bir (A) Güvenlik Önlemleri ve Çalışma Usul BSL-4 Laboratuvar: 2. Genel Uygulamalar

Bu prosedürün genel amacı, plak sayım yöntemini örnek olarak kullanarak, biyogüvenlik düzeyi 4 kıyafetli bir laboratuvarda çalışırken güvenli uygulama yöntemlerini göstermektir. Bu prosedür, standart bir plak sayım işlemini biyogüvenlik düzeyi 4 ortamında gerçekleştirmek için gerekli olan modifikasyonları göstermektedir. Prosedürü benimle birlikte Entegre Araştırma Tesisi'nden teknisyen Tracey Burdette uygulamalı olarak gösterecektir.

Günlük dahili sistem kontrol listesi tamamlandıktan sonra, ön cam dahil olmak üzere sınıf II biyolojik güvenlik kabininin iç kısmını %5'lik dual kuaterner amonyum dezenfektan çözeltisi püskürterek temizleyin. Ardından kabini kağıt havlularla silin; analiz sırasında ve tamamlandıktan sonra eldivenli ellere püskürtmek için dezenfektan çözeltisi içeren sprey şişesini kabinin içinde bıraktığınızdan emin olun. Yapışkan dezenfektan çözeltisini gidermek için kabin içine ve ön cama %70 etanol çözeltisi püskürtün.

Biyogüvenlik kabini için bir atık kabı hazırlayın. Eklenen tüm sıvıları göz önünde bulundurarak, atık kabındaki çift kuaterner amonyum dezenfektan çözeltisinin nihai konsantrasyonunun %5'ten az olmadığından emin olun. %5'lik çift kuaterner amonyum dezenfektan çözeltisi içeren atık kabını sınıf II biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.

Tüm işlemleri sınıf II biyogüvenlik kabininin iç merkezine mümkün olduğunca yakın bir konumda gerçekleştirin. İç merkez, kişiyi korumak için en etkili konum olacak şekilde tasarlanmıştır. Seyreltme kuyucuklarına 50 µL virüs örneği ve kontrol virüsü alın ve bunları %2 fetal bovine serum içeren 450 µL Dulbecco's Modified Eagle's medium içine yerleştirin.

Gerektiği kadar seri dilüsyonlar yaparak devam edin. Virüs örneklerini, her dilüsyondan sonra pipet ucunu değiştirerek en az beş kez karıştırın. Örneklerde hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için yavaşça karıştırın.

İşlem tamamlandığında, dilüsyon kuyucuklarını kenara ayırın. Pipet uçlarını atarken, ucu atık kovasına bırakmadan önce ucun içini ve dışını dekontamine etmek için her bir ucu atık kovasındaki dezenfektan çözelti ile durulayın. Altı kuyucuklu hücre kültürü plakalarının kuyucuklarındaki besiyerinin büyük kısmını uzaklaştırın.

Doğru numuneden 100 µL'yi, önceden etiketlenmiş plakaların uygun kuyucuklarına duble olarak ekleyin. İşlem tamamlandığında, eldivenli ellerinizi dezenfektan solüsyonu ile püskürterek temizleyin. Plakaları elle inkübatöre yerleştirmeden önce, tüm plakaların dış yüzeylerini dezenfektan solüsyonuna batırılmış bir kağıt havlu ile silin.

Örneğin hücreler üzerine düzgün şekilde yayılmasını sağlamak için plakaları bir saat boyunca her 15 dakikada bir 8 şeklinde sallayın. Her kuyucuğa iki mililitre üst tabaka karışımı ekleyin ve üst tabakanın kuyucuk yüzeyine eşit şekilde dağılması için plakaları tekrar 8 şeklinde sallayın. Tüm atık malzemeleri, en az 10 dakikalık temas süresi boyunca atık kovasındaki %5'lik dezenfektan çözeltisine tamamen batırın.

Atık kovasının içini ve dışını, sınıf II biyogüvenlik kabininin içini, ekipmanların dış yüzeylerini ve eldivenli elleri %5'lik dezenfektan çözeltisi ile püskürterek temizleyin. Çözeltinin atık kovasında ve diğer yüzeylerde 10 dakikalık bir temas süresi boyunca kalmasını sağlayın. Ardından malzemeleri biyogüvenlik kabininden çıkarıp lavaboya götürün.

Kullanılmış pipeti otoklavlanmak üzere bir pipet tepsisine yerleştirin. Atık kovasının içeriğini lavabodaki bir süzgece boşaltın. Ardından, kırmızı biyotehlike torbası ile kaplanmış bir biyotehlike atık konteynerini lavaboya getirin ve süzgecin içeriğini kırmızı biyotehlike torbasına boşaltın.

Biyotehlike torbasını bir araba üzerindeki otoklav tepsisine yerleştirin. Buharın torba içine girmesine izin verecek şekilde otoklav torbalarını bantla gevşekçe kapatın. Otoklav bantlarından birinin üzerine isim baş harflerinizi ve tarihi yazın.

Delikli metal çubuğu otoklavdan çıkarın ve üst kısmı açın. Otoklav sterilizasyon döngüsünün başarıyla tamamlandığını kontrol etmek amacıyla, Geobacillus stearothermophilus sporları içeren bir biyolojik indikatör tüpünü metal çubuğun içine yerleştirin. Atıklarla dolu otoklav tepsisini otoklavın içine yerleştirin.

Otoklavı çalıştırın ve döngünün başladığını kontrol edin. Otoklavın işlem ekranı, o çalışma için kalan süreyi gösterecektir. Gerekli inkübasyon süresi tamamlandıktan sonra, plak assay plaklarını inkübatörden dikkatlice çıkarın ve elle temiz sınıf II biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

Besiyerini ve üzerindeki materyalleri bir pipetle aspire edin ve dezenfektan çözelti kabına aktarın. Virüsü inaktive etmek için besiyerini, 30 dakikalık bir temas süresi boyunca %10 nötr tamponlu formalin ve %0,8 kristal viyole karışımı ile değiştirin. İnaktivasyonun ardından, nötr tamponlu formalin/kristal viyole karışımını dikkatlice uzaklaştırın ve bertaraf edilmeden önce nötralize edilmek üzere ayrı bir atık kabına yerleştirin.

Lavaboda, fazla boyayı uzaklaştırmak için plakları durulayın ve ardından tamamen kurumaları için plakları bir tepsiye yerleştirin. Plakları saymak için bir ışıklı tablo (light box) kullanın. Tüm sayımları kaydedin ve standart denklemden virüs titlerini hesaplayın.

İnaktive edilmiş örneklerin BSL-4 laboratuvarından çıkarılması için tüpleri veya plakaları bir ısı ile kapatma torbasına yerleştirin. Torbanın içini ve örnek tüplerinin dış yüzeyini dezenfekte etmek için torbanın içine %5'lik dezenfektan veya fissikasyon çözeltisi püskürtün. Ardından torbayı ısı ile kapatın.

Aynı prosedürü takip ederek bu torbayı başka bir torbanın içine yerleştirin. İkinci torbayı ısı ile mühürleyin ve torbaların dış kısmını dezenfekte etmek için çift mühürlü torbaları %5'lik dezenfektan çözelti içeren bir daldırma tankında en az 10 dakika bekletin. Laboratuvar içindeki daldırma tankı kayıt defterini; tüplerin sayısını ve boyutunu, tüplerdeki hacmi, kullanılan ajanı, uygulanan inaktivasyon yöntemini ve numunelerin transfer edileceği odayı belirterek doldurun.

Biyogüvenlik düzeyi 4 laboratuvarındaki uygun prosedürlerin takip edilmesi, deneylerin güvenli ve etkili bir şekilde tamamlanması için kritiktir. Laboratuvar personeli, tamamlanmış günlük dahili kontrol listesine başvurarak ekipmanların tam olarak çalışır durumda olduğunu sağlar. Virüs örneği, kuyuk başına 30 ila 300 plak içeren plaklar elde etmek ve virüs titresi belirlemek amacıyla seri dilüsyona tabi tutulur.

Virüsün konak hücre hatlarına tropizmi, inokülasyon tekniği, virüs büyüme koşulları, uygun dilüsyon aralığı ve overlay seçimi dahil olmak üzere birçok faktör plak oluşumunu etkiler. Prosedür sırasında biyogüvenlik kabininde oluşan atıklar iki kez dezenfekte edilir. Atıklar, biyogüvenlik kabininden çıkarılmadan önce bir kez uygun şekilde dezenfekte edilir.

Ardından, atıklar hayvan biyogüvenlik düzey 4 ortamından çıkarılmadan önce otoklavlanır. Bu prosedürlerin izlenmesi sayesinde, Frederick'teki Entegre Araştırma Tesisi'nde yürütülen hayvan biyogüvenlik düzey 4 araştırmaları sırasında hiçbir laboratuvar kaynaklı enfeksiyon kaydedilmemiştir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında, örnek sayısına bağlı olarak üç ila dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, güvenli ve başarılı bir deney gerçekleştirmek için dilüsyonları doğru yaptığınızdan, plakleri buna göre saydığınızdan ve tüm güvenlik önlemlerine uyduğunuzdan emin olun. Bu videoyu izledikten sonra, pozitif basınçlı kıyafetlerin getirdiği fiziksel kısıtlamalar ve standart bir plak assay'ini tamamlamak için gereken ek süre hakkında iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.