Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Bu ELISA tabanlı yöntemin amaçları, ilk olarak bir sitokinin reseptörüne bağlanma afinitesini belirlemek ve ikincisi, ligand-reseptör etkileşiminin inhibitör peptitlerinin engelleyici etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, protein-protein etkileşimleri alanında, sitokin-reseptör bağlanması gibi temel sorulara cevap verebilir. Bağlanma afiniteleri ve bunların blokajı, etkileşim dinamiklerinin genel anlayışını artırabilir.

Bu tekniğin ana avantajı, kolayca yapılabilir, etiketli reseptörler üretir ve ELISA okuyucu gibi kolayca ulaşılabilir malzemelerin kullanılması nedeniyle nispeten ucuzdur. Bu yöntem sitokin reseptör etkileşimine dair bilgi sağlarken, genel protein-protein etkileşimleri ve spesifik etkileşimleri inhibe etmek için tıkayıcı bileşiklerin tasarlanması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çözeltileri metin protokolünde belirtilen şekilde hazırlayın.

Karbonat kaplama tamponunu 0,22 mikron PES membranla filtrelediğinizden emin olun. Vakum kullanın. Ayrıca, her ligand veya peptit için 10 farklı konsantrasyon hazırlayın.

Bu videoda iki test açıklanmaktadır, birincisi doğrudan ligand reseptör etkileşimi ELISA'dır. Bu, reseptör-ligand ayrışma sabitini ölçmek için kullanılabilir ve bu da reseptör-ligand bağlanma afinitesini temsil eder. İkinci test, yakın zamanda optimize edilmiş bir rekabetçi ligand-reseptör etkileşimi ELISA'dır.

Bu, peptitlerin ve diğer tıkayıcı bileşiklerin, reseptör-ligand etkileşimine müdahale etmek için kullanılmasının taranmasına izin verir. Verimlilik için, 96 kuyuluk plakalar için çok kanallı pipetlerin kullanılmasına hazırlanın ve dökerken, sadece içeriklerini boşaltın. Bu prosedürü plakayı bir rekombinant reseptörle kaplamaktan başlayın.

İlk olarak, reseptörü karbonat tamponunda 100 nanogram/mikrolitre'ye seyreltin. Ardından, plakayı 100 mikrolitre reseptör çözeltisi ile doldurun. Plaka kenarının etkisini önlemek için dış duvarları hariç tutun.

Plağı örtün ve gece boyunca 4 derece Celsius'ta kuluçkaya bırakın. Tüm plak inkübasyonlarını hafifçe sallayarak gerçekleştirin. Ertesi gün, kaplama çözeltisini çıkarın ve plakayı yıkama çözeltisi, Tween 20'li PBS ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, serbest reseptör bağlanma bölgelerini 200 mikrolitre %5 PSA ekleyerek bloklayın. Blokajın tamamlanması için plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın. Daha sonra kuyuları boşaltın ve plakayı önceki gibi yıkayın.

Şimdi, kuyuları rekombinant his-tag ligandın çeşitli seyreltmeleri ile 100 mikrolitre yükleyin. Her konsantrasyonu iki kopya halinde yükleyin. Boş kuyulara sadece PBS yükleyin.

Daha sonra, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ligantlerle inkübasyonun ardından plakayı yıkama çözeltisiyle üç kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 100 mikrolitre birincil anti-his fare monoklonal antikoru pipetleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın.

Antikoru yıkadıktan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre HRP eşleştirilmiş keçi anti-fare IGG ikincil antikoru çözeltisi ekleyin. Işıktan korunmak için plakayı alüminyum folyo ile sarın. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya bırakın.

İkincil antikoru çıkarmak için standart yıkama tekniğini kullanın. Şimdi, her kuyuya taze hazırlanmış, stoka eşit miktarlarda çözelti A ve B'den yapılmış TMB'nin 100 mikrolitre'sini ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletin. Ardından, yeterli renk gelişiminden sonra, her kuyuya 50 mikrolitre stoka ekleyin.

Protokol, iletilmiş sinyalin özgül bağlanmadan kaynaklandığı varsayımına dayanmaktadır. Sinyale özgül olmayan bağlanmanın katkısını tahmin etmek gerekebilir. Ardından, plak absorbans değerlerini 450 nanometrede okuyun ve KD değerini hesaplamaya devam edin.

Rekabetçi LRA prosedürü, doğrudan LRA prosedürü ile aynı adımları takip eder, ancak birkaç önemli değişiklik vardır. Fazla kaplama ligandlarını plakada yıkadıktan sonra, plak kuyularını bloklayın. Her kuyuya 200 mikrolitre %5 BSA çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın.

Inkübasyon sırasında, rekombinant his-tag ligandlarını PBS içinde sabit bir konsantrasyon olan 10 nanogram/mililitrede hazırlayın. Ardından, 10 nanomolar ila 100 mikromolar arasında değişen farklı konsantrasyonlarda PBS içinde bloklama peptidini hazırlayın, böylece doz-cevap eğrisi sağlanır. Böylece, bloklama peptidi için IC50 değeri bulunabilir.

Kontrol kuyularında, maksimum bağlanmayı elde etmek için peptit içermeyen sabit ligand konsantrasyonunu yükleyin. Boş kuyularda, sadece ligand veya peptit içermeyen PBS ekleyin. Diğer kuyularda, 50 mikrolitre ligand ve her peptit konsantrasyonunun 50 mikrolitre'sini ekleyin.

Daha sonra, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve her zamanki gibi devam edin. Üç farklı interferon ligand peptidi ve reseptör alfa alt birimi IL28R-a arasındaki ayrışma sa