Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Bu prosedürün genel amacı, bir termojenik katabolik hücre hattının kapsüllenmesini ve uygulamalarını in vitro ve potansiyel olarak in vivo olarak göstermektir. Bu işleme başlamak için, bir sodyum aljinat hücre süspansiyonu hazırlayın ve beş mililitrelik bir şırıngaya aktarın. Bir sonraki adım, aljinat mikro boncukları üretmek için bir kapsülleme cihazı kullanmaktır.

Mikro boncuklar daha sonra bir polionik poli L lizin çözeltisi ile kaplanır ve aljinat çekirdeği daha sonra bir hücre süspansiyonu etrafında yarı geçirgen bir zar oluşturmak üzere çıkarılır. Son adım, kapsüllenmiş hücreleri diğer hücre dizileri ile birlikte kültürlemek veya bunları farelerin yağ dokularına enjekte etmektir. Sonuç olarak, immünokan analizi, mikrokapaklar içeren bir eksik adiposit olan aldehit dehidrojenaz ile birlikte kültürlenmiş adipositlerde daha yüksek lipolitik aktivite gösterir.

İmmünohistokimya, kapsüllenmiş hücrelerin farelerin yağ dokularına başarılı bir şekilde nakledildiğini gösterirken, bu yöntem termojenez ve apus dokusu hakkında bilgi sağlayabilir. Hücre alt kümesini in vivo olarak test etmek için düşük maliyetli deneysel model sistemi sağlamak için mevcut diğer hayvan modellerine de uygulanabilir. Biyomedikal keşifler için, tüm prosedürler laminer akışlı ikinci seviye bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

Başlamak için, eski ortamı hücre kültürü şişesinden çıkarın ve preadipositleri 10 mililitre PBS ile durulayın. PBS'yi çıkarın ve hücreleri iki mililitre% 0.25 tripsin EDTA'da yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik bir alikotu çıkarın ve bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.

Üreticinin talimatlarına göre, ideal hücre miktarını elde etmek için kalan hücrelere DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında 480 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Protokol metnindeki talimatlara göre ihtiyaç duyulan hücre miktarını belirledikten sonra, hücre peletini uygun bir hacimde% 2'lik bir sodyum algin net çözeltisi içinde süspanse ediyoruz. Sodyum aljinat hücre çözeltisini beş mililitrelik bir şırıngaya aktarın.

Solüsyondaki hava kabarcıklarını çıkarın ve bir mililitrelik bir hava cebi oluşturmak için şırıngayı ters çevirin. Kapsüllemeye hazırlanmak için, 144 mililitre 100 milimolar kalsiyum klorür çözeltisi içeren küçük bir beher yerleştirin. Kapsülleme cihazının iğne ağzının altında, elektrodu, ucu kalsiyum klorür çözeltisinin yüzeyinden yaklaşık 2,5 santimetre yukarıda olacak şekilde kapsüllemeye takın.

Sodyum aljinat hücre çözeltisini içeren şırıngayı şırınga pompasına sıkıca yerleştirin. Kauçuk boruyu şırınganın açıklığına takın. Sodyum aljinat hücre çözeltisi tüpün yarısına kadar girene kadar pistonu itin.

Şırınga pompasında voltajı 5,4 kilovolta ayarlayın ve çapı 12,06 milimetreye ayarlayın. Hızı saatte üç mililitreye ayarlayın. Pompayı çalıştırın, kapsülü açın ve voltajı 5.4 kilovoltta tutun.

Davlumbazın penceresini kapatın ve aljinik mikro boncukların oluşumu tamamlanana kadar gereksiz titreşimlerden kaçının. Çözeltinin tamamı iğneden geçtikten sonra, polianyonik polilisin veya PLL ile kaplamadan önce aljinat top şeklindeki mikro boncukları kalsiyum klorür çözeltisi içinde 20 dakika daha katılaştırın. Sodyum aljinat hücre topu şeklindeki mikro boncuklar katılaştıktan sonra, mikro boncukları içeren kabı kapsülleme cihazından çıkarın.

Mikro boncukları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kalsiyum klorür çözeltisini mikroboncuk peletinden çıkarın. 30 mililitre% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ekleyerek ve tüpü elle hafifçe sallayarak mikro boncukları yıkayın.

Mikro boncukların yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Daha sonra sodyum klorür çözeltisini bu şekilde çıkarmak için 25 mililitrelik bir pipet kullanın. Mikro boncukları toplam üç kez yıkayın.

Ardından, mikro boncuklara %0.05 PLL solüsyonunu ekleyin. Her bir mililitre sodyum aljinat çözeltisi için 10 mililitre PLL çözeltisi kullanın. 10 dakika boyunca dakikada 1000 dönüşte girdap, bu genellikle PLL kaplama için yeterlidir.

PLL kaplamanın oluşumunu onayladıktan sonra, PLL çözeltisini çıkarın ve kapsülleri daha önce gösterildiği gibi% 0.9'luk bir sodyum klorür çözeltisi ile üç kez yıkayın, önce PLL kaplı mikro boncuklardan alternatif çekirdeği çıkarmak için, 50 mililitrelik tüpe 30 mililitre 50 milimolar sodyum sitrat çözeltisi ekleyin. Beş dakika veya tüm sodyum aljinat çözülene kadar bekleyin. Kapsülleri daha önce gösterildiği gibi% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ile üç kez yıkayın.

Tüp transferine 20 mililitre kültür ortamında üçüncü yıkamadan sonra, hücreleri bir hücre kültürü şişesine içeren tüm kapsüller, kapsüllenmiş hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında işler. Bu prosedür için konak hücreler, birleşene kadar 24 oyuklu plakalarda kültürlenmelidir. Ekteki protokolde tarif edildiği gibi hazırlanan fibroblast büyüme ortamını kullanın.

Preadipositlerin kültürlenmesi için metin. Mikrokapakları, birleşen konakçı hücreleri içeren 24 oyuklu plakaya aktarın, her bir kuyucukta bir tek tabaka elde etmek için mikro kapaklar ekleyin, farklılaşma ile pre adiposit farklılaşmasını indükleyin. Orta olan, 48 saat kuluçkaya yatırılır.

48 saat sonra medyayı farklılaştıracak şekilde değiştirin. Orta. İkincisi, medyayı yeni farklılaşma ile değiştirin. Orta.İki. Her 48 saatte bir hücrelerden gelen proteinler western blot tarafından analiz edilecektir.

Mikroboncuk üretiminin her aşaması mikroskop altında gözlemlenebilir. 20 x büyütmede bir aljinat mikro boncuk gösterilir. PLL kaplamadan önce, PLL ile kodlandıktan sonra ve kantitatif bir çalışmada ginnet çekirdeği çözüldükten sonra, adipoz trigliserit, lipaz veya A TGL'nin ekspresyonu, aselüler vahşi tip veya aldehit dehidrojenaz ile birlikte kültürlenmiş üç T, üç L, bir adiposit arasında karşılaştırıldı, bir A, bir eksik adiposit içeren mikrokapaklar.

Bir L DH ile birlikte kültürlenmiş adipositlerde A TGL'nin daha yüksek ekspresyonu, bir tane A biri mikrokapaklar içeren daldırma site eksik olan, daha yüksek lipolitik aktiviteyi gösterir. Bir in vivo çalışmada, GFP işaretli kapsüllenmiş hücreler, farelerin karın içi yağ deposuna enjekte edildi. 80 gün sonra, enjekte edilen yağ yastığı, kapsüllenmiş hücrelerin renksiz kümelerini seçti.

Hemat, toin ve eozin ile boyanmış karın içi yağ deposunun parafine gömülü bir bölümü, implante edilmiş mikrokapaklar, kapsüllenmiş hücreler ve konakçı adiposit kümelerini gösterir. Floresan ışığı altında analiz edilen aynı bölüm, yuvarlak sağlam kapsüllerin iç kısmında GFP etiketli nakledilen hücreleri göstermektedir. GFP'nin ekspresyonu aynı zamanda hücre canlılığının bir göstergesidir Geliştirildikten sonra.

Bu kapsülleme tekniği, metabolik hastalıklar alanındaki araştırmacıların obezite, tip iki diyabette insülin direnci, iltihaplanma ve kanser ve modal organizmalar için olası tedavileri keşfetmeleri için yol açtı.