bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 2. Genel Uygulamalar

Bu prosedürün genel amacı, örnek olarak plak tahlilini kullanarak biyogüvenlik seviye 4 giysili bir laboratuvarda çalışırken güvenli uygulamaları göstermektir. Bu prosedür, biyogüvenlik seviyesi 4 ortamında standart bir plak testi gerçekleştirmek için gerekli değişiklikleri gösterir. Entegre Araştırma Tesisi'nden bir teknisyen olan Tracey Burdette ile birlikte prosedürü benimle birlikte gösteriyor.

Günlük iç sistem kontrol listesini tamamladıktan sonra, kanat dahil olmak üzere iç kısmına %5 çift kuaterner amonyum dezenfektan solüsyonu püskürterek sınıf II biyolojik güvenlik kabinini temizleyin. Ardından, kabini kağıt havluyla silin, tahlil sırasında ve sonrasında eldivenli ellere püskürtmek için dezenfektan solüsyonu içeren sprey şişesini kabinin içinde bıraktığınızdan emin olun. Yapışkan dezenfektan solüsyonunu çıkarmak için kabinin ve kanadın içine %70 etanol solüsyonu püskürtün.

Biyogüvenlik kabini için bir atık kabı hazırlayın. Atık kabındaki ikili kuaterner amonyum dezenfektan çözeltisinin nihai konsantrasyonunun% 5'ten az olmadığından emin olun.eklenen herhangi bir ilave sıvıyı dikkate alarak. %5 ikili kuaterner amonyum dezenfektan çözeltisi içeren atık kabını sınıf II biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.

Tüm çalışmaları sınıf II biyogüvenlik kabininin iç merkezine mümkün olduğunca yakın gerçekleştirin. İç merkez, kendini korumak için en duygusal pozisyon olacak şekilde tasarlanmıştır. 50 mikrolitre virüs örneğini çıkarın ve virüsü kontrol edin ve bunları seyreltme kuyucuklarında% 2 fetal sığır serumu içeren 450 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamına yerleştirin.

Gerektiği kadar seri seyreltme yapmaya devam edin. Her seyreltmeden sonra virüs örneklerini pipet ucuyla en az beş kez karıştırın, pipet uçlarını değiştirin. Numunelerde hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için yavaşça karıştırın.

Tamamlandıktan sonra, seyreltme kuyularını bir kenara koyun. Uçları atarken, ucu atık kovasına atmadan önce ucun içini ve dışını dekontamine etmek için her bir ucu atık kovasından dezenfektan solüsyonla durulayın. Ortamın çoğunu altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının kuyularından çıkarın.

100 mikrolitre doğru numuneyi, önceden etiketlenmiş plakaların uygun kuyusuna iki kopya halinde ekleyin. Tamamlandıktan sonra, eldivenli ellerinize dezenfektan solüsyonu püskürtün. Plakaları elle inkübatöre yerleştirmeden önce tüm plakaların dışını silmek için dezenfektan solüsyonla ıslatılmış bir kağıt havlu kullanın.

Numunenin bir saat boyunca her 15 dakikada bir hücreler üzerinde düzgün bir şekilde dağılmasını sağlamak için plakaları şekil-8 hareketiyle sallayın. Her bir kuyucuğa iki mililitre kaplama karışımı ekleyin ve kaplamanın kuyu yüzeyi boyunca eşit dağılımı için şekil-8 hareketiyle bir kez daha sallayın. Tüm atık malzemeleri en az 10 dakikalık bir temas süresi boyunca atık kovasına% 5'lik dezenfektan solüsyonuna tamamen daldırın.

Atık kovasının içine ve dışına, sınıf II biyogüvenlik kabininin içine, ekipmanın dışına ve eldivenli ellere %5 dezenfektan solüsyonu püskürtün. Solüsyonun atık kovasında ve diğer yüzeylerde 10 dakikalık bir temas süresi boyunca kalmasına izin verin. Daha sonra eşyaları biyogüvenlik kabininden çıkarın ve lavaboya götürün.

Kullanılmış pipeti otoklavlama için bir pipet tepsisine yerleştirin. Atık kovasının içindekileri lavabodaki bir süzgecin içine boşaltın. Daha sonra kırmızı bir biyolojik tehlike torbası ile kaplı bir biyolojik tehlike atık kabını lavaboya getirin ve süzgecin içindekileri kırmızı biyolojik tehlike torbasına boşaltın.

Biyolojik tehlike torbasını bir araba üzerindeki otoklav tepsisine yerleştirin. Otoklav torbalarını, torbaya buhar girmesine izin verecek şekilde bantla gevşek bir şekilde kapatın. Ve otoklav bantlarından birini kişinin baş harfleri ve tarihi ile etiketleyin.

Delikli metal çubuğu otoklavdan çıkarın ve üstünü açın. Otoklav sterilizasyon döngüsünün başarıyla tamamlandığını kontrol etmek için Geobacillus stearothermophilus sporlarını içeren bir biyolojik indikatör şişesini metal çubuğa yerleştirin. Atıklarla dolu otoklav tepsisini otoklava yerleştirin.

Otoklavı başlatın ve döngünün başladığını kontrol edin. Otoklavın çalışma ekranı, o çalışma için kalan süreyi gösterecektir. Gerekli inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, plak tahlil plakalarını inkübatörden dikkatlice çıkarın ve elle temiz sınıf II biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

Ortamı aspire edin ve malzemeyi bir pipetle kaplayın ve dezenfektan solüsyon kabına dağıtın. Virüsü 30 dakikalık bir temas süresi boyunca etkisiz hale getirmek için ortamı% 10 nötr tamponlu formalin ve% 0.8 kristal menekşe karışımı ile değiştirin. İnaktivasyondan sonra, nötr tamponlu formalin/kristal viyole karışımını dikkatlice çıkarın ve atmadan önce nötralize edilmek üzere ayrı bir atık kabına koyun.

Lavaboda, fazla lekeyi çıkarmak için plakaları durulayın ve ardından plakaları tamamen kuruması için bir tepsiye koyun. Plakaları saymak için bir ışık kutusu kullanın. Tüm sayımları kaydedin ve standart denklemden virüs titrelerini hesaplayın.

Etkisiz hale getirilmiş numunelerin BSL-4 laboratuvarından çıkarılması için, tüpleri veya plakaları bir ısıyla yapıştırma torbasına yerleştirin. Torbanın içini ve numune tüplerinin dışını dezenfekte etmek için torbanın içine %5 dezenfektan veya sabitleyici solüsyon püskürtün. Ve sonra torbayı ısıyla kapatın.

Bu poşeti aynı prosedürü izleyerek başka bir poşete yerleştirin. İkinci poşeti ısıyla kapatın ve çift sızdırmaz poşetleri, poşetlerin dışını dezenfekte etmek için en az 10 dakika boyunca %5 dezenfektan solüsyonu içeren bir dunk tankına yerleştirin. Tüplerin sayısını ve boyutunu, tüplerdeki hacmi, kullanılan ajanı, kullanılan inaktivasyon yöntemini ve numunelerin aktarılacağı odayı tanımlayarak laboratuvar içinde bir smaç tankı kayıt defteri doldurun.

Biyogüvenlik seviye 4 laboratuvarında uygun prosedürlerin takip edilmesi, testlerin güvenli ve etkili bir şekilde tamamlanmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Laboratuvar personeli, doldurulmuş günlük iç kontrol listesine başvurarak ekipmanın tam olarak çalışır durumda olduğundan emin olur. Virüs örneği, oyuk başına 30 ila 300 plak içeren plakalar elde etmek ve virüs titresini belirlemek için seri olarak seyreltilir.

Konak hücre hatları için virüs tropizmi, aşılama tekniği, virüs büyümesi koşulları, uygun seyreltme aralığı ve kaplama seçimi dahil olmak üzere bir dizi faktör plak oluşumunu etkiler. İşlem sırasında biyogüvenlik kabininde oluşan atıklar iki kez dezenfekte edilir. Atıklar, biyogüvenlik kabininden çıkarılmadan önce bir kez uygun şekilde dezenfekte edilir.

Daha sonra, atıklar hayvan biyogüvenlik seviye 4 ortamından ayrılmadan önce otoklavlanır. Bu prosedürleri izleyerek, Frederick'teki Entegre Araştırma Tesisi'ndeki hayvan biyogüvenlik seviye 4 araştırması sırasında laboratuvar kaynaklı hiçbir enfeksiyon kaydedilmemiştir. Bu teknik, tekniğin uygun şekilde uygulanması durumunda numune sayısına bağlı olarak üç ila dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, güvenli ve başarılı bir deney sağlamak için seyreltmeleri doğru bir şekilde yapmayı, plakları buna göre saymayı ve tüm güvenlik önlemlerine uymayı unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, pozitif basınçlı giysilerin getirdiği fiziksel sınırlamaları ve standart bir plak testini tamamlamak için gereken ek süreyi iyi anlamalısınız.