Name: Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Öğrenin, patch kelepçe ve canlı floresan mikroskobu ile PKD epitelinde iyon kanalı aktivitesini ve intraselüler kalsiyum değişimlerini izlemeyi. Bu yöntem polikistik böbrek hastalığı patolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (AS) R01 HL108880 (OPO kadar) R01 DK095029 ve (TSP) K99 HL116603 (TSP) Ulusal Böbrek Vakfı IG1724, (OPO kadar) Amerikan Kalp Derneği 13GRNT16220002 ve hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu.

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Wisconsin ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Tıp Koleji&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Şekil 1 doku izolasyon ve işleme prosedürünün ana adımları gösterir. Kısaca, PCK veya SD sıçanların böbrekleri sağlıklı olmayan aranan tübüllerden veya kistleri ya oluklar toplama epitel mono tabakaları elle izolasyonu için kullanılır. Burada 4-16 hafta eski PCK sıçanlar 10,13 böbreklerin okudu. 1. Böbrek Kist ve Bağlantı Pipet (CNT) / İzolasyonu Toplama Kanalları (CD) Kesimleri <ol><li> Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. Hayvanlar sürekli olarak yeterli le sağlamak için izlenmesi gerekirAnestezi vel. Kararlı solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. </li><li> Laparotomi gerçekleştirin ve abdominal aort 17 ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile böbreklerin yıkayın. <ol><li> Polietilen boru kateteri (PE50) hazırlayın ve PBS ile dolu bir şırınga pompası bağlayın. Yan ve mezenterik ve çölyak arterler dallanma ile inen aorta erişmek için pamuklu karın organları kaydırmaya taraftan karın karşısında çapraz karın bir kesi yapmak, sonra linea alba boyunca cilt ve karın duvarı kesti. Onların kuruluğunu önlemek için daha fazla işlemler sırasında ılık serum fizyolojik ile iç organları nemlendirin. </li><li> Tek mezenterik ve çölyak arterler etrafında bitişik harfleri (# 1) ve başka bitişik harfleri (# 2) diyaframın altında aort etrafında (kravat yok) yerleştirin. Yavaşça bir ayrı. İnce forseps ile çevresindeki bağ dokuları diseksiyon ve iki bitişik harfler koyun künt tarafından abdominalis ~ 3Sol renal arter altına mm (# 3) ve iliak arterler bifurkasyon yukarıda (# 4). </li><li> Bağ 4. Kravat ve sol renal arter ve bağ # 3 arasında aort etrafında bir gemi kelepçe takın. Sıkıca kateter düzeltmek için bağ 3. kullanın, kelepçe ve aorta kateterizasyonu bağ 4. arasında bir kesi yapmak. </li><li> Kelepçe bırakın ve kan nabız düzgün yüklenmesini sağlamak için kateterin görünür olduğundan emin olun. 6 ml &#39;lik bir oranda perfüzyon başlayın / dak, alaşımlar # 1 ve # 2 kravat ve sol renal damar kesilir. Organlar tamamen beyazlatılmış kadar 1-2 dakika süreyle yıkamaya devam edin. </li><li> Makasla böbrek kan damarları, üretra ve çevresindeki bağ ve yağ dokuları kesmek böbrekleri toplamak. Ardından böbrek kapsülü kısa gözyaşı yapmak ve bunları açarlar için böbrekleri soyun. Buz soğukluğunda PBS içine böbrekler yerleştirin. Ötenazi bir torakotomi ile teyit edilir. </li></ol></li><li> Poli-L-lisin ile kaplanmış 5 x 5 mm cam kapak fiş hazırlayın. Bir kapak GLA Cutbir elmas kalem ve yerine, her bir cam çip üzerine% 0.01 steril filtre edilmiş Poli-L-Lizin çözeltisi, yaklaşık 20 | il ile ss. Tuzlu ve diseksiyon için saatçi forseps iki çift hazırlayın. </li><li> 1-2 mm kalınlığında dilimler halinde ~ arasında frontal düzlem boyunca bir jiletle böbrekler kesin. Bir stereomikroskop altında dilim birini yerleştirin. Dokuların izolasyonu buz gibi soğuk tuzlu su içinde yapılmalıdır. </li><li> Yuvarlak şekilli boşlukların (Şekil 2A) gibi bir stereomikroskop altında kist bulun; duvarları genellikle çoğaldı kan damarlarının belirgin ağını içerir. Kullanımı ince uçlu forseps bir tek tabakalı alanı elde etmek mümkün olduğunca ince bir kist iç epitel tabakası teşrih. Poli-L-lisin ile kaplanmış cam bir çip için takın. Sabit Poli-L-Lizin yüzey araştırmacısı sıkıca camına iç kist tabakası konumlandırmak sağlar. Pipetler (Şekil 2B) için erişim sağlamak için apikal yüzü yukarı bakacak şekilde kist Açığa. </li><li> PCK veya SD sıçan çocuk kullanınolmayan dilate CNT / CCDsegments 18-21 izolasyonu için papilla içeren ney merkez dilim. Not: Papiller dokular korteks az ve forseps ile papiller boru şekilli bantlar tutarak ve dilim ince sektörlere bölünebilen ekseni radyal boyunca yırtılarak daha dayanıklıdırlar. Bireysel tübüller görünür ve kapak cam yongaları yerleştirilmek üzere dışarı çekilebilir. </li><li> , Bifurkasyonlarında tarafından proksimal tübüllerin ve büyük belirgin görünür hücreler (Şekil 2C) daha yüksek şeffaflık CNT / CCD kesimleri belirleyin. Mikropipetler sürüş için uygun mikromanipülatörler ile donatılmış bir mikroskop altında ekli tübüllere ile cam kapak çipi yerleştirin. Cama onların kenarları keskin Mikropipetler bölünmüş açık tübüllerine kullanma ve takın (Şekil 2B) apikal yüzey erişilebilir hale getirmek için. </li></ol> 2. Tek Kanallı Patch-kelepçe Elektrofizyoloji <ol><li> Banyo solüsyonu ile yama-kelepçe odasına doldurun ve kapak cam çip transferiodasına izole edilmiş dokular ile. Patch-kelepçe mikropipetler güvenilir on-hücre (hücre-bağlı) ölçümler için 7-10 M? Direncini sahip olduğundan emin olun. </li><li> Hücre bağlı ölçümler için, 20x&#39;e amplifikatör kazanç oranını ayarlamak ve sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. ENaC kanallarının izlenmesi için, mM banyo çözeltisi, kullanın: 150 NaCI, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4); Pipet: 140 LiCİ, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4). </li><li> Bir hücre bağlı modda 10 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Epitel Tek tabakalı bir hücre seçin ve apikal membran pipet yaklaşım. Hafif bir emme uygulayarak bir pipet ve hücre zarı arasında sıkı bir dirençli sızdırmazlık elemanı oluşturmaktadır. Yüksek dirençli gigaohm kapatmanın meydana getirildiği zaman, bir tutma potansiyelinde bir boşluk içermeyen bir protokol ilgi kanalının izlenmesi aktivitesi için başlanmalıdır. </li><li> Giga gelen mağaza boşluk içermeyen tek kanallı güncel verilerSonraki analiz için Ohm mühürler. Genellikle yama-kelepçe kurulumları 18 ile sağlanan bir yazılım paketi kullanarak kanal olayları analiz. Kanalların ortalama açık olasılık N yama ve P o aktif kanal sayısına atıfta nerede NPO olarak kanal aktivitesini hesaplamak olduğunu. NOT: en fazla 30 dakika süreyle patch-clamp deneyleri izole kist veya tübüller kullanın. </li></ol> Epitel hücrelerinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 3. oranlı metrik Epifloresans Ölçümleri <ol><li> DMSO içinde çözülmüş 5 mM, Fura-2AM kullanın. Bireysel 500 ul konik tüpler içine kısım stok çözeltisi (yaklaşık 10 ul). Altı aya kadar -20 ° C&#39;de derin dondurucuda ışık ve mağaza koruyun. </li><li> PSS 30-40 dakika süreyle izole kistleri ve split-açık tübüller inkübe (mM: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 ve pH 7.35 10 HEPES) 5 uM Fura-2:00 boya ve 0.0 içeren% 5 pluronik asit asetoksimeti esterleri dağıtmak yardımcı olur. Bunun için, yükleme kokteyli ihtiva eden 3.5 cm tabak içinde yer dokular, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında yavaş bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra PSS temiz ve daha Epifloresans görüntüleme gerçekleştirmek için bir mikroskop altında dokuyu yerleştirmek için medyayı içeren Fura-2 AM değiştirin. </li><li> CCD kamera ve filtre tekerleği ile donatılmış istikrarlı bir ışık kaynağı (monokromatör sistemi) açın (her filtre pozisyon filtresi olarak adlandırılan her zaman seçili kendi zayıflama düzeyi ile ilişkili olabilir). </li><li> Parlak saha, dokuyu bulun. Floresans sinyalinin tespiti için geçiş ve sinyal doymasını önlemek için nötral yoğunluk filtreleri ve lamba gücüyle ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlamak. </li><li> 0.125 Hz veya daha yüksek frekansı ile 340/380 nm&#39;de rasyometrik uyarma ile doku numunesinde Fura-2:00 floresan izleyin. Doğru çözünürlülüğü için 40 × / NA 1.3 veya benzeri objektif lens kullanmation görüntüsü. </li><li> Görüntü işleme ve hesaplamalar için görüntü dizisi ithal. Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. Birkaç ilgi alanları (tek kist hücreleri veya kistik doku seçilen alanlar) seçin ve tercih edilen veri analiz yazılımı içine her bir kanal (340 ve 380 nm) için yoğunluk değerlerini hesaplamak; her bir veri noktasından çıkarma arka yoğunluk değerleri. </li><li> Her zaman noktası için Fura-02:00 340 380 kanalların yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her bölge için Ca 2+ geçici hat noktası-time değişiklikleri ve hesaplamak ortalama / SE değerleri. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz ORPBH bir murin genetik modelinde elde edilen kistik epitel mono tabakaları için geleneksel kumanda klemp tekniği ve epifloresans kalsiyum görüntüleme uygulamaları tarif. Protokol en dikkat kistleri (protokoller bölümünün adım 1.5) izolasyonuna ve elektrofizyolojik çalışmalar ödenmesi gereken üç adımda, oluşur. Bu anahtar prosedürler kapsamlı eğitim ve sabır gerektiren ve okuyucu seferde hüsrana olmamalıdır. Her şeyden önce, en dikkat kist tek tabakalı izolasyon sürecine dikkat edilmelid...

İyon kanalları, hücre büyümesi ve farklılaşması dahil olmak üzere bir çok fizyolojik işlevler, önemli bir rol oynamaktadır. Otozomal dominant ve resesif polikistik böbrek hastalığı (sırasıyla ADPKD ve ORPBH) tübüler epitel hücre kökenli böbrek sıvı dolu kistlerin gelişimi ile karakterize genetik bozukluklardır. Polikistik böbrek polycystins 1 ve hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynayan 2, zar proteinlerini kodlayan PKD1 ya PKD2 genlerin mutasyonu neden olmaktadır. Kendi başına veya PKD1 ile bir kompleks olarak PKD2 da Ca2 + geçirgen katyon kanalı 1 olarak işlev görür. PKHD1 kodlayan genin Fibrosistin (tubulogenesis ve / veya epitel polarite devamını sağlayan bir kirpikler ilişkili reseptör benzeri protein) mutasyonları ORPBH 2 genetik ivme bulunmaktadır. Kist büyümesi karmaşık bir fenomen rahatsız çoğalması 3,4, anjiyogenez 5 dediferansiyasyon ve kutupsal kaybı eşlik etmektedirtübüler hücrelerin 6-8 lık. Kistik epitel Arızalı reabsorbsiyon ve artırılmış salgı lümen ve kist genişlemesi 9,10 sıvı birikimine katkıda bulunur. Bozulmuş akım bağımlı [Ca 2 +] i sinyal de PKD 11-15 döneminde cystogenesis ile bağlantılı olmuştur. Burada, tek bir kanal aktivitesi ve PCK sıçanlardan izole edilen kistik epitel mono tabakaları, hücre içi Ca + 2 seviyeleri patch-clamp ölçümleri için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir epitelyal Na + kanalı (ENaC) 10 aktivitesinin karakterize edilmesi için tarafımızdan uygulandı ve [Ca2 +] i Ca2 + geçirgen TRPV4 ve purinerjik sinyal kaskadı 13 tarafından uyarılan işlemleri bağımlı. Bu çalışmalarda, biz PCK fareleri PKHD1 geninde kendiliğinden mutasyon nedeniyle ORPBH bir model kullanılır. PCK zorlanma originall olduSprague-Davvley (SD) sıçanlarda 16 böylece SD sıçanlarına PCK soyu ile karşılaştırma için uygun bir kontrol olarak kullanılır türetilen y. Bunun bir sonucu olarak, aynı PCK sıçanlardan izole edilen sıçan SD nefron segment ve Genişletilmemiş toplama kanalları hem kistik epitelyum üzerinde deneyler için iki farklı karşılaştırma grupları olarak kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Fura-2</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Plüronik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-68 &nbsp;</td><td>çözüm</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Işık kaynağı</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td>, <td>entegre deklanşör/filtre tekerleği sürücülü</td></tr><tr><td>Nötr yoğunluk filtreleri</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objektif</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp; &nbsp; yağ</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor Teknolojileri</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&nbsp; mikroskop (ters)</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Camı</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>Elmas kalem</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü elde etme yazılımı</td><td>Nikon</td><td>Nikon NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td> <td>ND Utility eklentisi, görüntülerin yerel Nikon Instruments .nd2 formatında içe aktarılmasına olanak tanır</td></tr><tr><td>Kayıt/perfüzyon odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yama Kelepçesi amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Veri Toplama Sistemi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; Sistem</td></tr><tr><td>Alçak Geçiren Filtre</td><td>Warner Instruments</td><td>LPF-8</td><td>8 kutuplu Bessel</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti Co</td><td>P-97</td><td>Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirme</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Japonya</td></tr><tr><td>Motorlu Mikromanipülatör</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotitreşim izolasyon masası</td><td>Faraday kafesi ile donatılmış</td><td>TMC</td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı valf perfüzyon sistemi</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>Kayıt/perfüzyon odası</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık kontrollü ameliyat masası&nbsp;</td><td>Kemirgenler için</td> <td>MCW çekirdeği</td><td></td></tr><tr><td>Binoküler stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası tabanlı perfüzyon sistemi</td><td>Harvard Aparatı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polietilen boru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>İzofloran anestezi</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a>911103</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diğer temel reaktifler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patch kelepçe ve canlı floresan mikroskobu uygulanması taze İzole pkd epitelinin fonksiyonel properties monitör

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Polikistik böbrek hastalığı sırasında Kist başlatma ve genişletme tübüler hücre çoğalması, lümen sıvı birikimi ve hücre dışı matriks oluşumu anormallikleri ile karakterize karmaşık bir süreçtir. Iyon kanalları ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon aktivitesi tübüler epitelyum işlevlerini belirleyen temel fizyolojik parametrelerdir. Biz taze böbrek kistleri izole epitel mono tabakaları hücre içi Ca 2 + düzeyinin patch-kelepçe tekniği ve kayıt iyon kanalları aktivitenin gerçek zamanlı gözlem için uygun bir yöntem geliştirdi. PCK sıçan, otozomal resesif polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek hastalığı) genetik bir modelidir, iyon kanalları ve kalsiyum akışının ex vivo analiz için kullanılmıştır. Burada anlatılan tek kanal aktivitesini ve hücre içi Ca + 2 dinamiklerini kistik mono tabakaları ve PCK veya normal Sprague Dawley (SD) sıçanların olmayan dilate tübüller izole ve izlemek için tasarlanmıştır ayrıntılı bir adım-adım bir yöntemdir.Bu yöntem, enzimatik işleme gerektiren ve taze izole epitel Tek tabakalı bir yerli ortamda analiz izin vermez. Ayrıca, bu teknik, hücre içi kalsiyum değişikliklere çok duyarlı olduğu ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Son olarak, izole edilmiş bir kistik epitel Antikorların ya da boyalar, çeşitli biyokimyasal deneyler için birincil kültürleri hazırlanması ve saflaştırılması ile lekeleme için kullanılabilir.

Cystogenesis potansiyel ENaC tutulumu ORPBH murin modelleri ve doku kültürleri 26-28 PKD ilerlemesi 22-25 ve anormal sodyum reabzorpsiyonunda sinyal kesintiye epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlemlenen çeşitli çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. Örneğin, Veizis ve ark., Amiloride duyarlı Na + absorpsiyon ORPBH 29 olmayan ortolog BPK fare modelinde CD hücrelerinde azalmış olduğunu göstermiştir. Biz son zamanlarda kistleri bozulmuş sodyum ve su reabsorbsiyonu cystog...

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

Bu prosedürün genel amacı, polikistik böbrek hastalığı kemirgen modellerinden taze olarak izole edilen kistik tek tabakalarda tek kanal aktivitesini kaydetmek ve hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişimlerini ölçmektir. Bu işlem, öncelikle renal dokulardan kanı uzaklaştırmak amacıyla PCK rec böbreklerinin abdominal aort üzerinden yıkanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise kistlerin epitel tek tabakasının izole edilmesidir.Ardından, izole edilen tek tabaka, epitel hücrelerin apikal membranlarındaki iyon kanallarının geleneksel patch clamp kayıtları için kullanılabilir. İzole doku, kalsiyum boyaları ile yükleme yapmak için de kullanılabilir. Bu işlem, epitel hücrelerdeki hücre içi kalsiyum konsantrasyonu değişimlerini nicelendirmek için kullanılır.Kistlerin doğal ortamında ölçülen bu parametreler, kist ajenezi sürecini incelemek amacıyla sağlıklı tübüllerle karşılaştırılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, böbrek kistlerindeki chi kanal aktivitesinin ve kalsiyum akışının incelenmesine olanak tanımasıdır. Bu analiz, taze izole edilmiş dokulardan elde edilen fizyolojik olarak ilgisiz veriler sağlar.Bu yaklaşımla, taze izole edilmiş epitelyumlarda tek kanal aktivitesini izleyebiliyoruz. Bu yöntem, patch tekniğinin farklı modifikasyonları kullanılarak demir kanallarının davranışının kesin bir şekilde karakterize edilebilmesi nedeniyle benzersizdir. Kistik ve sağlıklı tüplerde kanalların çeşitli ilaçlara verdiği yanıtları test edebiliyoruz.Yeni izole edilmiş kist tek tabakası, hücre içi kalsiyum görüntülemesi için kullanılabilir. Bu teknik, polikistik böbrek hastalığının önlenmesine yönelik yeni tedavilerin keşfedilmesinde önemli araçlar olan kistik hücrelerdeki hücre içi kalsiyum homeostazının farmakolojik taramasına ve fonksiyonel çalışmalarına olanak tanır. Kan boşaltma işlemi, böbreklerin kandan temizlenmesi için kullanılan cerrahi yaklaşımı gösterecektir.Öncelikle böbrek ve kistlerin izolasyon prosedürleri gösterilecektir. Bu prosedüre, anestezi uygulanmış bir sıçanın laparotomisini yaparak ve abdominal aort üzerinden böbrekleri PBS ile yıkayarak başlayın. Bunun için, PBS ile doldurulmuş bir şırınga pompasına polietilen tüp kateter bağlayın.Deri ve abdominal duvarı abdominal orta hat boyunca kesin ve dallanan mezenterik ve çölyak arterlerle birlikte descendens aortaya erişmek için abdominal organları pamuklu çubuklarla kenara çekin. Ardından, birinci ligatürü mezenterik ve çölyak arterlerin etrafına, ikinci ligatürü ise diyaframın altındaki aortanın etrafına yerleştirin.Forceps kullanarak aort ADOS'u çevresindeki bağ dokuları küt diseksiyon ile nazikçe ayırın. Ardından, üçüncü ligatürü sol renal arterin yaklaşık üç milimetre altına ve dördüncü ligatürü iliak arterlerin bifurkasyonunun üzerine yerleştirin. Dördüncü ligatürü bağlayın ve sol renal arter ile üçüncü ligatür arasındaki aortun etrafına bir damar klempi takın.Aortayı kateterize etmek için klemple dördüncü ligatür arasında bir insizyon yapın. Ardından, kateteri sıkıca sabitlemek için üçüncü ligatürü kullanın. Şimdi, klembi serbest bırakın.Doğru kurulumu sağlamak için kateterde kan nabzının görünür olduğundan emin olun. Ardından perfüzyonu başlatın ve birinci ile ikinci ligatürleri bağlayın. Bundan sonra, basıncı azaltmak için sol renal veni hızla kesin.Organlar tamamen beyazlayana kadar bir ila iki dakika boyunca yıkamaya devam edin. Ardından, renal kan damarlarını, üretrayı ve çevredeki bağ ve yağ dokularını kesin. Böbrekleri çıkarmak için, böbrek kapsülünde kısa bir yırtık oluşturun ve böbrekleri kapsüllemek için soyun.Ardından böbrekleri buz gibi soğuk PBS içine yerleştirin. Sonraki adımda, poly-L-lizin ile kaplanmış beş x beş milimetrelik ve 25 x 25 milimetrelik lamel cam parçaları hazırlayın.Böbrekleri bir jilet yardımıyla frontal düzlem boyunca bir ila iki milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin. Ardından, dilimlerden birini stereo mikroskop altına yerleştirin. İnce uçlu pensler kullanarak, yuvarlak boşluklar şeklinde görünen kistleri belirleyin.Tek katmanlı bir alan elde etmek için bir kistin iç epitelyal tabakasını mümkün olduğunca ince olacak şekilde disseke edin. Ardından, bunu polilizin ile kaplanmış bir cam çipe yapıştırın ve kistlerin apikal yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Elektrofizyoloji işlemlerini gerçekleştirecek pipetlerin erişimini sağlamak için patch clamp haznesini banyo solüsyonu ile doldurun. Daha sonra, izole edilmiş dokuları içeren lam çipi hazneye aktarın.Epitel tek tabakasından bir hücre seçin ve bir patch pipeti ile tipik bir membrana yaklaşın. Ardından, hücreye bağlı (cell-attached) modda geleneksel bir patch clamp deneyi gerçekleştirin. Bu prosedürde, izole kistleri ve ikiye ayrılmış tübülleri, içinde PSS bulunan üç buçuk santimetrelik bir kaba yerleştirin; asetometil esterlerinin dağılmasına yardımcı olmak için beş mikromolar flu, sekiz HD ve %0,05 onik asit ekleyin.Ardından numuneyi ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında, düşük hızlı bir çalkalayıcıda 30 ila 40 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, inkübasyon ortamını temiz PSS ile yıkayarak uzaklaştırın. Daha sonra, floresan görüntüleme işlemini gerçekleştirmek için dokuyu bir konfokal mikroskobun altına yerleştirin.Konfokal görüntüleme yazılımını çalıştırın. Ardından, argon lazerini 488 nanometre eksitasyona ayarlayıp açın ve emisyonu 25 nanometrelik bir bant genişliğinde 520 nanometreye ayarlayın. Daha sonra, dokuyu parlak alan modunda bulun.Doku örneğindeki flu oh sekiz H floresansını 0,25 hertz veya daha yüksek bir frekansta izleyin. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda bir artış indüklemek için TP veya diğer farmakolojik modülatörleri uygulayın. Burada, 12 hafta boyunca benzoil ve içme suyu tedavisi uygulanan 16 haftalık PCK sıçanlarından taze izole edilen kistlerin hücre ekli yamalarında ölçülen epitelyal sodyum kanalı aktivitesi için temsili akım izleri gösterilmektedir.Kesikli çizgiler, C kapalı ve op n açık durumları belirterek ilgili mevcut durumu göstermektedir. Bu grafik, epitelyal sodyum kanalının seçici bir inhibitörü olan benzoil'in epitelyal sodyum kanalı aktivitesini anlamlı ölçüde azalttığı gözlemlenen epitelyal sodyum kanalı aktivitesini özetlemektedir. Bu video, 10 µM ATP uygulamasının öncesinde ve sonrasında Fluo-8 AM ile yüklenmiş kistik tek tabakayı göstermektedir. ATP'ye yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu arttığında, yeşil floresan sinyal yoğunluğundaki artış görülebilir. Bu grafik, ATP'nin hücredeki kalsiyum seviyeleri üzerindeki etkisini özetlemektedir.PCK sıçanların tek tabakasına TP uygulanması, hücre içi kalsiyum seviyesinde hızlı bir artışa neden olur ve bu seviye iki veya üç dakika içinde bazal seviyeye döner. Bu teknik, kistik böbreklerde kalsiyum akışındaki değişiklikleri ve demir kanalı aktivitesini izlemek için benzersiz bir fırsat sunar. PCK sıçanlarda hücresel sodyum kanalı aktivitesini ve kalsiyum girişini karakterize etmenin yanı sıra, bu yaklaşım çoklu AR ve A-D-P-K-D modellerindeki diğer demir kanallarının analizi için de kullanılabilir.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Bu video, floresan etiketli PKC kullanarak canlı hücreler PKC translokasyonu görselleştirme göstermektedir.

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Bu videoda, bir floresan raportör ile kaynaşmış ışığa bağımlı iyon kanalı proteinlerini ifade eden embriyonik böbrek hücresi kültürleri, ışığın iyon hareketi üzerindeki etkisini göstermektedir. Tüm hücre yama kelepçesi, iyonların hareketini izlemek için kullanılır.

Işığa Bağımlı İyon Kanallı Hücrelerin Optogenetik Elektrofizyoloji Kaydı

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Podositlerdeki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler, glomerüllerin filtrasyon fonksiyonunu kontrol etmenin en önemli yollarından biridir. Burada, yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerinde gerçek zamanlı kalsiyum işlemenin ve tek iyon kanalları aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan yüksek verimli bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

İn vitro hücre kültürlerinin elektriksel aktivitesinin görünür ışıkla uyarılması için organik yarı iletken polimerlerin kullanımına dayalı bir yöntem tarif edilmiştir.

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Channelrhodopsins&#39;teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Bu protokolün amacı, vibratom kesitlerini kullanarak fare renal pelvisinin sağlam kalp pili bölgelerini izole etmektir. Bu bölümler daha sonra vibratom dilimlerinde kalp pili hücrelerinin ve diğer geçiş hücrelerinin Ca 2+ geçici özelliklerini aydınlatmak için in situCa 2+ görüntüleme için kullanılabilir.

Vibratom Kesitleme ile Fare Renal Pelvisin Canlı, Sağlam Kalp Pili Bölgelerini İzolasyon ve Görüntüleme

Öğrenin, patch kelepçe ve canlı floresan mikroskobu ile PKD epitelinde iyon kanalı aktivitesini ve intraselüler kalsiyum değişimlerini izlemeyi. Bu yöntem polikistik böbrek hastalığı patolojisini anlamaya yardımcı olur.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Daha fazla video keşfet