Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu İn Vitro

Bu prosedürün genel amacı, insan nötrofillerinden salınan nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'leri yüksek verim ölçeğinde ölçmektir. Burada sunulan yöntemler, insan nötrofillerinde in vitro nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun mekanizması ve düzenlenmesi yoluyla iltihaplanma ve enflamatuar hastalıkların değiştirilmesi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sonuçları, merkezi bir NET aracılık eden sinyal yollarının ve NET inhibitörü veya NET uyarıcı moleküllerin tanımlanmasını içerir.

Nötrofilleri kandan izole etmek için, 20 mililitre insan kanını 250 mililitrelik konik tüplere ayırın. 10 mililitre% 6 dekstran ekleyin, ardından yavaşça karıştırın ve çözeltilerin oda sıcaklığında 20 dakika bekletin. Lökosit açısından zengin üst fazı dikkatlice temiz 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve tüpü üste kadar doldurmak için steril PBS kullanın.

Daha sonra numuneyi on dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için 15 mililitre steril PBS kullanın. Bu yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, 215 mililitrelik konik tüplerde yüzde 85, 80, 75, 70 ve 65'lik beş aşamalı percoll gradyanı hazırlayın ve her gradyanın üzerine iki mililitre lökosit süspansiyonu yerleştirin.

Ardından, gradyanları kopma ile 30 dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri katmanlar halinde% 75-80 ve% 70-75 arayüzlerde toplayın. Hücreleri iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın ve ardından hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.

Hücre dışı DNA salınımının kinetiğini ölçmek için, mililitre başına iki kez on ila altı hücre konsantrasyonunda bir nötrofil süspansiyonu hazırlayın. Zar geçirimsiz bir DNA bağlayıcı boya olan SYTOX portakalının litresine beş mikromol ekleyin ve hafifçe karıştırın. İnsan nötrofillerini steril 96 oyuklu siyah şeffaf alt mikroplakalara alikot ederek, tahlil ortamının kuyunun tüm tabanını kaplamasını sağlar.

Değilse, yan taraftaki plakaya hafifçe vurun. Plakayı 37 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Bu arada, kullanılacak nihai konsantrasyonlarının iki katı uyaran içeren çözeltileri hazırlamak için 37 santigrat derece tahlil ortamı kullanın.

Pozitif bir NET kontrolü olarak, maksimum NET salınımını tetiklemek için insan nötrofillerini dört saat boyunca tedavi etmek için 100 nanomolar forbol miristat asetat veya PMA hazırlayın. Ardından, mikroplaka florometreyi ölçüm için hazırlayın. 50 mikrolitre nötrofil süspansiyonuna 50 mikrolitre uyaran çözeltisi ekleyerek nötrofilleri uyarın.

Maksimum DNA salım sinyalini ölçmek için bir kuyucuğa mililitre saponin başına 0.5 miligramlık bir son konsantrasyon ekleyin. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve floresan değişikliklerini dört saat boyunca iki dakikalık aralıklarla sallamadan ölçün. Verileri analiz etmek için, saponin dahil tüm kuyucuklar için temel floresanı uç nokta değerlerinden çıkararak zaman içinde floresanstaki normalleştirilmiş artışları hesaplayın.

Saponin floresansındaki artış en yüksek sinyal olmalıdır ve maksimum DNA salınımı olarak adlandırılır. Replikaların sonuçlarının ortalamasını alın ve bunları maksimum DNA salınımının yüzdesi olarak sunun. MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA tahlillerini kullanarak NET oluşumunu ölçmek için, 96 oyuklu yüksek bağlama kapasiteli ELISA plakalarına anti-MPO veya anti-HNE yakalama antikorları ekleyin ve kaplamak için gece boyunca inkübe edin.

Ertesi sabah, ELISA plakalarını üç kez yıkamak için PBS kuyusu başına 200 mikrolitre kullanın. Daha sonra, kuyucukları oda sıcaklığında iki saat boyunca bloke etmek için 200 mikrolitre% 5 sığır serum albümini veya BSA ve% 0.1 insan serum albümini veya HSA kullanın. Bu arada, 100 mikrolitre tahlil ortamında tohum nötrofilleri, oyuk başına 100.000 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plaka üzerinde ve 37 santigrat derecede dört saat inkübe ederek uyaranların eklenmesinden sonra NET oluşumunu indükler.

Daha sonra, nötrofil süpernatantlarına mililitre DNAse başına iki birim ekleyerek sınırlı bir DNaz sindirimi gerçekleştirin, ardından iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Daha sonra 15 mikrolitre 25 milimolar EGTA ekleyerek reaksiyonu durdurun ve iyice karıştırın. Süpernatanları toplayın ve mikrofüj tüplerini temizleyin ve hücre kalıntılarından kurtulmak için numuneleri 300 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döndürün.

Sınırlı sindirim olmadan NET'lerin toplanması tutarsız verilere neden olur. Sınırlı DNA sindirim basamağı, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, DNaz I enziminin konsantrasyonu ve sindirim uzunluğu optimize edilmiştir.

Süpernatanı mikrofüj tüplerini temizlemek için aktarın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra, önceden hazırlanmış NET standardının bir kısmını kullanarak, PBS ve EGTA'da bir ila iki seyreltme hazırlayın. Şimdi, DNaz I sindirilmiş numuneleri yirmi kat seyreltmek için EGTA ile PBS kullanın ve bunları yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakalarına ayırın.

Plakaları gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Plakaları üç kez yıkamak için PBS'yi kullanmadan önce, yaban turpu peroksidaz konjuge anti DNA antikoru gibi bir tespit antikor çözeltisinin oyuğuna 100 mikrolitre uygulayın ve karanlıkta bir saat inkübe edin. PBS ile dört yıkamadan sonra, TMB peroksidaz substratının oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.

Mavi renklenme peroksidaz aktivitesini ve NET'lerin varlığını gösterir. Reaksiyonu durdurmak için 100 mikrolitre bir molar HCL ekleyin. Mavi çözeltiler sararır.

Bir mikroplaka fotometre kullanarak, 450 nanometrede absorbansı okuyun. NET standardına kıyasla ölçülen MPO-DNA veya HNE-DNA komplekslerinin miktarını karşılaştırmak için, tüm numunelerden arka plan optimal yoğunluğunu çıkarın ve seyreltilmiş standart numunelerin absorbans değerlerini nispi NET içeriğine göre çizin. Bu standart eğrinin doymamış aralığını kullanarak, kullanılan yazılımdan en iyi üstel uyumu kullanarak bir trend çizgisi oluşturun.

Bilinmeyenlerin ölçülen OD değerlerini, bilinmeyen örnekteki NET miktarını NET standardının yüzdesi olarak verecek olan eğilim çizgisi denklemine ekleyin. Son olarak, replikaların ortalamalarını hesaplayın ve nihai verileri MPO-DNA veya HNE-DNA komplekslerinin miktarı olarak sunun. Burada gösterilen, PMA veya P-aeruginosa ile uyarılmamış veya aktive edilmemiş insan nötrofillerinin floresan bazlı bir DNA salım testinden elde edilen temsili verilerdir.

P-aeruginosa, insan PMN'lerinde NET oluşumunu tetikler. Bu grafik, replikat kuyucuklarının floresansındaki artış ortalamalarının hesaplandığını, maksimum floresansta normalize edildiğini ve DNA salınımı olarak ifade edildiğini göstermektedir. Bu floresan görüntüleri, tedavi edilmeyen veya PMA ile uyarılmayan nötrofilleri temsil eder.

Burada, bir MPO-DNA ve HNE-DNA Elisa testinden uyarılmamış, PMA ve PA01 ile aktive edilmiş insan nötrofillerinin immünofloresan görüntüleri gösterilmektedir. Hücre dışı DNA, tipik NET morfolojisi gösterir ve NET oluşumunun bir belirteci olan MPO ve sitrülinlenmiş histon H4 ile birlikte lokalize olur. Bu deney, aynı tahlili kullanarak insan nötrofillerinde MPO-DNA ve HNE-DNA salınımını gösterir.

NET standardı ortalama olarak mililitre hücre dışı DNA başına 19.5 mikrogram, mililitre MPO başına 399 nanogram ve mililitre HNE başına 103.4 nanogram içerir. MPO ve HNE'nin moleküler ağırlıklarına ve bir mikrogram DNA'nın 14 nükleotidin 9.91 katı 10 kez içerdiğine dayanarak, NET standardı 1.000 nükleotid başına 109 HNE molekülü ve 147 MPO molekülü içerir. Son olarak, NET standardının iki katlı seri seyreltme deneyleri, hem MPO-DNA hem de HNE-DNA ELISA tahlillerinin dinamik aralıklarının mililitre DNA başına 19 ila 609 nanogram arasında olduğunu ortaya koymaktadır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, SYTOX portakal bazlı asit bir saat içinde kolay ve hızlı bir şekilde monte edilebilir ve bu da ertesi gün sonuçlara yol açar. NET kantitatif testinin gerçekleştirilmesi de kolaydır ve uygun şekilde yapılırsa ertesi gün verilerle sonuçlanacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, insan nötrofillerinde doğalazın yüksek verimli bir şekilde nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.