Yöntemler Küçük RNA'ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma Plasmodium falciparum

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır. Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Bu prosedürün genel amacı, plasmodium falciparum transkriptlerinin transkripsiyon sonrası gen regülasyonunda eritrosit mikroRNA'larının rolünü incelemektir. Bu yöntem, konakçı veya parazit küçük RNA'larla RNA birleştirme olaylarının füzyon mRNA'larının translasyon potansiyelini nasıl etkileyebileceği gibi sıtma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, toplam ve küçük RNA'ları tek bir havuzda bir araya getirme yeteneğidir, bu da bir hücrede küçük RNA'ların ve füzyon RNA'larının varlığını gösterir.

Ek olarak, bu prosedür, bu küçük RNA'ların füzyon mRNA ürünlerinin translasyonunu nasıl etkilediğini göstermek için polizom profillemesini kullanır. Başlamak için, transfeksiyonu tam sıtma ortamında 300 mikrolitre kırmızı kan hücresi ile beş dakika boyunca 800 kez G'de ayarlayın. Eritrositleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın, hücreleri %50 hematokritte tam sito karışımında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücreleri bir elektroporasyon vetesine aktarın ve 10 mikrogram DYS th biotin konjuge mikro RNA veya konjuge olmayan negatif kontrol mikro RNA'sı ekleyin. Hücreleri elektroporasyona tabi tutmak için, vete'yi elektroporasyonlu bir içine yerleştirin ve tek bir darbe verin. Daha sonra hücreleri plakalayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi dört saat sonra plasmodium falciparum ile enfekte edin.

Daha sonra, bir mikro merkez tüpünde 10 mikrogram parazit RNA'ya 50 mikrolitre paketlenmiş, soyulmuş avid ve boncuk ekleyin ve tüpü dört santigrat derecede bir saat boyunca rotasyonla inkübe edin. Şerit davanı ve boncukları 30 saniye boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin ve ardından peleti bir ila 1000 seyreltme RNA inhibitörü içeren 500 mikrolitre RNP tamponu ile yıkayın. Daha sonra, Resus'un boncuklarından elde edilen RNA, onları 200 mikrolitre RNA'da askıya alır.

Fazla biyotin içeren elüsyon tamponunu yakalayın. Boncukları gece boyunca dört santigrat derecede rotasyonla inkübe edin. Daha sonra boncukları 30 saniye boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatan RNA'yı toplayın.

Fazla miktarda biyotin ile elüte yapmak ve uygun spesifik elüsyonu sağlamak için minimum miktarda strep avid ve boncuk kullanmak çok önemlidir. Bu, arka plan RNA zenginleşmesini azaltır. Son olarak, polizom ayrımına başlamak için metin protokolünde açıklandığı gibi kantitatif R-T-P-C-R ile P falciparum transkriptlerinin zenginleştirme derecesini ve mikro RNA zenginleştirme derecesini belirleyin.

İlk olarak% 50'lik bir sükroz çözeltisinin beş mililitresini bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra,% 50'lik çözeltinin üzerine% 15'lik bir sükroz çözeltisinin beş mililitresini dikkatlice katman. Ardından, gradyan tüpünü perfil ile kapatın ve tüpü tezgah üzerinde yatay olarak uzanana kadar dikkatlice eğin.

Yuvarlanmayı önlemek için borunun sabit bir konumda olduğundan emin olun. Degradenin oluşmasına izin vermek için tüpü en az iki saat bu konumda tutun. Bu arada, yaklaşık 100 mililitre asenkron plazmodyum enfekte kan kültürünü% üç ila 5 oranında toplayın.

Daha sonra iki milimolar siklo, heide içeren 10 mililitre kültür ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri yedi dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin ve daha sonra 200 mikromolar siklo heide resus içeren 80 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Peletleri PBS'de sikloheksimid ile askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin.

Hücreleri peletleyin ve pelet hacmini tahmin etmek için süpernatanı çıkarın. Daha sonra hücreleri 4.25 mililitre lizisin son hacminde bekletin, tamponlayın ve rotasyonla dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Polizom profillemesi ve sıtmaya neden olan türler için önceki girişimler çoğunlukla monoları ortaya çıkardı, çünkü ponent lizis polizomların mono bölgelere ayrılmasına yol açar.

Burada, plasmodium falciparum'un polizom modelini korumak için eritrosit ve parazitleri aynı anda parçalayan bir lizis tamponu kullanıyoruz, lizatı mikro santrifüj tüplerine aktarıyoruz ve daha sonra 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de döndürüyoruz. Önceden soğutulmuş ayrı bir beş mililitrelik ultrasantrifüj tüpünde, 27 gauge iğneli bir şırınga kullanarak 1.25 mililitre soğuk 0.5 molar sükroz yastık çözeltisi ekleyin. Sükroz yastığının üzerine 3.75 mililitre lizat süpernatanı dikkatlice katman.

Numuneyi 146 dakika boyunca dört santigrat derecede 366.000 kez G'de santrifüjleyin. Bu süre zarfında, sükroz ile öldürülmüş ultrasantrifüj tüpünü yavaşça dikey konuma getirin ve en az 15 dakika buz üzerinde bekletin. Lizatı ultrasantrifüjden çıkardıktan sonra, süpernatanı 15 mililitrelik konik iki renkte dikkatlice toplayın.

Ribozomlar tarafından bağlanmamış RNA fraksiyonunu korumak için süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, ribozom peletini 500 mikrolitre Resus süspansiyonu içinde yeniden süspanse edin, numuneyi 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 16.000 kez G'de santrifüjlemek için beş dakika pipetleyerek tamponlayın. Çözünmeyen materyali çıkarmak için, gradyanı bozmamak için gradyan tüpü üzerindeki param contasını dikkatlice çıkarın ve ardından ribozomal süspansiyonu bir şırınga ve 27 gauge iğne ile üstüne yerleştirin.

Tüpü 180 dakika boyunca dört santigrat derecede 200.000 kez G'de santrifüjledikten sonra, fraksiyonlayıcıya yüklenmeye hazır olana kadar gradyanları dört santigrat derecede saklayın. Gradyan fraksiyonlayıcıya boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve sistemi beş dakika boyunca RNA içermeyen suyla yıkayın. Yıkama sırasında UV absorbans dedektörünün hassasiyetini 254 nanometreden 0,2'ye ayarlayın.

Bununla birlikte, sinyale bağlı olarak bunun ayarlanması gerekebilir. Ardından, dedektörden su akarken temel sinyali sıfıra ayarlayın. Kollektörü yıkadıktan sonra, hatları boşaltmak için fraksiyonlayıcıdan geçen sıvı akışını tersine çevirin ve ardından boş ultrasantrifüj tüpünü çıkarın.

%60'lık bir sükroz solüsyonunu iğne aparatından çıkana kadar FRACTIONATOR'dan geçirin. Ardından yüklenen gradyan tüpünü yükleme haznesinin üstüne yerleştirin ve contayı sıkın. Tüpün altını iğne ile delin.

Daha sonra fraksiyonatörün akış hızını 12.5'e 10'a sıfırlayın ve mikro santrifüj tüplerinde 18 saniyelik fraksiyonları toplayın. Gradyan çözeltisinin ilk damlası bir mikro santrifüj tüpüne girmeden önce fraksiyonları elüte etmek için% 60 sükroz çözeltisinin ileri akışını başlatın. 254 nanometre sinyalinde absorbansın hem toplanmasına hem de canlı kaydına başlayın.

Emici sinyal% 50 ve% 60 sükroz çözeltisinin arayüzünde keskin bir şekilde düştüğünde, akışı ve kaydı durdurun. Degrade kesirlerini eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ardından, %60'lık çözelti ultrasantrifüj tüpünden boşalana kadar sıvı akışını tersine çevirin.

Tüpü çıkarın ve bir sonraki gradyanın analizine başlayın. Kırmızı kan hücrelerinin mikroRNA 4 5 1 ile transfeksiyonu ve ardından biyotinile mikro NA mRNA hibritlerinin geri kazanılması, PKAR füzyon transkriptlerinin zenginleşmesini ortaya çıkardı. Sahte veya ilgisiz mikro RNA transfeksiyonu PKAR transkriptini zenginleştirmedi.

Veriler, 40 s ve 60 s ribozomal alt birimlerinin elucian zirvelerini, a DS ribozomunu ve belirtilen sayıda ribozom içeren polizom fraksiyonlarını gösterir. Ribozomlar, kırmızı kan hücrelerinin içinde bulunan PCI'den izole edilen transkriptlerle ilişkilendirildi. Kuzey kan analizi, ribozomların ve polizomun 18 S ve 28 SRNA ile ilişkili olduğunu gösterdi.

Bu prosedürle birlikte, mikroRNA MR'nin varlığını ek olarak doğrulamak için R nase H sindirimi, ribonükleaz koruma testleri ve kuzey lekeleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. NA füzyonları. Bu videoyu izledikten sonra, mikroRNA'ları eritrositlere nasıl transfekte edeceğinizi ve ardından kimerik transkriptler de dahil olmak üzere toplam RNA ile küçük RNA'ları nasıl yakalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca, ribozomal doluluğu ve dolayısıyla bu füzyon transkriptlerinin translasyon potansiyelini belirlemek için polizomu geri kazanabilmelisiniz.