Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, iki foton mikroskopisi kullanarak taze izole edilmiş bir damardaki kalsiyum veya nitrik oksit miktarını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle damarın mekanik olarak izole edilmesi ve hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından damar, kalsiyum işaretleme boyasında veya onik asit içeren bir O işaretleme boyasında inkübe edilir.

Ardından, iki foton görüntüleme sırasında stabil bir görünüm sağlamak için kap, bir ızgara ve pinler yardımıyla silikon kaplı bir kaba sabitlenir. Son olarak, iki foton görüntülemesi gerçekleştirilir ve sonuçlar nicelleştirilir. Bu video, hücre dışı kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklere yanıt olarak izole kan damarlarının endotel hücrelerindeki hücre içi kalsiyum sinyalleşmesinin artışını göstermektedir.

Sonuç olarak, bu yöntem araştırmacıların taze izole edilmiş bir kan damarının endotel hücrelerindeki veya düz kas hücrelerindeki kalsiyum veya nitrik oksit değişimlerini izlemesine olanak sağlayacaktır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vasküler dokulardaki hücre içi süreçlerin daha iyi sinyal çözünürlüğü ve hassas ölçümlerinin sağlanabilmesidir. Burada bu teknoloji, izole edilmiş içi boş bir organ üzerindeki tekil hücrelerde kalsiyum geçici değişimini ve nitrik oksit üretimini ölçmek için geometrik olmayan klasik zarlarla kombinasyon halinde uygulanmıştır.

Bu tekniğin, farklı vasküler hücre tiplerindeki hücre içi kalsiyum ve oksit seviyelerini düzenleyen mekanizmaya dair bilgilerimizi geliştirmeye yardımcı olacağına inanıyoruz. Canlı hücrelerin, özellikle kan damarları gibi sağlam dokulardaki iki foton uyarmalı mikroskopi görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü sinyal ve düşük odak dışı arka plan floresansı avantajlarını sunar. İki foton uyarımının dar lokalizasyonu, dokuda tek bir odak hacmini aydınlatarak odak dışı absorbsiyonu önemli ölçüde azaltır ve ışık saçılmasını düşürür; bu da kolajen ve elastin lifleri içeren yüksek otofloresan dokularda florofor dinamiklerini görüntülememize olanak tanır.

Sıçan aortası izole edildikten sonra, diseksiyon mikroskobu altındaki metin protokolüne uygun olarak, aortadaki yağ ve bağ dokusunu temizlemek için ince uçlu pens ve mikro makas kullanın. Organ temizlendiğinde, boylamasına kesin ve daha sonra kullanmak üzere fizyolojik tuz çözeltisine aktarın. Yükleme kokteylini hazırlamak için, 450 µL kalsiyum içermeyen PSS'ye yedi µL hazır 1 mM fluo-4 AM boyası ve DMSO çözeltisi ekleyin.

Ardından, asetil metil esterlerinin dağılmasına yardımcı olmak ve kalsiyum boyasının yüklenmesini iyileştirmek için yükleme kokteyline DMSO bazlı olmayan %10'luk onik asit çözeltisinden 40 µL ekleyin. Diseke edilmiş aortaları, yükleme kokteyli içeren 500 µL'lik tüplere yerleştirin. Tüplerin üzerini folyo ile kapatın ve oda sıcaklığındaki döner bir çalkalayıcıda bir saat boyunca bekletin.

Aort dokusunu silikon kaplı bir kabın yüzeyine sabitlemek için metin protokolünü takip ettikten sonra, kabı dik bir iki foton mikroskobunun burun parçasının altına yerleştirin; numunenin üzerine 25x su daldırma objektif lensini takıp konumlandırın. Mikroskop portuna uygun bir emisyon filtresi yerleştirin. Yazılımı kullanarak iki foton kızılötesi lazeri aktifleştirin ve iletilmiş ışık altında lazer uyarımını 820 nanometreye ayarlayın. Kaba objektif ayarını kullanarak aortu bulun ve objektifi endotel yüzeye odaklayın.

Mikroskobu iki foton lazer tarama moduna getirin ve eksitasyon lazerinin mod kilitli olduğundan emin olun. DS olmayan taranan dedektörler, yaklaşık %5 ila %10 lazer gücü ile devreye alınır. Canlı taramayı başlatın.

Son olarak, endotel veya düz kas hücrelerini odağa getirmek için objektifi ayarlayın. Deney protokolü metnine göre ardışık görüntüler toplayın. Görüntü işleme ve hesaplamaları gerçekleştirmek için görüntüleri, meta verileri içeren bir formatta kaydedin; genel kamu lisansı altında yayınlanan Fiji görüntü işleme paketini indirin ve kurun.

Yazılımı kullanarak bir görüntü dosyasını açın. Ardından, istendiğinde, Fiji programı içindeki veri analizi için yalnızca floresan kanalları kullanmak üzere iletilen ışık ve floresan kanallarını ayırın. Analiz sekmesine tıklayın ve araçlar seçeneğine kadar aşağı kaydırın.

Ardından ROI yöneticisi sekmesine tıklayın, yeni bir pencere açılacaktır. Daha sonra, analiz sekmesi altında, ölçümleri ayarla seçeneğine tıklayın ve ilgilenilen özel ölçümleri seçin. Kalsiyum geçici değişim ölçümleri için.

Ortalama gri değer seçeneğini kullanın. Ardından dairesel izleme aracıyla ilgi bölgelerini izlemeye başlayın ve ROI yöneticisinde seçilen her ROI için ekle düğmesine tıklayın. İlgilenilen tüm hücreler izlendiğinde, ROI yöneticisindeki daha sekmesi altında çoklu ölçüm seçeneğini belirleyin.

Son olarak, ölçümleri doğrudan kaydedin veya bir hesap tablosuna kopyalayıp yapıştırarak metin protokolüne uygun şekilde hesaplamaları gerçekleştirin. Bu videoda açıklanan protokol kullanıldığında, aortun endotel hücreleri, şekilleri ve güçlü floresan sinyalleri sayesinde kolayca tespit edilebilir. Düz kas hücreleri de endotel hücrelerle aynı alanda görünür olacak ve bu durum, iki hücre tipinin farklı agonist ve stimülilere nasıl ortak ancak bağımsız şekilde yanıt verdiğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayarak bu yöntemin kullanışlılığını ortaya koyacaktır.

Asetilkolin veya endotelin potent bir kalsiyum bağımlı vazodilatörü olan CHA'ya verilen yanıtların ölçümleri burada gösterildiği gibi belirlenmiştir; CHA eklenmesinin ardından, yalnızca PSS içeren hücrelere kıyasla endotel hücre floresanında artış görülür; bu durum, hücre içi kalsiyum içeriğinin hızla arttığını ve ardından yavaşça bazal seviyeye döndüğünü gösterir. Bu protokol, endotel nitrik oksit üretiminin saptanması için de uygundur. Bu deneyde, aortik endotel hücreleri DAF FM DA asetat ile yüklenmiştir.

Dye ENO üretimi, CH stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyuma bağımlı bir şekilde artmıştır ve bu yanıt, endotelyal OCH sentaz inhibitörü L ismi ile bloke edilmiştir. Bu yöntem, kardiyovasküler fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Burada açıklanan deneysel prosedürün, mevcut çeşitli genetiği değiştirilmiş hayvan modelleriyle birlikte kullanılması, temel ve translasyonel araştırmalarda iki foton mikroskobisinin FAR FSA uygulaması için yeni perspektifler sunmaktadır.

Bu yaklaşımın kullanılması, kan damar hücreleri içindeki spesifik hücre içi sinyal yollarına dair derinlemesine bir anlayış ve mekanistik bir bakış açısı sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, taze izole edilmiş kan damarlarının tekil hücrelerindeki kalsiyum ve nitrik oksit seviyelerinin gerçek zamanlı izlenmesi için bu tekniğin nasıl uygulanacağını öğreneceksiniz.