Name: Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin, ELISA tabanlı bağlama ve rekabet yöntemiyle ligand-reseptör etkileşimlerini hızla belirlemeyi. Sitokin-reseptör bağlanma afinitesi ve inhibitör peptitlerin etkisini ölçerek protein-protein etkileşim dinamiklerini anlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El yazmasının eleştirel incelemesi için Prof. J. Stelling'e (Biyosistemler Bilimi ve Mühendisliği Bölümü, ETH Zürih ve İsviçre Biyoenformatik Enstitüsü, Basel, İsviçre) teşekkür ederiz.

1. Reaktif Hazırlama <ol><li> Karbonat kaplama tamponu hazırlamak 0.36 g Na 2 CO 3 ve 3 100 ml saf su 0.84 gr NaHCO çözmek için; steril filtre kullanımına kadar oda sıcaklığında 0.22 um polietersülfon (PES) zar filtresi ve mağaza tahrik edilen bir vakum kullanılarak tamponu. </li><li> Fosfat% 0.05 h / h Tween 20 eklenerek yıkama çözeltisi hazırlayın tuz (PBS) tamponlu. </li><li> 4 ° C &#39;de 5 g, 100 mi, PBS içinde BSA (≥98%) ve mağaza eritilmesi ile% 5 bovin serum albümini (BSA) PBS çözeltisi içinde (bloke çözelti) hazırlayın. </li><li> Rekombinant bir reseptörü ligandları ve Bloklama peptitler <ol><li> Reconstitutethe rekombinant insan interlökin reseptörü alfa alt-birimi (IL28RA) ve -80 ° C &#39;de, üreticinin talimatlarına ve saklamak için uygun olarak insan IFN (IFNL1-3) rekombinant His-etiketli ligandlar. Sentezini peptidleri engelleme ve daha önce 4 tarif edildiği şekilde kullanıldı. ligandın farklı konsantrasyonlarda hazırlamak için PBS kullanarakS ve tahlillerde kullanılmak için peptidler. </li></ol></li><li> Primer antikor hazırlamak için, 1 ile% 0.1 BSA ile PBS içinde 6X His fare monoklonal antikoru seyreltilmiş: 1,000 seyreltme. seyreltik ikincil antikor hazırlamak için yaban turpu peroksidazı (HRP) 1% 0.1 BSA ile PBS içinde konjuge keçi anti-fare IgG (H + L): 10,000 seyreltme. </li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak belirteç, A, karıştırma ve B ile TMB çözeltisi hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında damıtılmış su ve mağaza 5N sülfürik asit (H 2 SO4) ekleyerek durdurma çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 2. immünosorbent deneyleri (ELISA) Enzim bağlantılı NOT: Doğrudan ligand-reseptör etkileşimi ELISA (doğrudan LRA, Şekil 1) reseptör-ligand bağlanma afınitesinin bir ölçüsü olarak, sabit bir reseptör-ligand ayrışma (KD) ölçülmesi için kullanılabilir. Yarışma ligand-reseptör etkileşimi ELISA (rekabet LRA, Şekil 2) Bütünligand ve reseptör arasındaki etkileşime müdahale etmek hareket peptidler (ve diğer bloke edici bileşiklerin), elenmesi akımları. Daha önce 5 yayımlandı temel protokol daha da optimize edildi. Not: Yöntemler, her adımda 96-kuyulu plakanın kuyularına çözüm eklemek için çok kanallı pipet kullanın ELISA hem de. Çözelti tortusundan ayırma veya yıkama adımlarında, lavabo doğrudan çözüm dışarı atmak. <ol><li> Doğrudan ligand-reseptör-etkileşim deneyi (doğrudan LRA) NOT: iş akışı bir örnek için (Şekil 1). <ol><li> Rekombinan reseptör ile kaplama Plaka <ol><li> 100 ng / ul nihai konsantrasyona kadar karbonat tamponu içerisinde yeniden birleştirici alıcısını seyreltilir. de çok kanallı bir pipet kullanılarak her 100 ul pipetleme sabit reseptör konsantrasyonu (100 ng / ml) ile 96-çukurlu mikrotitre plakasının Coat kuyu. iyi kenar artifakı önlemek için plakanın dış duvarları hariç. Bir kapak ile plaka Kapak ve inkübe4 ° CO / N plaka. </li></ol></li><li> Engelleme ve Ligand eklenmesi <ol><li> Sonraki gün, lavaboya plaka eğerek Kaplama çözeltisini çıkarın ve yıkama çözeltisi (PBS +% 0.05 hac / hac Tween 20) ile plaka 3 kez yıkayın. </li><li> de çok kanallı bir pipet kullanılarak her% 5 BSA çözeltisi 200 ul kullanılarak kaplanmış bir tabak üzerinde serbest reseptör bağlanma sitesi engelleme ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. </li><li> Engelleme çözüm atın (. adım 2.1.2.1) ve yıkama solüsyonu ile plaka 3 kez yıkayın. </li><li> Farklı konsantrasyonlarda (rekombinant His-etiketli ligandları hazırlayın, örneğin, 8 ug / ml, 4 mg / ml, 2 ug / ml, 1 ug / ml, 0.5 ug / ml, 0.25 ug / ml, 0.125 ng / ml, 0.063 ng / ml&#39;lik son yoğunluğa seyreltildi, 0.031 ug / ml, 0.0 ug / ml). boş kuyularda sadece PBS ekleyin. </li><li> Kopya halinde kuyulara her bir ligand konsantrasyonu 100 ul ilave edin ve reseptör-ligand sağlayan oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe levhasınıetkileşimi. </li></ol></li><li> Antikorları ile inkübasyon <ol><li> lejandlarla kuluçkaya yatırmayı takiben, yıkama çözeltisi plaka 3 kez yıkayın. </li><li> Pipet birincil anti-His fare monoklonal antikoru çözeltisi (1: 1000), 100 ul her bir göze. </li><li> 2 saat oda sıcaklığında inkübe levhasını; İnkübasyondan sonra antikor çözeltisi (adım 2.1.2.1 bkz.) iptal ve yıkama çözeltisi plaka 3 kez yıkayın. </li><li> Her bir oyuğa: HRP 100 ul keçi anti-fare IgG ikincil antikor çözeltisi (10.000 1) bağlanmış ekleyin. Oda sıcaklığında, 45 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> antikor çözüm atın (. adım 2.1.2.1) ve yıkama solüsyonu ile plaka 3 kez yıkayın. </li></ol></li><li> Substrat ve Kalkınma eklenmesi <ol><li> Oda sıcaklığına TMB substrat çözüm getirmek ve 1 TMB substrat çözeltisi A ve B hazırlanması: 1 oranında. Taze her çukuruna substrat hazırlanan 100 ul ilave edin ve 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka tutun. Yeterli col sonra<html> veya geliştirme 50 ul durdurma çözüm ekleyin. </li></ol></li><li> Plaka ve Veri Analizi Okuma Not: Açıklanan protokol ölçülen sinyal spesifik bağlanma yükselir varsayımına dayanır. Sinyale belirsiz bağlama katkısını tahmin etmek gerekli olabilir ama bu protokol kapsamı dışındadır. <ol><li> şirketinden 450 nm&#39;de absorbansı (optik yoğunluk, OD) okuyun. </li><li> ölçülen OD değerleri arka plan sinyalini çıkarma ve bunları normalleştirmek. (10 günlük, tabanı 10) logaritmik ölçeğe ligand konsantrasyonunun tüm değerleri Transform. </li><li> Normalize ve arka plan OD değerleri düzeltilmiş arsa (10 ölçek log, X ekseni) ligand konsantrasyonunun logaritmasının karşı (Y-ekseni, işgal reseptör bağlanma sitelerinin fraksiyonu karşılık gelir). </li><li> K D değerini tahmin etmek Hill denkleminin aşağıdaki forma veri sığdırmak: tp_upload / 53575 / 53575eq1.jpg &quot;/&gt; NOT: Burada Y, işgal reseptör bağlanma siteleri ve Y max bağlayıcı maksimal bölümünü gösterir; [L] serbest ligand ve Hill katsayısı konsantrasyonunu ifade eder. ligand için tek bağlanma sahası varsa, Hill katsayısı n birden fazla ligand birleşme alanından sistemler için = 1, bağlayıcı sergileyen pozitif bir birliktelik olup eğer n&gt; 1, negatif kooperativiteye eğer n &lt;1 ve n Hayır kooperativiteye = 1 mikroskopik ayrışma sabiti olarak adlandırılır ve yarı maksimal etkili konsantrasyon EC50 6 karşılık gelir. Görünen ayrışma sabiti Kd = (KD) n. En basit durumda n = 1, bağlanma yerleri reseptör yarısı işgal ve Kd = Kd hangi ligand konsantrasyonu ayrışma sabiti tekabül. Bu model sadece küçük bir kısmını bu yanı sıra, denge koşulları altında bağlayıcı kitle eylemi varsayarilave ligand reseptöre bağlanır, yani [L] &gt;&gt; [rj]. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig1.jpg" /> Şekil 1. Doğrudan ligand-reseptör-etkileşim deneyi (doğrudan LRA). Direkt LRA için adım-adım protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="2"><li> Rekabet Ligand-Reseptör-Etkileşim Analizi (rekabet LRA) NOT:. Iş akışının bir illüstrasyon bakınız Şekil 2 için rekabet LRA prosedürü ligand önemli değişiklikler dışında aynı direkt LRA adımları (plaka kaplama, antikor inkübasyon, plaka geliştirme) izler ve ilave adımını peptidierinin. Uygun negatif kontroller Bu deney için gereklidir. Bir önceki tarama çalışmasında &lt;sup&gt; 4, şifreli engelleme peptid antagonistik etki göstermemiştir. <ol><li> Engelleme - Ligand ve Engelleme Peptidlerin eklenmesi <ol><li> Ertesi gün, kaplama çözüm kaldırmak ve (2.1.2.1 bakınız) plakayı yıkayın. </li><li> her çukuruna% 5 BSA çözeltisi 200 ul ekleyerek kaplanmış bir tabak üzerinde bloke edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. </li><li> PBS içinde sabit bir konsantrasyonu (2x-20 ng / ml) yeniden birleştirici His-etiketli ligandları (IFNL1-3) hazırlayın. </li><li> Bir doz-tepki eğrisi garanti etmek için 10 nM ila 100, PBS içinde uM arasında değişen farklı konsantrasyonlarda bloke peptidi (bakınız Tablo 3) hazırlanır. NOT: Bu bloklama peptidi için IC50 değeri daha sonra belirlenmesini mümkün kılar. Kontrol kuyuları, en fazla (% 100) bağlanma elde etmek için peptit olmayan tek sabit bir ligand konsantrasyonu ekleyin. Boş olarak, ligand veya peptid olmayan tek PBS ilave edin. </li><li> ligandlar, 50 ul (IFNL1-3) ve her bir PE 50 ul eklekopyalar halinde çukurlara ptide konsantrasyonu. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca plaka inkübe edin. </li></ol></li><li> Plaka ve veri analizi Okuma Not: Açıklanan protokol ölçülen sinyal spesifik bağlanma yükselir varsayımına dayanır. Sinyale belirsiz bağlama katkısını tahmin etmek gerekli olabilir ama bu protokol kapsamı dışındadır. <ol><li> şirketinden 450 nm&#39;de absorbansı (optik yoğunluk, OD) okuyun. </li><li> ölçülen OD değerleri arka plan sinyalini çıkarma ve bunları normalleştirmek. (10 günlük, tabanı 10) logaritmik ölçeğe peptid konsantrasyonu tüm değerlerini dönüştürmek. </li><li> Normalize ve arka plan OD değerleri düzeltilmiş arsa (10 ölçek log, X ekseni) ligand konsantrasyonunun logaritmasının karşı (Y-ekseni, işgal reseptör bağlanma sitelerinin fraksiyonu karşılık gelir). </li><li> IC50 değerini belirlemek için, aşağıdaki eşitliğe uygun verileri: <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575eq2.jpg" /> NOT: Burada [P] peptid konsantrasyonu ve Tepesi eğimi. Doruk eğim doz-yanıt eğrisinin dikliği açıklanmaktadır. IC50 ligand ve reseptör arasındaki bağlanmanın% 50 inhibisyonu gözlemlenirse edildiği inhibitör konsantrasyonuna tekabül etmektedir. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53575/53575fig2.jpg" /> Şekil 2. Yarışma ligand-reseptör etkileşim deneyi (yarışma LRA). Rekabet LRA için adım-adım protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53575/53575fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+and+techniques+to+study+ligand-receptor+interactions+and+receptor+activation+by+TNF+superfamily+members%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members.</a> Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+analysis+of+anti-citrullinated+protein%2Fpeptide+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biosensor analysis of anti-citrullinated protein/peptide antibody affinity.</a> Analytical biochemistry. 465, 96-101 (2014).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell-adhesion+molecule+interactions+using+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell-adhesion molecule interactions using surface plasmon resonance.</a> Curr Opin Immunol. 8, 257-261 (1996).</li>
<li>Egli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-28B+is+a+key+regulator+of+B-+and+T-cell+vaccine+responses+against+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IL-28B is a key regulator of B- and T-cell vaccine responses against influenza.</a> PLoS Pathog. 10, e1004556(2014).</li>
<li>Rosenbluh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positively+charged+peptides+can+interact+with+each+other%2C+as+revealed+by+solid+phase+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Positively charged peptides can interact with each other, as revealed by solid phase binding assays.</a> Analytical biochemistry. 352, 157-168 (2006).</li>
<li>Goutelle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation%3A+a+review+of+its+capabilities+in+pharmacological+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+clinical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Hill equation: a review of its capabilities in pharmacological modelling.</a> Fundamental & clinical pharmacology. 22, 633-648 (2008).</li>
<li>Levin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+derived+from+HIV-1+integrase+that+bind+Rev+stimulate+viral+genome+integration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Peptides derived from HIV-1 integrase that bind Rev stimulate viral genome integration.</a> PLoS One. 4, e4155(2009).</li>
<li>Egli, A., Santer, M. D., O'Shea, D., Tyrrell, D. L., Houghton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+interferon-lambda+family+on+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">The impact of the interferon-lambda family on the innate and adaptive immune response to viral infections.</a> Emerging infectious diseases. , e51(2014).</li>
<li>Gad, H. H., Hamming, O. J., Hartmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+human+interferon+lambda+and+what+it+has+taught+us%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">The structure of human interferon lambda and what it has taught us.</a> J Interferon Cytokine Res. 30, 565-571 (2010).</li>
<li>Folch, B., Rooman, M., Dehouck, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermostability+of+salt+bridges+versus+hydrophobic+interactions+in+proteins+probed+by+statistical+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+information+and+modeling%22%5BJournal%5D)">Thermostability of salt bridges versus hydrophobic interactions in proteins probed by statistical potentials.</a> Journal of chemical information and modeling. 48, 119-127 (2008).</li>
<li>Yuzlenko, O., Lazaridis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+ionizable+amino+acid+side+chains+at+a+lipid+bilayer-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+physical+chemistry.+B%22%5BJournal%5D)">Interactions between ionizable amino acid side chains at a lipid bilayer-water interface.</a> The journal of physical chemistry. B. 115, 13674-13684 (2011).</li>
<li>Tissot, A. C., Vuilleumier, S., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+two+buried+salt+bridges+in+the+stability+and+folding+pathway+of+barnase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Importance of two buried salt bridges in the stability and folding pathway of barnase.</a> Biochemistry. 35, 6786-6794 (1996).</li>
</ol>

A.E. "SNSF Ambizione Score" programı (PZ00P3_154709), "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" Basel Üniversitesi, Stiftungsinfektionskrankheiten Basel ve Bangeter Rhyner Stiftung tarafından verilen araştırma hibelerinden destek gördü. J.L., SystemsX.ch inisiyatifinin sistem biyolojisi programından (9uncu çağrı) bir iPhD bursundan destek aldığını belirtmektedir.

ELISA birçok laboratuvar için standart ve köklü bir yöntemdir. Biz daha değiştirilebilir ve daha önce yayınlanan bir yöntem, 5,7 iyileştirilmiştir. Gösterilen adım adım protokolü ligand-reseptör etkileşimlerinin KD değerlerinin belirlenmesi için basit bir şekilde nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, ligand-reseptör etkileşimi engelleyen bir bloke edici peptidin IC50 belirlenebilir. En araştırmacılar daha önce bir ELISA protokolü kullanılır gibi büyü...

sinyal yollarının kapsamlı bir anlayış ligand-reseptör etkileşimi hakkında detaylı bilgi gerektirir. Spesifik reseptör ile belirli bir ligandın etkileşiminin değerlendirmek için en yöntemleri zaman alıcı, emek yoğun, pahalı ve özel ekipman ve uzmanlık 1 gerektirir. doğrudan ligand-reseptör etkileşimi deneyi (LRA) ve rekabet LRA: Bu makale immünosorbent deneyi (ELISA) ile bağlantılı bir enzimin göre ligand-reseptör etkileşimi araştırmak için iki hızlı ve güvenilir bir nokta-nokta protokollerini tasvir eder. ELISA rutin hemen hemen her laboratuvarda kullanılan yüksek, duyarlı özel ve hazır bir tekniktir. ELISA yapıldı ve çeşitli usullerde uyarlanabilir. sunulan protokoller farklı lambda interferonlar (INFLs) ve reseptörü arasındaki etkileşimin araştırılması için optimize edilmiştir. Doğrudan LRA bir quantificati sağlarLigand-reseptör ligand konsantrasyonuna göre bağlanma ve böylece bağlanma eğrisini verir. Ligand-reseptör etkileşimi için uygun bir model kullanılarak veriler ayrıca ayrılma sabiti (KD) tahmin etmek için analiz edilebilir. Sunulan protokol olarak, yaygın olarak kullanılan, Hill denklemi ligand-reseptör modeli uygulanır. Bu tür yüzey plazmon rezonans tekniği 2,3 gibi diğer yöntemler, iki protein arasındaki bağlanma afiniteleri tespitine imkan da, bu teknoloji, emek-yoğun, pahalı ve özel laboratuar donanımına ihtiyaç duymaktadır. Yarışma LRA önleyici peptidlerin taranmasını sağlar: bağlayıcı ligand-reseptör peptit konsantrasyonuna göre ölçülür. Bu peptid inhibitör etkisini açıklayan bir doz-yanıt eğrisi elde edilir. Veriler bundan başka, 50 IC (yarım maksimal inhibisyon konsantrasyonunu tahmin etmek için analiz edilebilir </alt&gt;) bloke peptid. Hem ELISA protokolleri kullanımı kolay ve araştırma soruları geniş bir şekilde adapte edilebilir. herhangi bir rekombinant proteinler, güvenilir ve hızlı iletişim düzenlemelerini belirlemek için kullanılır. Buna ek olarak, rekabet LRA ligand veya reseptör, ya taklit edecek şekilde tasarlanmıştır bloke peptidler kullanılarak ligand ve reseptör kritik etkileşim bölgelerine belirlemek için kullanılabilir. bloke peptid etkin ve spesifik inhibisyonunu gösteriyorsa, peptid kritik bir etkileşim ligandın sitesi (peptid taklit halinde reseptör) veya ligand (peptit taklit halinde ligandı) kaplar. İlk protokol farklı INFLs K D değeri belirlenmesi ve bunların reseptörünün alfa alt birimini, yani açıklar, direkt LRA kullanarak interlökin-28 reseptör (IL28RA). Daha sonra, ikinci protokol bir 20 amino asit uzunluğunda bir peptid kapasitesini belirlemek için gösterilmiştirINFL-IL28RA etkileşimi inhibe eder. peptid reseptör bağlanma yerinde IFNLs ile rekabet etmek için tasarlanmış olup bir etkileşimin moleküler bir anlayış mümkün kılar. Bundan başka, bu peptidin aşağı akış sinyalleme etkileri 4 üzerindeki etkisini belirlemek için in vitro deneylerde IL28RA engellemek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td>ELISA plakası</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>Merck</td><td>497-19-8</td><td>ELISA plakası kaplama tamponu için</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbomcane(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>144-55-8</td><td>ELISA plakası kaplama tamponu için</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td>Engelleme için PBS içindeki %5 BSA</td></tr><tr><td>rhIL-28R&alpha;/IFN&lambda;R1</td><td>R&amp;D systems</td><td>5260-MR</td><td>Rekombinant insan interlökin-28 Reseptörü alfa</td></tr><tr><td>rhIL-29/IFN&lambda;1</td><td>R&amp;D systems</td><td>1598-IL/CF</td><td>Rekombinant insan interlökin-29/Taşıyıcısız/C-terminal 10-His etiketi</td></tr><tr><td>rhIL-28A/IFN&lambda;2</td><td>R&amp;D systems</td><td>1587-IL/CF</td><td>Rekombinant insan interlökin-28A/Taşıyıcısız/C-terminal 6-His etiketi</td></tr><tr><td>rhIL-28B/IFN&lambda;3</td><td>R&amp;D systems</td><td>5259-IL/CF</td><td>Rekombinant insan interlökin-28B/Taşıyıcısız/C-terminal 6-His etiketi</td></tr><tr><td>6x His Monoklonal antikor (Fare)</td><td>Clontech</td><td>631212</td><td>His etiketli Ligandları yakalamak için birincil antikor</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-035-166</td><td>At kestanesi Peroksidaz konjuge ikincil antikor</td></tr><tr><td>BDoptEIA TMB reaktifi seti</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>ELISA - TMB substrat çözeltisi</td></tr><tr><td>Sülfürik asit (H2SO4)</td><td>Fulka</td><td>84720</td><td>5 N H2SO4 (Enzim reaksiyonu durdurma çözeltisi)</td></tr><tr><td>Synergy/H1 - Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTeK</td><td></td><td>ELISA plaka okuyucu</td></tr></tbody></table>

bir elisa tabanlı bağlama ve rekabet yöntemi hızla ligand-reseptör etkileşimleri belirleme

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Sinyal yollarının kapsamlı bir şekilde anlaşılması, ligand-reseptör etkileşimi hakkında ayrıntılı bilgi gerektirir. Bu makale, ligand-reseptör etkileşimlerinin araştırılması için enzim-bağlı immünosorban testlerinin (ELISA) iki hızlı ve güvenilir nokta nokta protokolünü açıklamaktadır: doğrudan ligand-reseptör etkileşimi analizi (LRA) ve rekabetçi LRA. Örnek olarak, farklı lambda interferonlarının (IFNL'ler) ve bunların reseptörlerinin (IL28RA) alfa alt biriminin arasındaki etkileşimin ELISA tabanlı analizi sunulmaktadır: doğrudan LRA, reseptör ve IFN ligandları arasındaki ayrışma sabitlerinin (KD değerleri) tayininde kullanılır ve rekabetçi LRA, IFNL'lerin reseptör bağlanma bölgesinde onlarla rekabet etmek üzere tasarlanmış bir oligopeptidin inhibitör kapasitesinin belirlenmesi için kullanılır. KD ve yarı maksimal inhibitör konsantrasyon (IK50) değerlerini tahmin etmek için analitik adımlar açıklanmaktadır. Son olarak, tartışma, sunulan yöntemin avantajlarını ve dezavantajlarını vurgular ve sonuçların ligand-reseptör etkileşimlerinin daha iyi moleküler anlaşılmasına nasıl olanak sağladığını açıklar.

INFL1-3 ve reseptör alfa alt birimi IL28RA arasındaki ayrılma sabitleri doğrudan LRA kullanılarak belirlenmiştir. Sonuçlar Şekil 3&#39;te gösterilmektedir: bağlantı konumları fraksiyonu ilgili IFN konsantrasyonu logaritmasına karşı grafiği çizilir. verilerinin Scatchard çizimi sağ alt köşesinde gösterilir. Sonuçlar doğrudan LRA daha KD değerini tahmin etmek için analiz edilebilir bir bağlama eğrisi, verir olduğunu göstermektedir. KD değeri Hill denk...

Sunulan protokoller, ligand-reseptör etkileşimlerinin hızlı araştırılması için iki enzim bağlı immünosorban testi (ELISA) tabanlı tekniği tanımlar: İlk test, ligand ve reseptör arasındaki ayrışma sabiti tayinini sağlar. İkinci test, ligand-reseptör etkileşimleri için blokaj peptidlerinin hızlı bir şekilde taranmasını sağlar.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Bu ELISA tabanlı yöntemin amaçları, ilk olarak bir sitokinin reseptörüne bağlanma afinitesini belirlemek ve ikincisi, ligand-reseptör etkileşiminin inhibitör peptitlerinin engelleyici etkilerini ölçmektir. Bu yöntem, protein-protein etkileşimleri alanında, sitokin-reseptör bağlanması gibi temel sorulara cevap verebilir. Bağlanma afiniteleri ve bunların blokajı, etkileşim dinamiklerinin genel anlayışını artırabilir.Bu tekniğin ana avantajı, kolayca yapılabilir, etiketli reseptörler üretir ve ELISA okuyucu gibi kolayca ulaşılabilir malzemelerin kullanılması nedeniyle nispeten ucuzdur. Bu yöntem sitokin reseptör etkileşimine dair bilgi sağlarken, genel protein-protein etkileşimleri ve spesifik etkileşimleri inhibe etmek için tıkayıcı bileşiklerin tasarlanması gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Çözeltileri metin protokolünde belirtilen şekilde hazırlayın.Karbonat kaplama tamponunu 0,22 mikron PES membranla filtrelediğinizden emin olun. Vakum kullanın. Ayrıca, her ligand veya peptit için 10 farklı konsantrasyon hazırlayın.Bu videoda iki test açıklanmaktadır, birincisi doğrudan ligand reseptör etkileşimi ELISA'dır. Bu, reseptör-ligand ayrışma sabitini ölçmek için kullanılabilir ve bu da reseptör-ligand bağlanma afinitesini temsil eder. İkinci test, yakın zamanda optimize edilmiş bir rekabetçi ligand-reseptör etkileşimi ELISA'dır.Bu, peptitlerin ve diğer tıkayıcı bileşiklerin, reseptör-ligand etkileşimine müdahale etmek için kullanılmasının taranmasına izin verir. Verimlilik için, 96 kuyuluk plakalar için çok kanallı pipetlerin kullanılmasına hazırlanın ve dökerken, sadece içeriklerini boşaltın. Bu prosedürü plakayı bir rekombinant reseptörle kaplamaktan başlayın.İlk olarak, reseptörü karbonat tamponunda 100 nanogram/mikrolitre'ye seyreltin. Ardından, plakayı 100 mikrolitre reseptör çözeltisi ile doldurun. Plaka kenarının etkisini önlemek için dış duvarları hariç tutun.Plağı örtün ve gece boyunca 4 derece Celsius'ta kuluçkaya bırakın. Tüm plak inkübasyonlarını hafifçe sallayarak gerçekleştirin. Ertesi gün, kaplama çözeltisini çıkarın ve plakayı yıkama çözeltisi, Tween 20'li PBS ile üç kez yıkayın.Daha sonra, serbest reseptör bağlanma bölgelerini 200 mikrolitre %5 PSA ekleyerek bloklayın. Blokajın tamamlanması için plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın. Daha sonra kuyuları boşaltın ve plakayı önceki gibi yıkayın.Şimdi, kuyuları rekombinant his-tag ligandın çeşitli seyreltmeleri ile 100 mikrolitre yükleyin. Her konsantrasyonu iki kopya halinde yükleyin. Boş kuyulara sadece PBS yükleyin.Daha sonra, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ligantlerle inkübasyonun ardından plakayı yıkama çözeltisiyle üç kez yıkayın. Ardından, her kuyuya 100 mikrolitre birincil anti-his fare monoklonal antikoru pipetleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın.Antikoru yıkadıktan sonra, her kuyuya 100 mikrolitre HRP eşleştirilmiş keçi anti-fare IGG ikincil antikoru çözeltisi ekleyin. Işıktan korunmak için plakayı alüminyum folyo ile sarın. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya bırakın.İkincil antikoru çıkarmak için standart yıkama tekniğini kullanın. Şimdi, her kuyuya taze hazırlanmış, stoka eşit miktarlarda çözelti A ve B'den yapılmış TMB'nin 100 mikrolitre'sini ekleyin. Ardından, plakayı oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletin. Ardından, yeterli renk gelişiminden sonra, her kuyuya 50 mikrolitre stoka ekleyin.Protokol, iletilmiş sinyalin özgül bağlanmadan kaynaklandığı varsayımına dayanmaktadır. Sinyale özgül olmayan bağlanmanın katkısını tahmin etmek gerekebilir. Ardından, plak absorbans değerlerini 450 nanometrede okuyun ve KD değerini hesaplamaya devam edin.Rekabetçi LRA prosedürü, doğrudan LRA prosedürü ile aynı adımları takip eder, ancak birkaç önemli değişiklik vardır. Fazla kaplama ligandlarını plakada yıkadıktan sonra, plak kuyularını bloklayın. Her kuyuya 200 mikrolitre %5 BSA çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya bırakın.Inkübasyon sırasında, rekombinant his-tag ligandlarını PBS içinde sabit bir konsantrasyon olan 10 nanogram/mililitrede hazırlayın. Ardından, 10 nanomolar ila 100 mikromolar arasında değişen farklı konsantrasyonlarda PBS içinde bloklama peptidini hazırlayın, böylece doz-cevap eğrisi sağlanır. Böylece, bloklama peptidi için IC50 değeri bulunabilir.Kontrol kuyularında, maksimum bağlanmayı elde etmek için peptit içermeyen sabit ligand konsantrasyonunu yükleyin. Boş kuyularda, sadece ligand veya peptit içermeyen PBS ekleyin. Diğer kuyularda, 50 mikrolitre ligand ve her peptit konsantrasyonunun 50 mikrolitre'sini ekleyin.Daha sonra, plakayı oda sıcaklığında iki saat inkübe edin ve her zamanki gibi devam edin. Üç farklı interferon ligand peptidi ve reseptör alfa alt birimi IL28R-a arasındaki ayrışma sa

an-elisa-based-binding-competition-method-to-rapidly-determine-ligand

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu videoda, ligandlar ve hedef analitler arasındaki moleküller arası etkileşimleri gerçek zamanlı olarak tespit etmek için biyokatman interferometrisi (BLI) teknolojisini gösteriyoruz. BLI, çözelti içindeki analitlerle etkileşime girerken bir biyosensör yüzeyi üzerindeki hareketsizleştirilmiş ligandlardan oluşan bir tabakadan yansıyan beyaz ışığın girişim modelindeki değişiklikleri ölçer.

Ligand ve Analit Arasındaki Etkileşimleri Tespit Etmek için Biyokatman İnterferometri Teknolojisi

Bu videoda, CXCR4 hedefleyen küçük bir molekülün varlığında CXC Kemokin Reseptörü 4 (CXCR4) ile floresan etiketli doğal ligandı CXC Kemokin Ligand 12 (CXCL12) arasındaki etkileşimleri tespit etmek için akış sitometrisine dayalı rekabetçi bir bağlanma testini açıklıyoruz. CXCR4 eksprese eden hücrelerin daha düşük küçük molekül konsantrasyonları ile inkübe edilmesi, CXCR4-CXCL12'nin bir dereceye kadar bağlanmasına izin verir, bu da küçük molekül konsantrasyonlarında kademeli bir artışla kademeli...

Reseptör-ligand etkileşimlerini bozan bileşikleri tanımlamak için rekabetçi bağlanma testi

Bu video, reseptör-ligand etkileşiminin raportör testine dayalı tespitini göstermektedir. Başarılı reseptör-ligand etkileşimi, aşağı akış sinyal yolunu aktive ederek, çözelti içinde salgı raportör molekülleri olarak sitokinlerin üretilmesine ve salınmasına neden olur, bu da ELISA kullanılarak doğrulanır.

BW Hücrelerinde Reseptör-Ligand Etkileşimini İncelemek için ELISA Tabanlı Raportör Testi

Bu videoda, reseptörler ve ligandlar arasındaki kuvvetleri ölçmek için biyomembran kuvvet probları (BFP'ler) kullanılmıştır. Bu teknik, prob boncukları üzerinde konjuge edilen pMHC ile hedef hücreler üzerindeki TCR'ler arasındaki bağları kırmak için gereken basıncı izleyerek etkileşimleri tespit edebilir.

Reseptör-ligand etkileşimlerini ölçmek için biyomembran kuvvet probu

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.

Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)

İlaç yüklü proteini şablon olarak kullanan ultra küçük floresan altın nanokümelerinin (Au NC'ler) yerinde sentezine dayanan küçük moleküler ilaç taraması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, protein şablonlu Au NC'lerden yayılan görünür bir floresan sinyali ile ilaçların bir hedef proteine bağlanma afinitesini belirlemek için basittir.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

Titrasyon ELISA gerçekleştirmek için detaylı bir protokol açıklanmıştır. Ayrıca, yeni bir algoritma titrasyon ELISAs değerlendirmek için ve plaka immobilize microtiter reseptör için çözünür bir ligand bağlayıcı bir ayrışma sabiti edinmek için sunulmaktadır.

Titrasyon ELISA reseptör Ligand etkileşim ayrışma sabiti belirlemek için bir yöntem olarak

Ayrıca antifriz proteinleri olarak bilinen buz bağlayıcı protein (IBPs), buz büyümesini engelleyen ve doku dondurma kullanım için umut verici bir katkı maddesi vardır. IBPs araştırmak için kullanılan başlıca araç nanolitre Osmometer olduğunu. Biz bir optik mikroskop üzerine monte edilmiş bir ev tasarlanmış soğutma aşamasında geliştirilen ve özel olarak geliştirilmiş bir LabVIEW rutin kullanılarak kontrol. Nanolitre Osmometer ultra-hassas bir şekilde numune sıcaklık manipüle burada açıklanan.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Öğrenin, ELISA tabanlı bağlama ve rekabet yöntemiyle ligand-reseptör etkileşimlerini hızla belirlemeyi. Sitokin-reseptör bağlanma afinitesi ve inhibitör peptitlerin etkisini ölçerek protein-protein etkileşim dinamiklerini anlayın.

Bir ELISA Tabanlı Bağlama ve Rekabet Yöntemi Hızla Ligand-reseptör Etkileşimleri belirleme

Daha fazla video keşfet