Name: Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu İn Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Keşfedin, insan nötrofillerinden yüksek verimli NET ölçüm yöntemlerini. Bu teknik, inflamasyon ve bağışıklık hastalıklarında nötrofil ekstraselüler tuzak oluşumunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

İnsan nötrofillerini izole etme konusundaki çalışmalarımıza sürekli destek verdikleri için Georgia Üniversitesi Sağlık Merkezi laboratuvar personeline özel teşekkürler. Bu çalışma, UGA Araştırmadan Sorumlu Başkan Yardımcılığı Ofisi tarafından sağlanan Dr. Rada'nın başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.

Georgia Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu sağlıklı gönüllülere (UGA # 2012-10769-06) periferik kan toplamak için insan konu çalışmayı onayladı. 5,7,8 Gönüllüler kan beraberlik önce gerekli bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı. Bu makalede yapılan araştırmalar Helsinki Bildirgesi&#39;nin insan denekler üzerinde tıbbi araştırmalar için etik kurallarına uygun olduğunu. Periferik İnsan Kanı adlı Nötrofiller 1. izolasyonu (Şekil 1) Not: Periferik kan nötrofillerin izole edilmesi için çeşitli yollar vardır. Aşağıdaki protokol, bir imkanı sağlar. Bu protokol, dış uyarım üzerine NET&#39;leri salabilen aktif olmayan, insan nötrofil sayıda verir. 40 ml delme ile sağlıklı gönüllülerden elde edilen tam kan kullanın. 7,9 <ol><li> iki adet 50 ml konik tüpler içine kısım 20 ml kan. 10 mi% 6 Dekstran ekleyin. hafifçe karıştırın. </li><li> 20 dakika transferi lökosit ric sonratemiz 50 ml&#39;lik konik tüpler içine herhangi peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alarak ve steril PBS ile doldurmak olmadan h üst faz. </li><li> 400 x g&#39;de 10 dakika santrifüje. 4 ml süspanse pelet PBS steril. </li><li> % 85 5-adım Percoll degrade hazırlayın -80% -75% -70% -65% iki 15 ml konik tüpler ve katman 2 ml lökosit süspansiyonu her degrade üstünde. </li><li> frenler kapalı olarak 30 dakika boyunca Santrifüj 800 xg. </li><li> tüm hücreler% 75 /% 80 tabakalarında (nötrofilleri) ve% 70 /% 75 arayüzü toplayın. </li><li> PBS içinde iki kez (350 xg, 10 dakika, RT) hücre yıkayın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li></ol> Bir Mikroplaka florimetrede Kullanarak Hücre dışı DNA Yayın Kinetiği 2. Ölçüm Not: Bu yöntem, bir zara-geçirmeyen DNA bağlayıcı 96 oyuklu bir mikro-plaka biçiminde DNA serbest gösterge boya (Şekil 2) arasında floresan değişikliklerin ölçülmesini sağlar. <ol><li> + Deney ortamı içinde nötrofil bir süspansiyonu (HBSS hazırlanması2 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda,% 1 (h / h) otolog serum + 5 mM glükoz). </li><li> Zarın geçirgenlik göstermediği bir DNA bağlayıcı boya 5 umol / L ekleyin. hafifçe karıştırın. </li><li> Kısım İnsan nötrofilleri (50 ul / oyuk) 96 çukurlu mikrolevhaların siyah şeffaf dibine. Emin deney ortamı kuyunun tüm alt kapsar emin olun. Değilse, yan hafifçe plaka dokunun. </li><li> 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle plaka içeren nötrofillerin ısıtın. </li><li> Bu sırada nihai konsantrasyonlarının iki katı uyaranların çözümler hazırlamak kullanılmak üzere (37 ° C sıcak bir deney ortamı içinde). Pozitif NET kontrolü maksimum NET salınımını tetiklemek için 4 saat boyunca 100 nM forbol-miristat-asetat (PMA) insan nötrofilleri kullanmak spontan NET oluşumu düşük 5,8 kalır. 4 saat boyunca 5,8 PMA uyarımı maksimal NET salınımını sağlar. </li><li> Ölçme (4 saat, 37 ° C, uyarma için 530 nm ve emisyon 590 nm) için mikroplak florimetresi hazırlayın. &lt;/ Li&gt; <li> 50 ul nötrofil süspansiyonlar 50 ul uyaran çözeltisi ilave edilerek nötrofillerin uyarırlar. Maksimal bir DNA salma sinyalinin ölçülmesi de bir 0.5 ug / ml saponin kullanın. </li><li> okuyucusunda plaka koyun ve hiçbir çalkalanarak her 2 dakikada 4 saat floresan değişiklikleri ölçer. </li><li> Veri analizi için, zamanla floresan normalize artışlar hesaplar. <ol><li> Saponin dahil olmak üzere tüm kuyuları için son nokta değerleri çıkarınız, taban floresans (Şekil 2A, B). saponin floresan artış en yüksek sinyal olmalıdır. Bu &quot;olarak maksimum DNA serbest&quot; (Şekil 2A) olarak ifade edilir. </li><li> maksimal DNA salınımı ile bilinmeyen numunelerin floresan artışlar bölerek bilinmeyen örneklerinde DNA sürümü yüzdelerini hesaplayınız. </li><li> Çoğaltır ortalama sonuçları ve &quot;maksimal DNA sürüm%&quot; (Şekil 2C) olarak sunuyoruz. </li></ol></li></ol> NET Formu 3. kantitasyonuMPO-DNA ve HNE-DNA ELISA tahlilleri ile tirme Not: laboratuvarımızda Bu tahliller, modifiye edilmiş (MPO-DNA) ya da kuruldu (HNE-DNA) MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri seviyeleri ölçülerek NET oluşumu miktarının 5. <ol><li> Ceket 96 oyuklu yüksek bağlama gece boyunca antikorlarla (50 ul / kuyucuk) kapasitesi ELISA plakaları: Anti-MPO (1: 2000 seyreltme) ya da anti-HNE (1: 2,000). </li><li> PBS ile yıkayın ELISA plakaları, üç kez (200 ul / oyuk) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile% 5 BSA ve% 0.1 insan serum albümini ile bloke (200 ul / oyuk). PBS ile üç kez yıkanır. </li><li> Tohum 96 oyuklu mikro / göz 100 ul deney ortamı içinde 100,000 hücre yoğunluğunda nötrofiller ve NET oluşumunu uyarır. hücreleri inkübe: 37 ° C 4 saat. </li><li> iyice karıştırın, nötrofil Süpernatantları 2 U / ml DNaz ekleyerek sınırlı DNase sindirim gerçekleştirin. Oda sıcaklığında tutun. </li><li> 11 ul 25 mM EGTA (nihai konsantrasyon 2.5 mM) eklenerek 15 dakika sonra DNase durdurun. İyice karıştırın. SU toplayınTemiz mikrofuj tüpleri içerisinde pernatants. Spin örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücre enkaz kurtulmak için. Temiz mikrofuge&#39;de tüpler içine onların süpernatantlar aktarın. hazır olana kadar buz üzerinde saklayın. </li><li> önceden hazırlanmış &quot;NET standart&quot; bir kısım kullanın. Not: NET standardı en az 5 farklı, bağımsız insan vericilerden elde edilen PMA ile uyarılmış nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer bir karışımıdır. <ol><li> , Uzun bir süre aynı standart kullanmak toplamak ve her donörden nötrofil süpernatantlar büyük bir ses bölmeyin için. Örneğin PMA ile uyarılan nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer 2 ml toplama 200 alikotları 200 ELISA plakaları için yeterli (10 ul her) neden olur. NET standart karakterize eden veriler, Şekil 5&#39;de görülmektedir. </li><li> 4 saat boyunca 100 nM PMA insan nötrofilleri uyarır ve DNaz adımları 3,4-3,5 göre kendi süpernatanlanna sindirmek geçerlidir. </li><li> Toplama, havuz alikotu (10 ul) ve serbestze (-20 ° C), nötrofil süpernatanlar. </li><li> en az beş ayrı donörlerden elde edilen bir kısım / donör çözülme, &quot;standart NET&quot; hazırlamak için, bunları karıştırın ve buz üzerinde saklayın. </li><li> çözülmüş örnekleri atın ve bir sonraki deney için taze olanları kullanın. </li><li> PBS + EGTA NET-standart 2 seri seyreltme: 1 hazırlayın. </li></ol></li><li> DNase1-sindirilmiş örnekleri (standart ve bilinmeyen süpernatantlar) PBS + EGTA içinde 20-kat seyreltilir ve yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakaları üzerinde bunları kısım. </li><li> 4 ° C&#39;de gece boyunca ELISA inkübe edin ve PBS ile uygun üç kez yıkayın. </li><li> Algılama antikoru solüsyonu halinde (100 ul / oyuk): turp peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru (1: 500, fare). Karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS ile dört kez yıkamadan sonra, TMB peroksidazı substrat ekleyin: 100 ul / oyuk, 30 dak. Mavi bir renk peroksidaz aktivitesi (mevcut NET) için bir göstergesidir. </li><li> de 100 ul / 1 M HCI ilave ederek reaksiyonu durdurun.mavi çözümler sarı (Şekil 5A) dönecek. </li><li> bir mikro-fotometre kullanılarak 450 nm&#39;de absorbansı okumak. </li><li> Veri analizi için, NET standardına göre MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri miktarını hesaplayın. <ol><li> bütün örneklerden, deney ortamı GEÇMİŞİ optik yoğunluk değeri çıkarın. </li><li> Nispi net içeriği (Y-ekseni) (Şekil 5A) karşı seyreltilmiş standart numunelerin absorbans değerlerine (X-ekseni) çizilir. </li><li> Bu standart eğrinin nonsaturated aralığını kullanarak (Şekil 5A) (kullanılan yazılım en iyi üstel uyum kullanın) bir trend çizgisi kurmak. Bu eğilim çizgisinin denklemi NET&#39;ler miktarda nicel OD değerlerinin dönüşüm belirler. </li><li> NET-standart (Şekil 5A) yüzdesi olarak bilinmeyen numunedeki NET&#39;ler miktarda verecektir 3.13.3 den trend çizgisi denklemi içine bilinmeyenler ölçülen OD değerlerini yerleştirin. </li><li> Hesaplamakçoğaltır (üç kez) ortalamaları ve (Şekil 5C) &quot;MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri (standardın%) miktarı&quot; olarak son verileri sunmak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

NET&#39;ler NET&#39;ler edebiyat sürekli, biyoloji, mekanizma ve yönetmelik rollerine ilişkin birkaç önemli soru belirsizliğini koruyor onların keşfinden bu yana geçen on yıllar içinde genişleyen olmasına rağmen patojenleri öldürmek. 1 nötrofil hangi büyüleyici yeni bir mekanizma temsil etmektedir. Uygun metodoloji NET&#39;leri, bu çok benzersiz antimikrobiyal mekanizma ölçmek için geliştirilmiş olmalıdır. Bu makalede, bir yüksek verimli bir şekilde netler ölçmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. İlk...

NET oluşumu, nötrofillerin patojenlerle savaştığı yeni bir mekanizmadır. 1 NET'lerin çekirdeği nükleer DNA'dır. 1 Bu DNA ağı, nötrofil granül proteinleri ve histonlarla ilişkilidir. 1 NET oluşumunun ana formu, kromatin deyoğunlaşması, granüler ve nükleer zarların kaybolması, nötrofil elastazın çekirdeğe translokasyonu, histonların sitrülinasyonu ve son olarak DNA bazlı NET'lerin dökülmesi ile karakterize edilen nötrofillerin ölümünü gerektirir. 2 NET'ler çok çeşitli mikropları yakalar ve öldürür ve doğuştan gelen bağışıklık silahı repertuarının önemli bir parçasıdır. Bununla birlikte, kontrolsüz NET oluşumu çok sayıda otoinflamatuar hastalıkla ilişkilendirilmiştir. 3,4 Giderek daha fazla yerleşen ilgilerine rağmen, NET sürümünün mekanizması ve düzenlenmesi hakkında çok az şey bilinmektedir. 
NET salgılayarak ölen nötrofiller, apoptotik veya nekrotik nötrofillerden farklıdır. 3,5 NET salgılayan nötrofiller, NET oluşumu için karakteristik olan çeşitli özellikler gösterir. Granül bileşenleri NET'lerde DNA ile ilişkilidir. 1 Miyeloperoksidaz (MPO) ve insan nötrofil elastazı (HNE), dinlenme hücrelerindeki primer granüllerde bulunur, ancak NET'lerde DNA'ya bağlanmak için çekirdeğe translokasyon yapar. 1 MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri NET'lere özgüdür, apoptotik veya nekrotik nötrofillerde oluşmaz. 1,3,5 Kromatin dekondensasyonu, NETosis için tipik olan başka bir özelliktir. 2 NET salınımı ayrıca histonların peptidil aminidaz 4 (PAD4) ile sitrülinasyonunu gerektirir. 6 Sitrüline histonlar, NET salınımı geçiren nötrofillerin ayırt edici özellikleridir. 6
Burada, NET'leri yüksek verimli bir ölçekte ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan üç yöntem tanıtılmıştır. İlk tahlil, sahada farklı değişikliklerle kullanılmış ve hücre dışı DNA salınımını mikroplaka formatında kantitatif hale getirmiştir. İkinci ve üçüncü tahliller, NET'e özgü MPO-DNA ve HNE-DNA komplekslerini ölçerek NET'lerin doğrulanmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>Anti-İnsan Nötrofil Elastaz&nbsp; Tavşan Ab&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2.000x kaplamalı</td></tr><tr><td>Anti-Miyeloperoksidaz Ab (Tavşan)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2.000x kaplamalı</td></tr><tr><td>DNaz-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &# 181; Sindirim için kullanılan g/ml</td></tr><tr><td>20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ölümü tespiti ELISA Anti-DNA POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp;</td></tr><tr><td>Eon Mikroplaka Spektrofotometresi</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Hepsi Bir Arada mikroplaka yazılımı</td><td>Biotek</td><td></td><td>analitik aracı (ELISA)</td></tr><tr><td>Sytox turuncu</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>S11368</td><td>%0,2 nihai konsantrasyon/hacim</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>10 mM nihai konsantrasyon kullanın.</td></tr><tr><td>1 M glikoz</td><td>Sigma</td><td></td><td>5 mM nihai konsantrasyon kullanın.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Termobilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM son kullanılan</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>655061</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Konik tüpler 50 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8.5-9.5)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Sodyum Klorür, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dekstran</td><td>Spektrumu</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medya</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu tahlil plakası siyah plaka açık alt</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstraselüler dna yayın yüksek verimli Ölçme ve İnsan nötrofiller kantitatif net oluşumu<em&gt; İn vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Nötrofil granülositler, insan kanında en bol bulunan lökositlerdir. Nötrofiller, enfeksiyon bölgesine ilk gelenlerdir. Nötrofiller, fagositoz, degranülasyon ve nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu dahil olmak üzere çeşitli antimikrobiyal mekanizmalar geliştirdi. NET'ler, histonlarla süslenmiş bir DNA iskelesi ve miyeloperoksidaz (MPO) ve insan nötrofil elastazı (HNE) dahil olmak üzere çeşitli granül belirteçlerinden oluşur. NET salınımı, nötrofillerin karakteristik morfolojik değişikliklerini içeren ve DNA'larının hücre dışı boşluğa atılmasına yol açan aktif bir süreçtir. NET'ler mikroplarla savaşmak için gereklidir, ancak NET'lerin kontrolsüz salınımı çeşitli bozukluklarla ilişkilendirilmiştir. Klinik alaka düzeyi ve NET oluşum mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için, NET kantitasyonu yapabilen güvenilir araçlara ihtiyaç vardır. 
Burada, insan nötrofillerinden NET salınımını in vitro olarak değerlendirebilecek üç yöntem sunulmaktadır. Birincisi, zar geçirimsiz bir DNA bağlayıcı boya kullanarak insan nötrofillerinden hücre dışı DNA salınımını ölçmek için yüksek verimli bir testtir. Ek olarak, NET'e özgü MPO-DNA ve HNE-DNA komplekslerinin seviyelerini ölçerek NET oluşumunu ölçebilen iki başka yöntem daha tanımlanmıştır. Bu mikroplaka bazlı yöntemler kombinasyon halinde, insan nötrofillerinin NET oluşumunun mekanizmasını ve düzenlenmesini verimli bir şekilde incelemek için harika araçlar sağlar.

Bu yazıda rakamlar. Nötrofil izolasyon, deneysel prosedürler ve veri analizi açıklama ile mevcut temsilcisi sonuçları yöntemi tarif 1 insan nötrofil hazırlık ardışık adımları göstermektedir. Bu protokol nötrofil izolasyon tek olası yolu temsil eder. Bu stimülasyon üzerine NET&#39;leri salabilen nötrofillerin istirahat büyük miktarda verir. Floresan bazlı DNA salınım testi nasıl çalıştığını 2 gösterileri Şekil. İnsan nötr...

İnsan nötrofillerinden NET salınımını ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan yüksek verimli testler sunulmaktadır.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Bu prosedürün genel amacı, insan nötrofillerinden salınan nötrofil hücre dışı tuzaklarının (NETs) yüksek kapasiteli bir ölçekte miktarını belirlemektir. Burada sunulan yöntemler, insan nötrofillerindeki in vitro nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun mekanizması ve düzenlenmesinin incelenmesi yoluyla, inflamasyon alanındaki ve inflamatuar hastalıkların değiştirilmesine yönelik temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin uygulamaları, merkezi NET aracılı sinyal yollarının ve NET inhibitör veya NET stimülan moleküllerinin tanımlanmasını kapsamaktadır.Kandan nötrofilleri izole etmek için, 20 mililitre insan kanını 250 mililitrelik konik tüplere paylaştırın. 10 mililitre %6dekstran ekleyin, ardından nazikçe karıştırın ve çözeltilerin oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletilmesine izin verin. Lökosit bakımından zengin üst fazı dikkatlice temiz 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve tüpü üst seviyeye kadar doldurmak için steril PBS kullanın.Ardından örneği 400 ×g'de on dakika boyunca santrifüj edin ve peleti yeniden süspande etmek için 15 mL steril PBS kullanın. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Sonra, 215 mL'lik konik tüplerde %85, %80, %75, %70 ve %65'lik beş basamaklı Percoll gradyanları hazırlayın ve her gradyanın üzerine 2 mL lökosit süspansiyonu ekleyin.Ardından, gradyanları fren kapatılmış şekilde 30 dakika boyunca 800 ×g hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, %75-80 ve %70-75 arayüzlerindeki katmanlarda bulunan hücreleri toplayın. Hücreleri yıkamak için iki kez PBS kullanın ve ardından hücre sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanın.Hücre dışı DNA salınım kinetiğini ölçmek için, nötrofillerin analiz ortamı içerisinde mililitrede iki çarpı on üzeri altı hücre konsantrasyonunda bir süspansiyonunu hazırlayın. Membran geçirgen olmayan bir DNA bağlayıcı boya olan SYTOX orange'dan litre başına beş mikromol ekleyin ve nazikçe karıştırın. İnsan nötrofilleri, analiz ortamının kuyucuk tabanının tamamını kapladığından emin olarak steril 96 kuyucuklu siyah şeffaf tabanlı mikroplakalara paylaştırın.Eğer öyle değilse, plağın yan kısmına hafifçe vurun. Plağı 37 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Bu sırada, kullanılacak uyaranları içeren çözeltileri, son konsantrasyonlarının iki katı olacak şekilde 37 °C'deki analiz ortamını kullanarak hazırlayın.Pozitif NET kontrolü olarak, maksimum NET salınımını tetiklemek amacıyla insan nötrofillerini dört saat boyunca işleme tabi tutmak için 100 nanomolar phorbol myristate acetate veya PMA hazırlayın. Ardından, ölçüm için mikroplaka florometresini hazırlayın. 50 mikrolitre nötrofil süspansiyonuna 50 mikrolitre stimülasyon çözeltisi ekleyerek nötrofilleri stimüle edin.Maksimum DNA salınım sinyalini ölçmek için bir kuyucuğa 0.5 mg/mL nihai konsantrasyonda saponin ekleyin. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve çalkalamadan, dört saat boyunca iki dakikalık aralıklarla floresans değişimlerini ölçün. Verileri analiz etmek için, saponin içerenler de dahil olmak üzere tüm kuyucukların bitiş noktası değerlerinden bazal floresansı çıkararak zamanla meydana gelen normalize floresans artışlarını hesaplayın.Saponin floresansta meydana gelen artış en yüksek sinyal olmalıdır ve bu durum maksimal DNA salınımı olarak adlandırılır. Tekrarların sonuçlarının ortalamasını alın ve bunları maksimal DNA salınımının yüzdesi olarak sunun. MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA analizlerini kullanarak NET oluşumunu nicelleştirmek için, 96 kuyucuklu yüksek bağlama kapasiteli ELISA plakalarına anti-MPO veya anti-HNE yakalama antikorları ekleyin ve kaplama için gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, ELISA plaklarını üç kez yıkamak için kuyu başına 200 µL PBS kullanın. Ardından, kuyucukları oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke etmek için 200 µL %5 bovine serum albumin (BSA) veya %0,1 human serum albumin (HSA) kullanın. Bu sırada, bir 96 kuyucuklu plaka üzerine kuyu başına 100.000 hücre yoğunluğunda 100 µL analiz ortamında nötrofilleri ekleyin ve stimülanların eklenmesinin ardından 37 °C'de dört saat inkübe ederek NET oluşumunu indükleyin.Ardından, nötrofil süpernatantlarına mililitre başına iki ünite DNAse ekleyerek sınırlı bir DNase sindirimi gerçekleştirin, ardından iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, 15 µL 25 mM EGTA ekleyerek reaksiyonu durdurun ve iyice karıştırın. Süpernatantları ve temiz mikrofüj tüplerini toplayın ve hücre kalıntılarından kurtulmak için örnekleri 300 ×g'de ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Sınırlı sindirim uygulanmadan NET'lerin toplanması tutarsız verilerle sonuçlanır. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sınırlı DNA sindirimi adımı kritiktir. Bu nedenle, DNase I enziminin konsantrasyonu ve sindirim süresi optimize edilmiştir.Süpernatantı temiz mikrofüj tüplerine aktarın ve buz üzerinde bekletin. Ardından, önceden hazırlanmış NET standartından bir alikot kullanarak PBS ve EGTA içinde bire bir veya ikiye bir seyreltme hazırlayın. Şimdi, DNase I ile sindirilmiş örnekleri yirmi kat seyreltmek için EGTA içeren PBS kullanın ve bunları yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakalarına alikotlayın.Plakaları dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Plakaları PBS ile üç kez yıkamadan önce, kuyuk başına 100 mikrolitre horseradish peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru gibi bir tespit antikoru çözeltisi uygulayın ve karanlıkta bir saat boyunca inkübe edin. PBS ile dört yıkama yaptıktan sonra, kuyuk başına 100 mikrolitre TMB peroksidaz substratı ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe edin.Mavi renklenme, peroksidaz aktivitesini ve NET'lerin varlığını gösterir. Reaksiyonu durdurmak için 100 µL bir molar HCl ekleyin. Mavi çözeltiler sarıya dönecektir.Bir mikroplaka fotometresi kullanarak 450 nanometrede absorbsiyonu okuyun. Ölçülen MPO-DNA veya HNE-DNA kompleks miktarını NET-standardı ile karşılaştırmak için, tüm örneklerden arka plan optik yoğunluğunu çıkarın ve seyreltilmiş standart örneklerin absorbsiyon değerlerini ilgili NET içeriklerine karşı grafiğe dökün. Bu standart eğrinin doygunluğa ulaşmamış aralığını kullanarak, kullanılan yazılımdaki en iyi eksponansiyel uyumu temel alan bir trend çizgisi oluşturun.Bilinmeyen örneklerin ölçülen OD değerlerini, bilinmeyen örnekteki NET miktarını NET-standardının yüzdesi olarak verecek olan trend çizgisi denklemine yerleştirin. Son olarak, tekrarların ortalamalarını hesaplayın ve nihai verileri MPO-DNA veya HNE-DNA komplekslerinin miktarı olarak sunun. Burada, stimüle edilmemiş veya PMA veya P-aeruginosa ile aktive edilmiş insan nötrofilleri üzerinde gerçekleştirilen floresan tabanlı bir DNA salınım analizinden elde edilen temsili veriler gösterilmiştir.P-aeruginosa, insan PMN'lerinde NET oluşumunu tetikler. Bu grafik, replika kuyucuklardaki floresans artış ortalamalarının hesaplandığını, maksimum floresansa göre normalize edildiğini ve DNA salınımı olarak ifade edildiğini göstermektedir. Bu floresans görüntüleri, işlem görmemiş veya PMA ile stimüle edilmiş nötrofilleri temsil etmektedir.Burada, MPO-DNA ve HNE-DNA Elisa testi ile elde edilen; uyarılmamış, PMA ve PA01 ile aktive edilmiş insan nötrofillerine ait immünofloresans görüntüleri gösterilmektedir. Hücre dışı DNA, tipik NET morfolojisi sergilemekte olup MPO ve NET oluşumu belirteci olan sitrülline histone H4 ile kolokalize olmaktadır. Bu deney, aynı test kullanılarak insan nötrofillerinde MPO-DNA ve HNE-DNA salınımını göstermektedir.NET-standart ortalama olarak mililitre başına 19,5 µg hücre dışı DNA, 399 ng MPO ve 103,4 ng HNE içerir. MPO ve HNE'nin moleküler ağırlıkları ve bir µg DNA'nın 9,91 × 10¹⁴ nükleotid içerdiği bilgisine dayanarak, NET-standart her 1.000 nükleotid başına 109 HNE molekülü ve 147 MPO molekülü içerir. Son olarak, NET-standart ile yapılan iki katlı seri dilüsyon deneyleri, hem MPO-DNA hem de HNE-DNA ELISA analizlerinin dinamik aralıklarının 19 ile 609 ng/mL DNA arasında olduğunu ortaya koymuştur.Bir kez uzmanlaşıldığında, SYTOX orange tabanlı asit bir saat içinde kolayca ve hızlıca kurulabilir ve ertesi gün sonuçlar alınabilir. NET miktar belirleme analizi de kolayca uygulanabilir ve düzgün şekilde gerçekleştirildiğinde ertesi gün veri sağlayacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, insan nötrofillerindeki naturalazın yüksek çıktılı bir şekilde nasıl miktarlandırılabileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturmak ve izole etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Nötrofiller periferik kandan izole edilir ve NET üretmek için forbol miristat asetat (PMA) ile uyarılır. İnkübasyon sırasında, nötrofiller, granüler sitoplazmik proteinlerle karıştırılmış yoğunlaştırılmış kromatin içeren NET'leri serbest bırakmak için bir hücre ölümü (NETosis) sürecinden geçer.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzakları Oluşturmak için İn Vitro Teknik

Enfeksiyon bölgelerinde aktif endotele nötrofil bağlılık konağın inflamatuvar yanıt ayrılmaz bir bileşenidir. Için izin veren bir nötrofil bağlayıcı bir testtir Bu raporda...

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Keşfedin, insan nötrofillerinden yüksek verimli NET ölçüm yöntemlerini. Bu teknik, inflamasyon ve bağışıklık hastalıklarında nötrofil ekstraselüler tuzak oluşumunu incelemek için kullanılır.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu

Daha fazla video keşfet