Yağ Dokusu Depolarında içine Nakli Enkapsülasyon termojenik Preadipositler

Bu prosedürün genel amacı, termojenik katabolik bir hücre hattının enkapsülasyonunu ve bunun in vitro ve potansiyel olarak in vivo uygulamalarını göstermektir. Bu prosedüre başlamak için, bir sodyum aljinat hücre süspansiyonu hazırlayın ve bunu beş mililitrelik bir şırıngaya aktarın. Bir sonraki adım, aljinat mikroboncukları üretmek için bir enkapsülasyon cihazı kullanmaktır.

Mikroboncuklar daha sonra poliyonik poli L lizin çözeltisi ile kaplanır ve ardından hücre süspansiyonu etrafında yarı geçirgen bir membran oluşturmak için aljinat çekirdek kaldırılır. Son adım, kapsüllenen hücrelerin diğer hücre hatlarıyla birlikte kültüre edilmesi veya farelerin yağ dokularına enjekte edilmesidir. Nihayetinde, immün kan analizi, aldehit dehidrogenaz eksikliği olan bir adiposit içeren mikrokapsüllerle birlikte kültüre edilen adipositlerde daha yüksek lipolitik aktivite olduğunu göstermektedir.

İmmünohistokimya, enkapsüle edilmiş hücrelerin farelerin yağ dokularına başarılı bir şekilde transplantasyon edildiğini gösterirken; bu yöntem, termojenez ve adipoz doku hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, hücre alt kümelerini in vivo test etmek için düşük maliyetli deneysel model sistemleri sağlamak amacıyla mevcut diğer hayvan modellerine de uygulanabilir. Biyomedikal keşifler için tüm prosedürler, laminer akışlı seviye iki biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

Başlangıç olarak, eski besiyerini hücre kültür balonuyla uzaklaştırın ve preadipositleri 10 milliliters PBS ile durulayın. PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri iki mililitre %0,25 tripsin EDTA içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonundan 10 mikrolitrelik bir alikot alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

Üretici talimatlarına uygun olarak, ideal hücre miktarını elde etmek için kalan hücrelere DMEM ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 480 ×g hızında santrifüjleyin. Protokol metnindeki yönergeleri takip ederek ihtiyaç duyulan hücre miktarını belirledikten sonra, hücre peletini uygun hacimdeki %2'lik sodyum aljin net çözeltisi içinde süspande ediyoruz. Sodyum aljinat hücre çözeltisini beş mililitrelik bir şırıngaya aktarın.

Çözeltideki tüm hava kabarcıklarını giderin ve şırıngayı ters çevirerek bir mililitrelik bir hava cebi oluşturun. Enkapsülasyon hazırlığı için, 100 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinden 144 mililitre içeren küçük bir beher yerleştirin. Enkapsülasyon cihazının iğne ucunun altına, elektrodu enkapsüle edilecek maddeye, ucu kalsiyum klorür çözeltisinin yüzeyinden yaklaşık 2,5 santimetre yukarıda olacak şekilde sabitleyin.

Sodyum aljinat hücre çözeltisini içeren şırıngayı şırınga pompasına sıkıca yerleştirin. Kauçuk tüpü şırınganın ağzına takın. Sodyum aljinat hücre çözeltisi tüpün ortasına gelene kadar pistonu itin.

Voltajı 5,4 kilovolt değerine ayarlayın ve şırınga pompasındaki çapı 12,06 milimetre olarak belirleyin. Hızı saatte üç mililitreye ayarlayın. Pompayı çalıştırın, kapsülleme işlemini başlatın ve voltajı 5,4 kilovolt seviyesinde tutun.

Aljinik mikroboncukların oluşumu tamamlanana kadar çeker ocak camını kapatın ve gereksiz titreşimlerden kaçının. Çözeltinin tamamı iğneden geçtikten sonra, polyaniyonik polilizin veya PLL ile kaplamadan önce, alginat top şeklindeki mikroboncukları kalsiyum klorür çözeltisinde 20 dakika daha katılaştırın. Sodyum alginat hücre topu şeklindeki mikroboncuklar katılaştığında, mikroboncukları içeren beheri enkapsülasyon cihazından çıkarın.

Mikro boncukları 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Mikro boncuk peletinden kalsiyum klorür çözeltisini uzaklaştırın. Tüpe 30 mililitre %0,9 sodyum klorür çözeltisi ekleyip tüpü elinizle hafifçe çalkalayarak mikro boncukları yıkayın.

Mikroboncukların yerçekimi ile çökelmesini bekleyin. Ardından, 25 mililitrelik bir pipet kullanarak sodyum klorür çözeltisini bu şekilde uzaklaştırın. Mikroboncukları toplam üç kez yıkayın.

Ardından, mikroboncuklara %0,05 PLL çözeltisini ekleyin. Her 1 mililitre sodyum aljinat çözeltisi için 10 mililitre PLL çözeltisi kullanın. Genellikle PLL kaplama için yeterli olan, dakikada 1000 devir hızında 10 dakika boyunca vorteksleyin.

PLL kaplamasının oluşumunu doğruladıktan sonra, PLL solüsyonunu uzaklaştırın ve daha önce gösterildiği gibi kapsülleri üç kez %0,9 sodyum klorür solüsyonu ile yıkayın; PLL kaplı mikroboncuklardan alternatif çekirdeği öncelikle uzaklaştırmak için 50 mililitrelik tüpe 30 mililitre 50 milimolar sodyum sitrat solüsyonu ekleyin. Beş dakika veya tüm sodyum aljinat çözünene kadar bekleyin. Kapsülleri daha önce gösterildiği gibi üç kez %0,9 sodyum klorür solüsyonu ile yıkayın.

Tüpe 20 mililitre kültür ortamı eklenerek yapılan üçüncü yıkamanın ardından, hücre içeren tüm kapsülleri bir hücre kültürü balonuna aktarın ve enkapsüle edilmiş hücreleri standart hücre kültürü koşulları altında işleyin. Bu prosedür için konak hücreler, konfluens sağlanana kadar 24 kuyucuklu plaklarda kültüre edilmelidir. Eşlik eden protokolde açıklandığı şekilde hazırlanan fibroblast büyüme ortamını kullanın.

Preadipositlerin kültürü için metin. Mikroküpsülleri, konfluent konak hücreler içeren 24 kuyucuklu plakaya aktarın; her kuyucukta bir monokatman oluşturacak şekilde mikroküpsülleri ekleyin. Diferansiyasyon medyumu bir ile preadiposit diferansiyasyonunu başlatın ve 48 saat boyunca inkübe edin.

48 saat sonra, medyayı diferansiyasyon medyumu iki ile değiştirin. Her 48 saatte bir, hücrelerdeki proteinler western blot ile analiz edilecektir.

Mikroboncuk üretiminin her adımı mikroskop altında gözlemlenebilir. 20 x büyütmede bir aljinat mikroboncuk gösterilmiştir. PLL kaplamasından önce, PLL ile kapladıktan sonra ve ginnet çekirdeği çözüldükten sonra gerçekleştirilen kantitatif bir çalışmada, aselüler vahşi tip veya aldehit dehidrogenaz 1 (A1) eksik adiposit içeren mikrokapsüllerle birlikte kültürlenen üç T üç L bir adipositlerinde, adipoz trigliserit lipaz (ATGL) ekspresyonu karşılaştırılmıştır.

L DH one A one eksik adipositlerin bulunduğu mikrohapüsüllerle birlikte kültürlenen adipositlerde A TGL ekspresyonunun daha yüksek olması, daha yüksek lipolitik aktiviteye işaret eder. İn vivo bir çalışmada, GFP ile işaretlenmiş enkapsüle hücreler farelerin intraabdominal yağ deposuna enjekte edildi. 80 gün sonra, enjekte edilen yağ pedi renk değiştirmiş enkapsüle hücre kümeleri gösterdi.

Hematoksilin ve eozin ile boyanmış intraabdominal yağ deposunun parafin gömülü bir kesiti, implante edilmiş mikro kapsül içine hapsedilmiş hücre kümelerini ve konak adipositlerini göstermektedir. Aynı kesitin floresan ışık altında analizi, yuvarlak ve bütün kapsüllerin iç kısmında GFP etiketli transplant hücreleri göstermektedir. GFP ekspresyonu, gelişim sonrası hücre canlılığının da bir göstergesidir.

Bu enkapsülasyon tekniği, metabolik hastalıklar alanındaki araştırmacıların; obezite, tip iki diyabetle ilişkili insülin direnci, inflamasyon ve kanser için olası tedavileri model organizmalarda keşfetmelerinin önünü açmıştır.