Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, Anchorage bağımsız bir kültür tekniği kullanarak kanser kök hücrelerini in vitro olarak genişletmek ve daha sonra yeni kanser kök hücre hedefleme tedavilerinin metabolik etkilerini test etmektir. Bu, önce bir insan pankreas adenokarsinomu doku örneğinin tek hücreli bir süspansiyona ayrılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, tümör dokusu enzimlerle daha fazla sindirilir ve daha sonra bir jelatin plaka üzerine ekilir Fibroblast hücre popülasyonunu çıkarmak için, izole edilen kanser hücreleri daha sonra ultra düşük bağlantılı çok kuyulu bir plakaya ekilir ve metabolik aktiviteyi ve tümör kürelerinin oluşumunu değerlendirmek için ilgilenilen ilaçla tedavi edilir.

Sonuç olarak, ilgilenilen ilaç, ilacın in vivo etkilerini doğrulamak için hastadan türetilmiş ksenogreftler taşıyan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde kullanılabilir. Bu yöntem, kanser kök hücre biyolojisini incelemek için güçlü bir araçtır ve yeni kanser kök hücre hedefleme tedavileri geliştirmek için ilk adım olarak hizmet eder. Prosedürü göstermek, Meme Kanseri Enstitüsü'ndeki Kanser ve Yaşlanmada Kök Hücreler Merkezi'nde genç bir araştırmacı olan ben ve laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Tini Cruz olacak Steril bir biyogüvenlik kabininde pankreas duktal adenokarsinomundan kanser kök hücrelerini izole etmek.

İnsan tümörünü bir mililitre steril PBS içeren 60 x 15 milimetrelik bir kültür kabında kıymak için steril bir neşter ve forseps kullanın ve doku tamamen ayrışana kadar gerektiği kadar üç ila dört mililitre PBS ekleyin. Doku süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarın ve PBS'yi beş mililitrelik bir son hacme ekleyin. Daha sonra numuneyi bir ayrışma santrifüjü ile mekanik olarak homojenize edin ve homojenize dokuyu 37 santigrat derecede kollajenaz ile sindirin.

Bir saatlik santrifüjden sonra, hücreler yeniden canlanır ve peleti 10 mililitre tam ortamda süspanse eder. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve hücreleri tekrar döndürün. Bu kez, peleti beş mililitre bir CK'de askıya alan resus Oda sıcaklığında beş dakika sonra, kırmızı kan hücresi lizis tamponunu santrifüjleme ile çıkarın ve peleti kanser kök hücre ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hızlı bir şekilde bağlanan fibroblast hücrelerinin çoğunu çıkarmak için hücreleri 37 santigrat derecede jelatin kaplı bir tabakta inkübe edin. Bir saat sonra, süpernatanı geri kazanın ve kanser için tümör küresi oluşumunu kolaylaştırmak için canlı pankreas kanseri hücrelerinin sayısını ölçün. Kök hücre zenginleştirme, uygun hacimdeki kanser kök hücre ortamındaki hücreleri, mililitrede iki kez 10 ila üç hücrelik bir nihai konsantrasyona seyreltir ve birkaç dakika buz üzerinde soğutur.

Daha sonra, 24 ultra düşük bağlantılı hücre plakasının ilk ve son sıralarına 500 mikrolitre PBS ekledikten sonra, hücreleri pipetle yeniden askıya alın ve plakanın boş kuyucuklarına oyuk başına bir mililitre hücre tohumlayın. Dört hücre kuyusunu ilgilenilen ilaçla ve en az dört negatif kontrol kuyusunu araçla tedavi edin. Daha sonra hücreleri bir hafta boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her geçen gün, kuyuların her birine aracımıza taze arıtma ekleyin. Beşinci veya yedinci günde, tümör kürelerinin seri paketlenmesi için daha büyük yapıların tanımlanmasına izin veren otomatik bir hücre sayacı ile oluşan tümör kürelerinin sayısını değerlendirin. Yedinci günde, küreleri hasat etmek için 40 mikrometrelik bir hücre süzgeci kullanın.

Daha sonra, küreleri aşağı doğru döndürün ve peleti tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir mililitre tripsin içinde inkübe edin. Daha sonra, az önce gösterildiği gibi reaktif oksijen türlerinin ölçümü veya ayrışmadan sonra ROS üretimi için küreleri hazırlamak için hücreleri gösterildiği gibi yedi gün daha genişletin, küreleri aşağı doğru döndürün ve uygun probu içeren HBSS'deki peleti yeniden süspanse edin. Karanlıkta 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyondan sonra, küreleri oksijen tüketimlerinin ölçümüne hazırlamak için akış sitometrisi ile analiz edilene kadar hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

İlk olarak, oda sıcaklığında en az 20 dakika boyunca 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasını hücre ve doku yapıştırıcısı ile kaplayın. Ardından, küreleri ve tripsini gösterildiği gibi ayırın. Daha sonra, fazla yapışkan plakayı, tekil hücreleri üç kez oyuk başına 10 ila beşinci hücreyi çıkarmak için plakayı iki ila üç kez suyla yıkayın.

150 mikrolitre oksijen tüketiminde, glikoz ve sodyum piruvat içeren tahlil besiyeri, hücreleri 100 kez G'ye ulaşana kadar santrifüjleme yoluyla kuyuların dibine yapıştırır. Santrifüjün kopma ile durmasına izin verin. Ardından plakanın yönünü tersine çevirin ve sıkma işlemini tekrarlayın.

Şimdi hücreleri karbondioksit olmadan 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Bu arada, tahlil kartuşu ithalatını yükleyin. A, B ve C. İlgilenilen ilacın sırasıyla üç, altı ve dokuz milimolar konsantrasyonundan 25 mikrolitre enjekte edin ve mitokondriyal inhibitör ronun bir mikromolar konsantrasyonunun 25 mikrolitresinde D'yi içe aktarın.

Hücreler hazır olduğunda, kartuşu kalibre edin ve hücre kültürü plakasını yükleyin. Son olarak, testi standart karıştırma ve ölçüm protokolü ile çalıştırın Bu temsili deneylerde, pankreas kanseri kök hücrelerinin metformin ile tedavisi, tümör kürelerinin boyutunu ve sayısını büyük ölçüde azalttı. Ayrıca, bu azalmalar ikincil ve üçüncül küre kültürleri tarafından sergilendi.

Sadece birincil küre kültürü metformin ile tedavi edildiğinde bile, Metformin'in bir mitokondriyal inhibitör olarak işlev gördüğü bildiriliyor. Gerçekten de, bu deneyde, ilacın, ROS üretimini indükleme kapasitesi ile ilişkili olan tümör hücrelerinde oksijen tüketiminde hızlı ve doza bağlı bir azalmaya neden olduğu gözlendi. Daha da önemlisi, metformin ile tedavi edilen fareler, kontrol hayvanlarına kıyasla pankreas adenokarsinomu ilerlemesinde kısa süreli ancak önemli bir azalma sergiler.

Bu videoyu izledikten sonra, taze insan tümörlerini nasıl ayrıştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Birincil kanser hücrelerini izole edin, küre oluşum kültürü olarak ayarlayın ve pankreas kanseri kök hücrelerinin metabolik aktivitesini değerlendirin.