Name: Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin, çevre örneklerinden bakteri endosporlarını bitkisel hücrelerin hedefli lizisiyle fiziksel olarak izole etme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyoloji ve ekoloji alanlarında zarar görmemiş endosporlar için kültür ve moleküler analiz olanakları sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Bağış No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 ve sayılı 151948 İsviçre Ulusal Bilim Vakfı kabul ve Fundation Pierre Mercier la Science dökün.

Kimyasalların ve Ekipman 1. Hazırlık <ol><li> % 1 sodyum heksametafosfat (SHMP) (napo 3) n çözeltisi 500 ml yapmak ve otoklavda sterilize edilir. </li><li> Kapalı cam Petri kapları içinde otoklavlanarak sterilize nitroselüloz (NC) filtreleri ile (gözenek büyüklüğü 0.22 um, çap 47 mm). </li><li> Kapalı cam Petri kapları içinde otoklav ile Kuzey Carolina filtre ile (gözenek büyüklüğü 0.22 um, çap 25 mm) sterilize edin. </li><li> Tartılır ve (kapağı ile) steril 50 ml tüpler boş ağırlığı (numune başına bir tüp) not edin. </li><li> Tris-EDTA-tamponu (TE-tamponu) 1x hazırlayın: 10 mM Tris (tris (hidroksimetil) aminometan) ve 1 mM EDTA tampon solüsyonu yapmak. 8 pH ayarlayın ve otoklav ile sterilize. </li><li> 1 ml TE-tamponu içinde lizozim 0.02 g çözülerek lizozim çözeltisi (20 mg / ml) hazırlayın. İdeal olarak, her zaman taze olun. En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 8 g / L sodyum klorid çözündürülmesiyle fizyolojik çözeltiyi hazırlayınDamıtılmış su (NaCI). Otoklav ile sterilize. </li></ol> Sedimentten Biyokütle 2. ayrılması <ol><li> Tortu numunesi 3 g etanol Alevli metal kepçe kullanarak 50 ml tüpler steril tartılmış önceden ekle. Kirlenmesini önlemek için temiz, UV steril biyogüvenlik kabini bu gerçekleştirin. </li><li> Steril bir büret kullanılarak dereceli numuneye% 1 steril (otoklav) SHMP çözeltisi 15 ml ekleyin. SHMP çözüm de kirlenmeyi önlemek için filtre edilebilir. </li><li> Bir sıvı dağıtıcı / homojenizör (örneğin, Ultra-Turrax homojenleştirici) ile tortu ve SHMP çözelti homojenize edilir. % 70 etanol-sterilize veya kullanmadan önce dağılım rotor otoklav. 17.500 rpm&#39;de 1 dakika için homojenizasyon çalıştırın. 2 dakika boyunca numune kalan verin ve rotor hızında 1 dakika için homojenizasyon tekrarlayın. </li><li> Numune 10 dakika bekletin. Bu aşamada, ağır parçacıklar (mineraller) razı olacak. Hücreleri ve bununla birlikte W numunenin herhangi bir organik bileşenlerHasta çözelti içinde kalır. Sediment pelet rahatsız etmemek için dikkat çekerken Daha sonra, temiz bir 50 ml tüp içine süpernatant solüsyonu (içeren hücre biyokütle) aktarın. </li><li> Sediman pelet steril bir büret mezun kullanarak% 1 steril (otoklav) SHMP solüsyonu tekrar 15 ml ekleyin. Sonra tekrar 2.3 ve 2.4 adımları tekrarlayın. Bu tekrarlama tortu mineral bileşeni hücreleri ve organik partiküllerin maksimum miktarını ayrılmasını sağlar. Bu ikinci ayrılık süpernatant ilk ayrılık süpernatanıyla birleştirilebilir. Not: Aşağıdaki adımlar tüm (hücre biyokütle içeren) süpernatant yapılır. Mineral bileşen (tortu topak) iptal edilebilir. </li><li> 1 dakika için 20 x g&#39;de santrifüjleyin. Biyolojik hücre malzeme hala çözelti içinde kalır Bu adım, küçük mineral parçacıkları çözmek için yeterli g-gücünü daha da arttırır. Santrifüj işleminden sonra, bir yüzer madde halinde çözeltisi içeren (Hücre biyokütle) aktarmaktemiz 50 ml tüp. Mineral pelet atın. </li><li> Numuneyı tartmak biyokütle içeren çözeltinin son hacmi belirlenir. Ağırlığı belirlemesi, dereceli bir silindire örnek aktarmak zorunda ve kirlenme riskini azaltır önler. </li></ol> Filtre Zarında Biyokütle 3. Koleksiyonu <ol><li> Filtrasyon ünitesi (47 mm çaplı membranlara) ve vakum pompası hazırlayın. Otoklav yoluyla veya% 70 etanol ile püskürtme ve Bunsen beki ile yanan tarafından (Pyrex cam varsa) ya filtrasyon ünitesi sterilize edin. Bu protokol ile devam etmeden önce soğumasını bekleyin. </li><li> Etanol-yakılmış sterilize forseps kullanarak filtrasyon ünitesi steril NC membranı ekleyin. </li><li> Vakum pompası kullanılarak membran üzerinde hücrelerin membran filtrasyon ünitesi üzerine (adım 2.6 dan itibaren) süpernatant numunenin yarısını ekleyin ve toplamak. </li><li> Sıvı tamamen filtre üzerinden geçtikten sonra, vakum pompası durdurmak ve dikkatle Ethan kullanarak membran kaldırmakol-alev forseps sterilize. Steril bir Petri kabı içine zarın yerleştirin. <ol><li> Etanol-yakılmış sterilize makas kullanarak yarısında zarı kesin. Ayrı bir 2 ml&#39;lik bir tüpe zar her yarım ekleyin. Membranın bir yarısı DNA ekstraksiyonu ve tüm bakteriyel eden analizi için kullanılır. Filtrenin diğer yarısı -80 ° C&#39;de saklanır ve yedeği olarak görev yapar edilecektir. </li></ol></li><li> Filtrasyon ünitesi üzerine yeni NC membranı yerleştirin ve vakum pompası kullanılarak (adım 2.6 dan itibaren) örnek hacmi ikinci yarısından itibaren biyokütle toplamak. </li><li> Sıvı tamamen filtre üzerinden geçtikten sonra, vakum pompası durdurmak ve dikkatle etanol-Alevli sterilize forseps kullanarak membran kaldırmak. Ayrı 2 ml tüp içine tüm membran yerleştirin. Bu örnek, bitki hücrelerinde endosporlar ayırmak için tedavi için kullanılır. Örnek kullanılana kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Bitkisel Hücre 4. Liziz <ol><li> GerçekleştirmekTedavi önceden NC zarın (adım 3.6) toplanan biyokütle üzerinde vejetatif hücrelerden endosporlar ayırmak için. <ol><li> Membran donmuş ise, çözülme 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra steril bir Petri kabı membran yerleştirmek ve etanol-Alevli steril makaslar kullanılarak küçük parçalar halinde (yaklaşık 4 kat) kesti. Sonra steril bir 2 ml tüp içine tüm membran filtre parçaları yerleştirin. </li></ol></li><li> Örnek zarı içeren tüp 1x TE (Tris-EDTA) tamponu 900 ul (1.5 bakınız) ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın. Bu adımda, biyokütle TE-tamponu çözeltisi içine zardan çıkarılır. </li><li> 10 dakika karıştırıldı ve 80 rpm&#39;de 65 ° C&#39;de bir kuluçka tüp yerleştirin. Daha sonra inkübatör tüp kaldırmak ve 15 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> 2 mg / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için taze hazırlanmış lisozim (1.5 bakınız) 100 ul ekle. Numune 37 ° C soğuduktan önce bu deg olabilir gibi, lizozim ilave etmeyinizenzim rade. </li><li> Lizozim için en uygun koşulları vejetatif hücreleri lize etmek için, 60 dakika karıştırıldı ve 80 rpm&#39;de 37 ° C&#39;de örnek inkübe edin. </li><li> Lisis tamamlandıktan sonra, 3 N sodyum hidroksit (NaOH) ve örnek 6% sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi 250 ul 250 ul ilave edin. Bu ekleyerek, numune hacmi 1,5 ml ulaşır ve 0,5 N NaOH ile nihai konsantrasyon% 1 SDS nihai konsantrasyon vardır. </li><li> 60 dakika karıştırıldı ve 80 rpm&#39;de, oda sıcaklığında bu karışımı inkübe edin. Taban ve deterjan ekleme nihai hücre parçalama yardımcı olacaktır. Vejetatif hücreler lize ise, bu deterjan konsantrasyonu, endosporlar zarar şekilde optimize edilmiştir. </li><li> (Pyrex cam ise)% 70 etanol ile püskürtme ve Bunsen beki ile yanan otoklav ile 25 mm çaplı zarlarını tutan, ya da steril filtrasyon ünitesi hazırlayın. Soğumaya bırakın. </li><li> Etanol-alev sterilize forseps kullanarak filtreleme ünitesi üzerindeki 0.2 mikron NC membranı (25 mm çapında) yerleştirin. &lt;/ li&gt; <li> Membran üzerine adım 4.7 numuneyi ekleyin ve vakum pompası kullanılarak sıvı filtre. Sıvı içinden geçtikten sonra, vakum pompası devre dışı bırakın. Bu zar üzerinde muhafaza edilmez Bu adımda, parçalanmış bitki hücre malzemesi çıkarılır. Sadece endosporlar membran üzerinde kalacaktır. </li><li> Kalıntı deterjanlar yıkayın ve vakum pompası kullanılarak sıvıyı filtrelemek üzere steril fizyolojik solüsyon 2 ml ilave edilir. </li><li> Sıvı tamamen süzülür olduğunda, vakum pompası kapatın. Filtrasyon ünitesi ile ilgili membran bırakın. </li></ol> 5. DNase Tedavi Not: Filtre membran üzerinde doğrudan DNaz tedavi uygulayın. Bu filtreleme ünitesi akmaması önemlidir ve vakum pompası kapatılır. <ol><li> Filtre membran üzerine steril su, 450 ul doğrudan DNase reaksiyon tampon maddesi (1x) ve 0.5 ul DNaz enzimi 50 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca bekletildi. Mümkünse, biraz savaş bir odada bu sindirim yapmakOrtalama RT daha mer, enzimin, yukarıdaki 25 ° C ve sıcaklıklarda daha iyi olduğunda işe yaramaktadır. Not: Bunsen beki tutulması kenara filtrasyon ünitesi de sıcaklığını arttırır ve steril bir ortamda tutmak yararı vardır, bu nedenle örneklerin bulaşma riskini azaltmıştır. </li><li> DNaz sindirim tamamlandığında, numuneden enzimi kaldırmak için vakum pompası açın. </li><li> Ekleme ve fizyolojik çözelti 1 ml filtre edilerek artık enzimin yıkayın. </li><li> Sıvı tamamen geçtiyse, vakum pompasını kapatın ve steril forseps kullanarak ve steril Petri kabı içine yerleştirin endosporlar içeren filtre membran kaldırmak. Not: ayrılmış endosporlar örnek şimdi aşağı analiz için hazırdır. Çimlenme ve kültivasyonu için kullanıldığında -20 ° C&#39;de saklayın DNA ekstraksiyonu için ya da alternatif olarak 4 ° C &#39;de kullanıldığında. </li></ol>

<ol><li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li>
<li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li>
<li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America%27s+Largest+Hot+Spring%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li>
<li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li>
<li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G%2BC+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+%28Firmicutes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li>
<li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li>
<li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRicca%2C+E+%22Bacterial+spore+formers%3A+probiotics+and+emerging+applications%22">Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications</a>. , Horizon Bioscience. (2004).</li>
<li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li>
<li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil%2C+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li>
<li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281(2011).</li>
<li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiol+J%22%5BJournal%5D)">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li>
<li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li>
<li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li>
<li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li>
<li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li>
<li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li>
<li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene%2C+spo0A.%2C+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li>
<li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li>
<li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li>
<li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils%3A+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Dış agresif fizikokimyasal faktörlerden (örneğin, sıcaklık ya da deterjanlar) ile endosporlar direnci çevre örneklerinde bitkisel hücrelerden bakteri endosporlar ayırmak için bir yöntem bulmak için kullanıldı. Bu bir tahribatsız şekilde çevresel örneklerden izole endosporlar ilk kapsamlı yöntemdir. Ölçmek algılamak veya numunelerde endosporlar analiz etmek için önceki metotlar, dipikolinik asit veya spesifik bir işaretleyici genler gibi endosporlar özel vekiller ölçümüne dayanmaktadır. Buna karşılık, protokol i...

Bu çalışmanın amacı, çevre numuneleri içinde vejetatif bakteriyel hücrelerden bakteri sporları ayrılması için bir protokol sağlamaktır. Bakteri sporları oluşumu filum Firmicutes 1 ait olan bakteri grupları bir dizi bulunan bir hayatta kalma stratejisi genellikle açlık tetiklediği vardır. Endospore oluşturan bakteriler de suşları bir dizi patojenleri ve dolayısıyla tıbbi önemi (örneğin, Bacillus anthracis veya Clostridium difficile) vardır başlıca nedeni, incelenmiştir. Endospore oluşturan bakterilerin Çevre suşları hemen hemen her ortamda (toprak, su, sediment, hava, buz, insan bağırsak, hayvanlar gut, ve daha fazla) 1-3 izole edilmiştir. Bu nedenle, Firmicutes kültür koleksiyonları 4 ikinci en bol filum vardır. Çünkü onların cesur dış korteks ve koruyucu çekirdek proteinlerinin, endosporlar fr değişen aşırı çevre koşulları yaşayabiliryüksek radyasyon, aşırı sıcaklıklara ve zararlı kimyasallar 5 om kuruma. Bu olağanüstü direnci endosporlar 6-8 DNA ayıklamak için bir meydan okuma yapar. Çevresel sıralama çalışmalarında 9,10 gözardı edilmiş bu yüzden muhtemelen açıklıyor. Floresan antikorlar 11 ile çevre numuneleri içinde endosporlar hedeflenmesi gibi diğer yöntemler, toprak 12 ve tortu 13 dipikolinik asit ölçümü (DPA), 14 akış sitometrisi veya pastörizasyon ve daha sonra kültür 15,16 endosporlar almak veya ölçmek için kullanılmıştır Çevresel örnekleri. Son yıllarda, optimize edilmiş DNA ekstraksiyon yöntemleri yanı sıra, spesifik moleküler primerler endospor-özgü gen sekansları, 10,17-20 geliştirilmiştir hedef. Bu bakteriler 21 bu grup arasında daha biyolojik çeşitlilik ortaya çıkarmak için yardımcı olan ve aynı zamanda endosporlar tespiti için endüstride ve tıpta uygulamalara yol açmıştırSüt tozu 19, örneğin. Burada sunulan protokol hücreleri vejetatif göre bakteri sporları arasında (örneğin, ısı ve deterjanlar gibi), zararlı fizikokimyasal koşullara direnç farka dayanır. Bir numunede vejetatif hücrelerini yok etmek için, biz arka arkaya ısı, lizozim ve deterjan düşük konsantrasyonlarda geçerlidir. Sporlar yok etmek ama tüm vejetatif hücreleri lize etmek için değil, böylece bu tedavilerin zaman ve güç optimize edilmiştir. Bir çevre hücre havuzu bazı hücreler diğerlerinden daha dayanıklıdır, böylece tüm vejetatif hücrelerin tahrip olasılığını artırmak amacıyla, üç farklı tedaviler uygulanır. Bu yöntemin avantajı, ve yenilik tedaviden sonra endosporlar hala sağlam ve daha fazla alt analizler için kullanılabilir olmasıdır. Bunlar d azaltılması ve böylece DNA ekstraksiyon, kantitatif PCR (qPCR) ve amplikon veya özel endosporlar grubu hedef alan metagenomic dizileme (ve dahilÇeflitlilik) kapsama artırırken. Endosporlar de mansap yetiştirme veya floresan mikroskobu ile miktar tayini için kullanılabilir, akış sitometrisi veya DPA tespiti. Bu yöntemin önemli bir özelliği, tedavi edilen bir örnek ile işlem görmemiş bir numune ile karşılaştırılması, tek bir hücre vejetatif karşılık gelen bileşene ek olarak bir çevre numunede endosporlar miktar ve çeşitliliği anlamak olabilir.

<table><tbody><tr><td>Whatman nitroselüloz membran filtreleri, 0.2 & # 956; m gözenek boyutu, 47 mm çap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 60-00-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası beyazı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td> tozundan lizozim<td>, CAS&nbsp; 12650-88-3&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax homojenizatör T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>47&nbsp için cam filtre tutucular; mm membranlar, Pyrex cam</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal görev vakum pompası</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V / 50 Hz</td></tr><tr><td>25&nbsp için manifold örnekleme filtrasyonu; mm membranlar</td><td>Millipore</td><td>1225 Örnekleme Manifoldu</td><td>polipropilen</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Rnase içermez</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&nbsp; 1310-73-2&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman nitroselüloz membran filtreleri, 0.2 & # 956; m gözenek boyutu, 25 mm çap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

bitkisel hücreler hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar fiziksel İzolasyonu

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Endospor oluşumu, Firmicutes filumundaki bazı bakteriler arasında bulunan bir hayatta kalma stratejisidir. Endospor oluşumu sırasında, bu bakteriler olumsuz çevresel koşullar altında hayatta kalmayı artıran morfo-fizyolojik bir dinlenme durumuna girerler. Endospor oluşturan Firmicutes, kültür çalışmalarında en sık zenginleştirilen ve izole edilen bakteri gruplarından biri olmasına rağmen, moleküler yöntemlere dayalı çeşitlilik çalışmalarında genellikle bulunmazlar. Spor çekirdeğinin direnci, DNA'nın endosporlardan geri kazanılmasını sınırlayan faktörlerden biri olarak kabul edilir. Fiziksel, enzimatik ve kimyasal lizis yöntemlerini kullanarak karmaşık bir mikrobiyal topluluktaki diğer hücrelerden ayırmak için endosporların daha yüksek direncinden yararlanan bir yöntem geliştirdik. Bu şekilde elde edilen sadece endospor preparatı, yeniden kültürleme için veya endosporlar için optimize edilmiş özel DNA ekstraksiyonu ve müteakip DNA dizilimi gibi aşağı akış analizi yapmak için kullanılabilir. Sediment örneklerine uygulanan bu yöntem, endosporların zenginleşmesine izin vermiş ve dizilemeden sonra tatlı su gölü çökeltilerinde çok çeşitli endospor oluşturucuları ortaya çıkarmıştır. Bu yöntemin diğer numunelere uygulanmasının da benzer bir sonuç vermesini bekliyoruz.

Burada sunulan sonuçlar, daha önce 10,21 yayınlanmıştır. Verilerin çevre yorumlanması ve tartışılması için bu makaleleri bakın. Genel prosedür Şekil 1 &#39;de özetlenmiş ve üç ana adımlar karşılık gelir: ilk olarak, birikinti ya da herhangi bir diğer çevresel matris biyokütle ayrılması; İkinci, vejetatif hücrelerin tahribi; ve üçüncü olarak, ayrılmış endosporlar alt baş analizi. Alt analizi çeşitliliği belirlemek için, DNA ekstraksiyonu ve amplikon dizileme, örneğ...

Bu bakteri grubunun özel kültür veya moleküler çalışmalarını gerçekleştirmek için karmaşık mikrobiyal topluluklardan bakteri endosporlarını ayırmak için bir yöntem geliştirilmiştir.

Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

Bu prosedürün genel amacı, sediment gibi karmaşık mikrobiyal topluluk örneklerinden bakteriyel endosporları ayırmaktır. Bu yöntem, doğal örneklerdeki endosporların varlığı ve bolluğu üzerine mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Yöntem, endosporlar ile vejetatif hücrelerin kimyasallara ve ısıya karşı gösterdikleri direnç farkına dayanmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, yöntemin endosporlar için yıkıcı olmamasıdır; böylece endosporlar kültürleme, nicelleştirme ve metabolik testler gibi sonraki deneylerde kullanılabilir.Bu yöntem, endospor oluşturan bakterilerin ekolojisi ile çalışacak şekilde tasarlanmış olsa da, sporların faydalı veya zararlı olabileceği eksobiyoloji veya gıda endüstrisi gibi alanlarda da kullanılabilir. Yazılı protokole göre solüsyonlar ve ekipmanlar hazırlandıktan sonra, UV sterilizasyonlu bir biyogüvenlik kabini altında, önceden tartılmış steril 50 mililitrelik tüplere üç gram sediment örneği eklemek için etanolle yakılmış metal kaşıklar kullanın. Steril, dereceli bir büret kullanarak örneğe 15 mililitre steril, filtrelenmiş %1 sodyum heksametafosfat veya SHMP solüsyonu ekleyin.Sıvı dağıtıcı veya homojenizatör ve steril bir dağıtım rotoru kullanarak, numuneyi 17,500 RPM hızında bir dakika boyunca homojenleştirin. Numuneyi iki dakika dinlendirin ve homojenizasyonu tekrarlayın. En ağır partiküllerin çökmesi için numunenin 10 dakika boyunca dinlenmesine izin verin.Hücre biyokütlesini içeren süpernatantı, pelletin dağılmamasına dikkat ederek temiz bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Çökmüş pellete 15 mililitrelik bir başka SHMP alikotu ekleyin ve süpernatantı toplayıp ilk alikotla birleştirmeden önce homojenizasyonu tekrarlayın. Örneği 20 ×g hızında bir dakika boyunca santrifüjleyin ve pelleti atmadan önce süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.Filtrasyon ünitesi ve vakum pompası metin protokolüne göre hazırlandıktan sonra, steril nitroselüloz membranı filtrasyon ünitesine eklemek için penseti etanol alevi ile sterilize edin. Az önce hazırlanan süpernatan örneğinin yarısını membran filtrasyon ünitesine ekleyin ve hücreleri membran üzerinde toplamak için vakum pompasını kullanın. Sıvı filtreden tamamen geçtiğinde vakum pompasını durdurun.Membranı dikkatlice çıkarmak için sterilize edilmiş pensler kullanın ve membranı steril bir petri kabına yerleştirin. Steril membranın yeni bir parçasıyla, çözeltinin kalan yarısı için filtrasyon işlemini tekrarlayın. Yeni toplanan biyokütledeki endosporları vejetatif hücrelerden ayırmak için, membran dondurulmuşsa çözdürün ve membranı daha küçük parçalara bölmek için etanolle alevlenerek sterilize edilmiş makaslar kullanın.Membran parçalarını steril iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve 900 µL 1X TE tamponu ekleyin. Biyokütleyi membrandan ayırmak için vorteksleyerek iyice karıştırın. Tüpü 65 °C ve 80 RPM'de 10 dakika boyunca inkübe edin.Ardından tüpü inkübatörden çıkarın ve 15 dakika boyunca soğumaya bırakın. Vejetatif hücreleri liz etmek için, nihai konsantrasyonu iki miligram per mililitre olacak şekilde 100 microliters taze hazırlanmış lizozim ekleyin ve örneği 37 degrees Celsius'ta ve 80 RPM'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Liz işlemi tamamlandıktan sonra örneğe 250 microliters 3 normal sodyum hidroksit ve 250 microliters %6 SDS çözeltisi ekleyin.Oda sıcaklığında ve 80 RPM'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 25 milimetre çapında membranlar alan steril bir filtrasyon ünitesini otoklavlayarak hazırlayın. Filtrasyon ünitesi soğuduktan sonra, üzerine 25 milimetre çapında 0.2 mikrometre nitrocellüloz membran yerleştirin.Numuneyi membrana ekleyin ve sıvıyı filtrelemek için vakum pompasını kullanın; böylece vejetatif hücre materyali geçerken endosporlar membran üzerinde tutulur. Kalıntı deterjanları temizlemek için membrana iki mililitre steril fizyolojik çözelti ekleyin ve vakum pompasını çalıştırın. Sıvı tamamen filtrelendiğinde pompayı kapatın ve membranı filtrasyon ünitesinde bırakın.DNaz işlemini doğrudan membran üzerinde gerçekleştirmek için, membranın üzerine 450 µL steril su, 50 µL 1X DNaz reaksiyon tamponu ve 0,5 µL DNaz enzimi ekleyin ve yaklaşık 25 °C'de 15 dakika boyunca bekletin. Lizisle serbest kalan hücre dışı DNA enzimatik olarak sindirilir ve ardından yıkanarak uzaklaştırılır. Bu işlem, nihai endospor preparatının, moleküler analiz gibi sonraki analizler için kritik olan dış DNA'dan arındırılmasını sağlar.Filtre aparatında sızıntı olmaması ve numunenin kurumaması gerektiği unutulmamalıdır. İnkübasyon sonrası, numunedeki kalıntı enzimi yıkamak için bir mililitre fizyolojik solüsyon ekleyin ve pompayı çalıştırın. Endosporları içeren membranı steril bir petri kabına aktarmak için steril pens kullanın.Numuneyi metin protokolüne göre analiz edin. Bu videoda gösterilen vegetatif hücrelerin hedeflenmiş lizis protokolü, saflaştırılmış bir endospor numunesi ve endospor oluşturan firmicutes fraksiyonunda önemli bir artışla sonuçlanır. 16S ribozomal RNA geninin amplikon dizilemesinde, işlem görmemiş numunelerdeki firmicutes dizilerin yalnızca %8 ile %19'suna karşılık gelir.Buna karşılık, işlem sonrası firmicutes, endospor bakımından zengin örneğin %90,6 ve %83,9'unu oluşturmuştur. Endospor oluşturan firmicutes'in iki ana takımı olan bacillales ve clostridiales zenginleşirken, lactobacillales gibi endospor oluşturmayan firmicutes yok olmuştur. İşlemin etkinliği, saf kültürler kullanılarak da kanıtlanmıştır.Bir endospor preparatı ve bir vejetatif hücre kültürü işlem görmüş, tüm hücreler inkübe edilmiş ve büyüme 600 nanometre optik yoğunlukta ölçülmüştür. Burada gösterildiği üzere, endospor kültürlerinde büyüme gözlemlenirken, işlem görmüş E.Coli kültüründe büyüme gözlemlenmemiştir; bu durum vejetatif hücrelerin geri döndürülemez şekilde hasar gördüğünü göstermektedir. Teknik üzerinde uzmanlaşıldığında ve çözeltiler ile ekipmanlar önceden hazırlanmışsa, bu işlem yaklaşık beş saatte tamamlanmalıdır.Steril koşullar altında çalışarak ve çözeltilerin ile tüm ekipmanların sterilitesini sağlayarak her türlü kontaminasyondan kaçınmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, suş tanımlaması ve endosporların metabolik potansiyeli hakkında ek soruları yanıtlamak amacıyla kültüre etme, izolasyon ve metabolik testler gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Ayrıca, tür çeşitliliğini ve gen varlığını analiz etmek için ardından DNA ekstraksiyonu ve metagenomik sekanslama yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, endosporların çevresel örneklerden nasıl ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. SDS gibi deterjanlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Kişisel koruyucu ekipman giymeyi ihmal etmeyin.

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Kaynak: Schlimpert, S., ve diğerleri. Mikroakışkan Bir Cihaz Kullanılarak Tüm S. venezuelae Yaşam Döngüsünün Floresan Hızlandırılmış Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, Streptomyces venezuelae'den sporların yetiştirilmesini ve izolasyonunu göstermektedir. Bakterilerin stresten kurtulmasına yardımcı olan uyuyan hücreler olan sporlar, besin sınırlaması sırasında üretilir ve santrifüjleme yoluyla toplanır. Yöntem, sonraki uygulamalar için saf, soğukta saklanan bir spor süspansiyonu sağlar.

 Streptomyces venezuelae Sporlarının Sıvı Kültürden Hazırlanması ve İzolasyonu 

Kaynak: Wunderlin, T. ve diğerleri. Vejetatif Hücrelerin Hedefli Lizisi ile Endosporların Çevresel Örneklerden Fiziksel İzoleti. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, hem vejetatif hücreler hem de çeşitli bakteriler içeren çevresel bir örnekten endosporları izole etme yöntemini gösteriyor. Bu işlem, filtreleme, mekanik bozulma ve endosporları koruyarak vejetatif hücreleri zayıflatmak ve lizlemek için seçici kimyasal işlem içerir. Son adım, dirençli endosporları membran filtrasyonu yoluyla izole eder.

Vejetatif Hücrelerin Hedefli Lizisi ile Çevresel Örnekten Endosporların İzole Edilmesi 

Burada, bakteri sporu çimlenmesi sırasında indirgeyici şekerlerin varlığını tespit etmek için kolorimetrik bir testi açıklıyoruz.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

Bu iletişim kuralı canlılık parametre ve düşük basınç plazma ile tedaviden sonra Bacillus subtilis sporlar canlandırıcı olarak DNA onarım işlemleri izleme alaka değerlendirmek için izleme tarafından gereken önemli ardışık adımlar gösterilmektedir Floresans etiketli DNA onarım proteinler confocal mikroskobu zaman karar vermek ve elektron mikroskobu tarama yoluyla.

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Kurum mantarlar çok yıkıcı tarım hastalıkları neden. Yanıt olarak çevre ipuçları çimlenme uyuyan teliospores olarak dağılmış. Çimlenme sırasında moleküler değişiklikleri öğrenmek için iki yöntem anahat: metabolik aktivasyon algılamak için solunum artış ölçme ve moleküler olayları farklı morfolojik aşamalarında teliospores izole ederek değiştirme değerlendirilmesi.

Microrespiration analizi ve mikrodiseksiyon kullanarak soruşturma Teliospore çimlenme

Germinant reseptör proteinler 'germinosomes' Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.

Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi

Ağır metale dayanıklı mikropların jeotermal kaynaklardan izole edilmesi, biyoremediasyon ve çevresel izleme biyosistemlerinin geliştirilmesi için sıcak bir konudur. Bu çalışma, kaplıcalardan ağır metal toleranslı bakterilerin izole edilmesi ve tanımlanması için metodolojik bir yaklaşım sunmaktadır.

Çevre Kirliliğini Ele Almak için Ekstremofilik Mikroorganizmaların Biyoprospektifi

Bu makale, bitki ilişkili endofitik mantarların izolasyonu, izolatların uzun süreli korunması, morfolojik karakterizasyon ve sonraki moleküler tanımlama ve metagenomik analizler için toplam DNA ekstraksiyonu için ayrıntılı ve yeterli protokoller sağlamayı amaçlamaktadır.

Mikoheterotrofik Bitkilerde Endofitik Mantarları Tanımlamak için İzolasyon, Karakterizasyon ve Toplam DNA Ekstraksiyonu

EPA Metod 1615, çevre ve içme sularındaki enterovirüsleri ve norovirüsleri konsantre etmek için elektropozitif bir filtre kullanır. Bu el yazması, Yöntem 1615 analizleri için numune toplama prosedürünü açıklamaktadır.

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

Öğrenin, çevre örneklerinden bakteri endosporlarını bitkisel hücrelerin hedefli lizisiyle fiziksel olarak izole etme yöntemini. Bu teknik, mikrobiyoloji ve ekoloji alanlarında zarar görmemiş endosporlar için kültür ve moleküler analiz olanakları sunar.

Bitkisel Hücreler Hedefli lizis ile Çevre Örneklerden endosporlar Fiziksel İzolasyonu

Daha fazla video keşfet