Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Bu ELISA tabanlı yöntemin amaçları, ilk olarak bir sitokinin reseptörüne bağlanma afinitesini belirlemek ve ikincisi, ligand-reseptör etkileşiminin inhibitör peptitlerinin bloke edici etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, sitokin-reseptör bağlanması gibi protein-protein etkileşimleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bağlanma afiniteleri ve bunların blokajı, etkileşim dinamiklerinin genel olarak anlaşılmasını artırabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin kolay olması, etiket reseptörleri üretmesi ve ELISA okuyucu gibi kolayca bulunabilen kolay erişim nedeniyle nispeten ucuz olmasıdır. Bu yöntem sitokin reseptör etkileşimi hakkında bilgi sağlayabilse de, genel protein-protein etkileşimleri ve spesifik etkileşimleri inhibe etmek için bloke edici bileşiklerin tasarımı gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çözümleri metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

Karbonat kaplama tamponunu 0.22 mikron PES membran ile filtrelediğinizden emin olun. Elektrikli süpürge kullanın. Ayrıca, her ligand veya peptidden 10 farklı konsantrasyon yapın.

Bu videoda açıklanan iki test vardır, ilki doğrudan ligand reseptör etkileşimi, ELISA'dır. Reseptör-ligand bağlanma afinitesini temsil eden reseptör-ligand ayrışma sabitini ölçmek için kullanılabilir. İkinci test, yakın zamanda optimize edilmiş bir rekabet ligand-reseptör etkileşimi ELISA'dır.

Bu, reseptör-ligand etkileşimine müdahale etmek için hareket eden peptitlerin ve diğer bloke edici bileşiklerin taranmasına izin verir. Verimlilik için, 96 oyuklu plakalar için çok kanallı pipetler kullanmaya hazırlanın ve boşaltırken içeriklerini boşaltın. Plakayı rekombinant bir reseptör ile kaplayarak bu işleme başlayın.

İlk olarak, karbonat tamponundaki reseptörü mikrolitre başına 100 nanograma seyreltin. Ardından, plaka kuyucuklarını 100 mikrolitre reseptör çözeltisi ile doldurun. Plaka kenarı artefaktı ile uğraşmaktan kaçınmak için dış duvarları hariç tutun.

Plakayı örtün ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Tüm plaka inkübasyonlarını hafif döndürme ile gerçekleştirin. Ertesi gün, kaplama solüsyonunu çıkarın ve plakayı Tween 20 dokunuşuyla PBS yıkama solüsyonu ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, 200 mikrolitre% 5 PSA ekleyerek serbest reseptör bağlanma bölgelerini bloke edin. Bloğu tamamlamak için plakanın oda sıcaklığında iki saat inkübe etmesine izin verin. Daha sonra kuyuları boşaltın ve plakayı daha önce olduğu gibi yıkayın.

Şimdi, kuyucukları 100 mikrolitre rekombinant his tag ligandının çeşitli dilüsyonları ile doldurun. Her konsantrasyonu iki kopya halinde yükleyin. Boş kuyuları yalnızca PBS ile yükleyin.

Ardından, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ligandlarla inkübasyonun ardından, plakayı üç kez yıkama solüsyonu ile yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitrelik birincil anti-his fare monoklonal antikoru pipetleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Antikoru yıkadıktan sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre HRP bağlantılı keçi anti-fare IGG ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Işıktan kaçınmak için plakayı alüminyum folyo ile sarın. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

İkincil antikoru çıkarmak için standart yıkama tekniğini kullanın. Şimdi, her bir oyuğa, eşit miktarda stok substrat çözeltileri A ve B'den yapılmış 100 mikrolitre taze hazırlanmış TMB ekleyin.Ardından, plakayı 15 ila 30 dakika oda sıcaklığında tutun. Ardından, yeterli renk gelişiminden sonra, her oyuğa 50 mikrolitre stok çözeltisi ekleyin.

Protokol, iletilen sinyalin belirli bir bağlamadan yükseldiği varsayımına dayanır. Spesifik olmayan bağlanmanın sinyale katkısını tahmin etmek gerekebilir. Ardından, 450 nanometrede plaka absorbans değerlerini okuyun ve KD değerini hesaplamaya devam edin.

Yarışma LRA prosedürü, birkaç önemli değişiklik dışında, doğrudan LRA prosedürü ile aynı adımları izler. Fazla kaplama ligandlarını plakadan yıkadıktan sonra, plaka kuyularını tıkayın. Her oyuğa 200 mikrolitre% 5 BSA çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, rekombinant his tag ligandlarını PBS'de mililitre başına 10 nanogramlık sabit bir konsantrasyonda hazırlayın. Daha sonra, bir doz-yanıt eğrisini garanti etmek için bloke edici peptidi PBS'de 10 nanomolar ila 100 mikromolar arasında değişen farklı konsantrasyonlarda hazırlayın. Böylece, bloke edici peptit için IC50 değeri bulunabilir.

Kontrol kuyularında, maksimum bağlanmayı elde etmek için sabit ligand konsantrasyonunu peptit olmadan yükleyin. Boş kuyucuklara, ligand veya peptit içermeyen sadece PBS ekleyin. Diğer kuyucuklara, 50 mikrolitre ligand ve her peptit konsantrasyonundan 50 mikrolitre ekleyin.

Ardından, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve her zamanki gibi devam edin. Üç farklı interferon ligand peptidi ile reseptör alfa alt birimi IL28R-a arasındaki ayrışma sabitleri, doğrudan LRA kullanılarak belirlendi, işgal edilen bağlanma bölgelerinin fraksiyonu, ilgili interferon konsantrasyonunun logaritmasına karşı çizildi. Bu sonuçlar, verileri Hill denklemine uydurarak KD değerini tahmin etmek için analiz edilebilecek bir bağlanma eğrisini göstermektedir.

Bir Scatchard grafiği, ligand bağlanmasında işbirliğini gösterir, sonuçta interferon ligandı 1 en yüksek bağlanma afinitesine sahiptir, bunu interferon ligandı 2 ve interferon ligandı 3 takip eder. Hill katsayısının 1'den fazla olması, ilk ligand reseptörü etkileşiminden sonra ek ligandlar için artan afiniteyi gösterir. Daha sonra, bir bloke edici peptidin interferon ligand peptitleri ve reseptör alt birimi arasındaki etkileşim üzerindeki etkisini ölçmek için rekabetçi LRA kullanıldı.

Mililitre başına 10 nanogramda bir interferon ligand peptidi için işgal edilen bağlanma bölgelerinin fraksiyonu, interferon peptidinin konsantrasyonunun kütüğüne karşı çizilir. Bu verilerden IC50 değerleri tahmin edildi. Hesaplanan değerlere göre, bloke edici peptit, interferon ligand 3 ve IL28R-a arasındaki etkileşimi büyük ölçüde inhibe etti.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, sekiz saat içinde yapılabilir. Düzgün yapılırsa. Bu prosedürü denerken, ligand reseptör bağlanmasının her doygunluk konsantrasyonunun, bu prosedürü takiben, daha ayrıntılı bir KD değeri elde etmek için diğer yöntemlerin gerçekleştirilebileceğini hatırlamak önemlidir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, ligand-reseptör etkileşimleri alanındaki araştırmacıların, bu etkileşimleri bloke etmek için inhibitör maddeleri keşfetmelerinin yolunu açtı.