karşılaştırılması, 36 saat içinde yüzgeç uzunluğunda 2,48 katlık bir artış olduğunu göstermektedir. Amputasyon, başlangıçta, amputasyon yarasından dışarı çıkan yüzgeç kıvrımı hücrelerinde bulunan aktin miyozin kabloları aracılığıyla gerçekleşen ve sonrasında temizlenen kontraksiyonlarla karakterize bir büzgü kordonu etkisini tetikler. Vücut uzunluğu başlangıçta artar, ancak yüzgeç rejenerasyona uğramaz.

Erken evrelerde, amputasyondan yaklaşık 14 saat sonra yüzgeç, proksimalden distal konumlara doğru uzamaya başlar. Özetle, sonuçlarımız amputasyonun yara kontraksiyonunu tetiklediğini ve bunun hücre ekstrüzyonunu teşvik etmek için gerekli olabileceğini göstermektedir.

İşlem tamamlandığında, yüzgeç yeniden üretilmeye başlar. Gelişimsel yüzgeç büyümesinin gerçekleştiği görülür. Bu süreçten bağımsız olarak, yaşayan zebrafish larvalarını kullanarak doku onarımının dinamik süreçlerinin gözlemlenmesine olanak tanıyan bir yöntem sunduk.

Bu prosedür, sonucu optimize etmek amacıyla test ettiğimiz belirli aşamalar gerektirmektedir. Sunulan görüntüleme yönteminin belirgin bir avantajı, CCD kamera ve TimeLapse yazılımı ile donatılmış herhangi bir stereo mikroskoba kolayca uyarlanabilmesidir. Ayrıca, daha maliyetli olan konfokal görüntüleme sistemine düşük maliyetli bir alternatif sunmaktadır.

Bu yöntem floresan veya hücre deteksiyonu kullanmasa da, yara onarımı ve rejenerasyon süreçlerini hücre altı çözünürlükte daha ayrıntılı gözlemlemek için parçalanma kontrolü sağlayan otomatik bir sistem ve görüntüleme sonrası dekonvolüsyon yazılımı kullanılarak bu tür uygulamalara genişletilebilir. Bu yöntem, öğrencilerin doku onarımı ve rejenerasyonunun temelini oluşturan temel biyolojik süreçleri daha iyi anlamalarını sağlayabilir. Optik berraklık, embriyonik ve larval zebrafish'lerin kullanım kolaylığı ve sistemin herhangi bir stereo mikroskoba uyarlanabilirliği, bu yöntemi sınıf ortamında temel omurgalı biyolojisi eğitimi için uygun hale getirmektedir.