Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, bakteri endosporlarını tortu gibi karmaşık mikrobiyal topluluk örneklerinden ayırmaktır Bu yöntem, mikrobiyoloji alanındaki doğal örneklerde endosporların varlığı ve bolluğu ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olur. Endosporlar ve vejetatif hücreler arasındaki kimyasallara ve ısıya karşı direnç farkına dayanır. Bu tekniğin temel avantajı, yöntemin endosporlar için tahribatsız olmasıdır, bu nedenle ekim, miktar belirleme ve metabolik testler gibi aşağı akış deneyleri için kullanılabilirler.

Bu yöntemi endospor oluşturan bakterilerin ekolojisi ile çalışmak üzere tasarlamış olsak da, sporların yararlı veya zararlı olabileceği ekzobiyoloji veya gıda endüstrisi gibi alanlarda da kullanılabilir. Metin protokolüne göre çözeltiler ve ekipman hazırladıktan sonra, UV ile sterilize edilmiş bir biyogüvenlik kabini altında, önceden tartılmış, steril 50 mililitrelik tüplere üç gram tortu numunesi eklemek için etanol alevli metal kepçeler kullanın. Steril, dereceli bir büret kullanarak, numuneye 15 mililitre steril, filtrelenmiş %1 sodyum heksametafosfat veya SHMP çözeltisi ekleyin.

Bir sıvı dağıtıcı veya homojenizatör ve steril bir dispersiyon rotoru ile numuneyi 17.500 RPM'de bir dakika boyunca homojenize edin. Numuneyi iki dakika dinlendirin ve homojenizasyonu tekrarlayın. En ağır parçacıkların çökmesi için numunenin 10 dakika dinlenmesine izin verin.

Hücre biyokütlesini içeren süpernatanı, peleti rahatsız etmemeye dikkat ederek 50 mililitrelik temiz bir tüpe aktarın. Çökeltilmiş pelete 15 mililitre daha SHMP alikotu ekleyin ve süpernatanı toplamadan ve ilk alikot ile birleştirmeden önce homojenizasyonu tekrarlayın. Numuneyi bir dakika boyunca 20 kez G'de santrifüjleyin ve peleti atmadan önce süpernatanı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Filtrasyon ünitesi ve vakum pompası metin protokolüne göre hazırlandıktan sonra, filtrasyon ünitesine steril nitroselüloz membran eklemek için forsepsleri sterilize etmek için etanol alevi kullanın. Yeni hazırlanan süpernatan numunenin yarısını membran filtrasyon ünitesine ekleyin ve membran üzerindeki hücreleri toplamak için vakum pompasını kullanın. Sıvı filtreden tamamen geçtiğinde vakum pompasını durdurun.

Membranı dikkatlice çıkarmak ve steril bir petri kabına yerleştirmek için sterilize edilmiş forseps kullanın. Taze bir steril membran parçası ile filtrasyonu çözeltinin kalan yarısı ile tekrarlayın. Endosporları yeni toplanan biyokütledeki vejetatif hücrelerden ayırmak için, zarı donmuşsa çözün ve daha küçük parçalara ayırmak için etanol alevli sterilize edilmiş makas kullanın.

Membran parçalarını steril iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve 900 mikrolitre 1X TE tamponu ekleyin. Biyokütleyi zardan serbest bırakmak için girdap yaparak iyice karıştırın. Tüpü 65 santigrat derece ve 80 RPM'de 10 dakika inkübe edin.

Ardından, tüpü inkübatörden çıkarın ve 15 dakika soğumaya bırakın. 100 mikrolitre taze hazırlanmış lizozim, mililitre başına iki miligramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin ve vejetatif hücreleri parçalamak için numuneyi 37 santigrat derece ve 80 RPM'de 60 dakika inkübe edin. Lizis tamamlandıktan sonra, numuneye 250 mikrolitre 3 normal sodyum hidroksit ve 250 mikrolitre% 6 SDS çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında ve 80 RPM'de 60 dakika inkübe edin. Daha sonra, otoklavlama ile 25 milimetre çapındaki membranları tutan steril bir filtrasyon ünitesi hazırlayın. Filtrasyon ünitesi soğuduktan sonra üzerine 25 milimetre çapında 0.2 mikrometre nitroselüloz membran yerleştirin.

Numuneyi zarın üzerine ekleyin ve sıvıyı filtrelemek için vakum pompasını kullanın, vejetatif hücre materyali geçerken zar üzerindeki endosporları yakalayın. Kalan deterjanları yıkamak için, membrana iki mililitre steril fizyolojik çözelti ekleyin ve vakum pompasını uygulayın. Sıvı tamamen filtrelendiğinde, pompayı kapatın ve membranı filtrasyon ünitesinin üzerinde bırakın.

DNaz işlemini doğrudan membran üzerinde gerçekleştirmek için membranın üzerine 450 mikrolitre steril su, 50 mikrolitre 1X DNaz reaksiyon tamponu ve 0.5 mikrolitre DNaz enzimi ekleyin ve yaklaşık 25 santigrat derecede 15 dakika bekletin. Daha önce parçalanmış hücrelerden salınan hücre dışı DNA, enzimatik olarak sindirilir ve daha sonra yıkanır. Bu, nihai endospor hazırlığının, moleküler analiz gibi aşağı akış analizi için anahtar olan harici DNA'dan arınmış olmasını sağlar.

Filtre aparatında sızıntı olmaması gerektiğini ve numunenin kurumamasını unutmamak önemlidir. İnkübasyondan sonra, bir mililitre fizyolojik çözelti ekleyin ve numuneden kalan enzimi yıkamak için pompayı açın. Endosporları içeren zarı steril bir petri kabına aktarmak için steril forseps kullanın.

Örneği metin protokolüne göre analiz edin. Vejetatif hücrelerin hedeflenen parçalanmasının bu videosunda gösterilen protokol, saflaştırılmış bir endospor örneği ve endospor oluşturan firmicutes fraksiyonunda önemli bir artış ile sonuçlanır. 16S ribozomal RNA'nın amplikon diziliminde, tedavi edilmemiş numunelerdeki gen sıkılaştırıcılar, dizilerin sadece %8 ila %19'una karşılık gelir.

Buna karşılık, tedavi sonrası firmicutes endosporinden zengin örneklemin %90.6 ve %83.9'unu temsil ediyordu. Endospor oluşturan firmicutes, basiller ve clostridiales'in iki ana takımı zenginleştirilirken, laktobasiller gibi endospor oluşturan firmicutes yoktu. Tedavinin etkinliği de saf kültürler kullanılarak gösterildi.

Bir endospor preparatı ve bir vejetatif hücre kültürü tedavi edildi, tüm hücreler inkübe edildi ve büyüme 600 nanometre optik yoğunluk ölçüldü. Burada gösterildiği gibi, endospor kültürleri için büyüme gözlenirken, tedavi edilen E.Coli kültüründe büyüme gözlenmedi, bu da vejetatif hücrelerin geri dönüşü olmayan bir şekilde hasar gördüğünü gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra ve daha önce çözeltiler ve ekipman hazırlanmışsa, bu teknik yaklaşık beş saat içinde yapılmalıdır.

Steril koşullar altında çalışarak ve çözeltilerin ve tüm ekipmanın sterilitesini sağlayarak tüm kontaminasyonlardan kaçınmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, endosporların suş tanımlaması ve metabolik potansiyeli ile ilgili ek soruları yanıtlamak için kültivasyon, izolasyon ve metabolik test gibi diğer yöntemler yapılabilir. Ayrıca, tür çeşitliliğini ve gen varlığını analiz etmek için aşağı akış DNA ekstraksiyonu ve metagenomik dizileme yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, endosporları çevresel örneklerden nasıl ayıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. SDS gibi deterjanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişisel koruyucu ekipman giymeyi unutmayın.