Name: Köpek X-bağlantılı Musküler Distrofi Kokteyl Antisens oligonükleotidleri kullanılarak atlanıyor Çok ekson (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin, Duchenne kas distrofisi köpek modelinde kokteyl antisens oligonükleotidlerle çoklu ekson atlaması yöntemini. Bu teknik, sistemik distrofin kurtarımı sağlayarak gen tedavisi potansiyelini gösterir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Alberta Üniversitesi Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi, Garrett Cumming Dostları Araştırma Kürsüsü Fonu, HM Toupin Nörolojik Bilim Araştırma Kürsüsü Fonu, Kanada Musküler Distrofisi, Kanada İnovasyon Vakfı (CFI), Alberta İleri Eğitim ve Teknoloji (AET), Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR), Jesse'nin Yolculuğu - Gen ve Hücre Terapisi Vakfı tarafından desteklenmiştir. ve Kadın ve Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (WCHRI).

Bu makale için açık erişim ücretleri Gene Tools, LLC tarafından sağlanmıştır.

Ekzon atlatma DMD tedavisi için gelecek vaat eden bir tedavi yöntemidir. Hem in vitro ve in vivo deneylerde, çok-ekzon atlatma mümkün olduğunu göstermiştir. Burada, CXMD köpek modelinin kullanımı ele alınmaktadır. 2&#39;OMePS AON kimyası CXMD miyoblast transfeksiyon ve morfolino AON omurga kimyası in vivo deneyler için seçilmiştir kullanıldı 8 - İlk olarak, AON&#39;ler distrofin Ekson 6 hedeflemek için kurtarma-ESE ve ESEfinder programları kullanılarak dizayn edilmiştir. vPMOs modifiye edilmemiş PMOS daha verimli olan ancak daha yüksek bir toksisite nedeniyle sistemik enjeksiyonlar için uygun değildir. RNA ekstraksiyonu, RT-PCR ve cDNA dizileme CXMD miyoblastların üzerinde gerçekleştirilmiştir. PMO kokteyl enjekte Köpekler klinik semptomlar herhangi bir iyileşme değerlendirmek için klinik kademeli idi. Köpekler insanca kurban edilmiştir sonra kas örnekleri alındı ​​ve kriyo-ayırma için hazırlandı. A tarafından uyarılan distrofin proteininin yarım ömrü2 ay - ons yaklaşık 1 olduğuna inanılıyor. Bu deneyler, neonatal köpekler ve (5 yaşında&gt;) yaşlı köpeklerde ile yapılabilir, ancak küçük, yetişkin köpekler, bu çalışmada kullanılmıştır. Hazırlanan kas bölümleri histopatolojik değerlendirilmesi ve Western blot ve immünohistokimyasal 48 ile distrofin proteini kurtarma değerlendirmek için kullanıldı. PMO çözeltinin hacmi enjeksiyonu önce doğru olduğundan emin olmak için önemlidir; Bunu yapmak için başarısız sonuçlarla üzerinde önemli etkileri olacaktır. kas içi enjeksiyonlar sırasında, yeterli basınç ve kas liflerini girmek için gereklidir. Köpek sağlığı ve cerrahi sitenin denetim izleme, sorun giderme için önemlidir. hayvan sağlığını izlemek için, haftalık kan testleri ve tartı yapılmalıdır. hayvan ve kas numune hazırlama euthanization sonra distrofin proteini tespit hassasiyeti sağlamak için kritik bir aşama Tris-asetat jel ve yarı kuru emme yöntemi hem kullanmaktırWestern lekeleme prosedürü esnasında. Örnek sonuçlar gösterildiği gibi, miyoblastlar çerçeve DMD ürünler imal Ex6A, Ex6B, Ex8A ve kokteyl (Ex6A, Ex6B, Ex8A ihtiva eden ve Ex8B) ile muamele edilmiştir. Ex8B ekson-atlanan ürünler imal yana, bu in vivo deneylerde daha sonra kullanılmamıştır. 9 atlama meydana gelmiş ve DYS-2 boyanma ile immünsitokimya tedavi numunelerde distrofin ifade restore gösterdi - cDNA sıralama ekzon 6 gösterdi. AON ile tedavi edilen köpekler distrofin pozitif lifler önemli bir artış göstermiştir. 8 atlanmış ediliyordu ve kısaltılmış bir protein üretildi - Bu ekzon 6 belirtir. Distrofin pozitif elyafların miktarı AON&#39;lere bir kokteylinin kullanıldığı zaman artan AON doz ile orantılıdır. Imünoblotların sistemik morfolino tedavi edilen köpeklerde distrofin ifade artış gösterdi. İskelet kas distrofin liflerinin değişken düzeyleri; Bununla birlikte, morfolino-muamele edilmiş kalp dokusu küçük gösterdidystrophin ifade gelişme. Distrofin yüksek bir moleküler ağırlığa (427 kDa) sahip olduğu için, distrofin düşük miktarlarda tespiti zor olabilir. En iyi sonuçlar için, Tris-asetat jeli ve yarı-kuru transfer yöntemi kullanılmıştır. HE morfolino-tedavi edilen köpeklerde geliştirilmiş histopatoloji gösterdi boyama. Merkezi-çekirdekli fiberler (CNFs) sağlıksız kas bir göstergesidir ve kas dejenerasyonu ve yenilenme döngülerini temsil etmektedir. Morfolino-muamele CXMD köpekler işlenmemiş CXMD köpeklere kıyasla CNFs yüzdesinde bir azalma olduğunu gösterdi. Klinik not örneğin morfolino-tedavi edilen hayvanlarda artmıştır yürüyüş ve koşu yeteneği gibi semptomların bir iyileşme göstermiştir. Kas sertliği, böylece, bu derecelendirme şeması 59 dahil kas atrofisi, yansıttığına inanılır. uyluk (arka bacak) kasların sertliği değerlendirildi; Onlar CXMD içinde hipertrofisi ziyade atrofi gösterirler çünkü ancak, biz kafatası sartorius kasları hariç. Arıtılmış köpekler göstermekalt sınıflandırma puanları ed ve 15 m koşu testinde hızlı kez vardı. 15 m testi Geliştirilmiş kez gelişmiş kas fonksiyonu 40 göstergesidir. Yüksek genel sınıflandırma skorları kötü sağlık ve artan kas atrofi göstermektedir. bu sonuçlar umut verici olmakla birlikte, çok ekson atlama hala teknik klinik uygulanabilirliği vardır önce üstesinden gelinmesi gereken birçok zorluklar getirmektedir. Kardiyak doku nedeniyle hala kalp ve iskelet doku arasındaki hücresel ticaretine farkı AON, muhtemelen azalmış alımını gösterir. Toksik etki mevcut dozaj rejimleri altında hayvanların gözlenmiştir; AON kokteyl kullanımı, klinik denemelere hareket etmeden önce, ancak, daha fazla iş uzun dönemli bir toksisite değerlendirmek için yapılması gerekmektedir. Düzenleyici kurumlar benzersiz bir ilaç olarak her AON dizisi tanımlamak için AON kokteyl ilaçların rızasını kazanmak zordur. Bu bir kokteyl her dizi ayrı ayrı Safet için test edilmesi gerekir demektiry daha fazla zaman ve para gerektiren. klinik bir ortamda çok ekson atlama kullanımı için başka bir bariyer bilinmeyen işlevleri olan üretilen ara protein ürünlerinin büyük bir miktardır. Bu proteinler, potansiyel olarak tek tek mutasyona 22 bağlı olarak, önceden tahmin edilemeyen yan etkilere neden olabilir. Ayrıca, mevcut distrofik köpek modelleri içinde mevcut mutasyon desenleri sınırlıdır. Az sayıda doğal olarak oluşan mutasyonlar ve tüm mutasyonlar, çok ekson atlama çalışmak için yararlı değildir. Distrofik domuz modeli gelecek DMD ekson çalışmaları 33, 34 atlama için iyi bir alternatif olmayı vaat ediyor. DMD köpek modelleri diğer DMD modeller üzerinde bazı avantajları var. Daha büyük bir hayvan modeli, klinik sınıflandırma olmak ve MRG daha detaylı analiz için izin mümkündür. köpekler, büyük hayvanlar olduğu da toksikolojik çalışmalar için daha uygundur ve daha yakın fare modeli ile karşılaştırıldığında, insan hastalığı gösterir. köpek mMODELLERİ ayrıca insanlarda 23, 34, 45 daha benzer DMD gen dizileri var. Teknik açıdan zor olsa da, çoklu-ekson atlama yaklaşım sonuçta DMD hastalarının 24&gt;% 90 yararlanabilir. Tek ekson atlama hastaların küçük bir alt kümesi için geçerlidir bu, o tek ekson atlama için çok daha iyi bir alternatif haline getirmektedir. Buna ek olarak, çoklu-ekson atlama kısaltılmış distrofin protein işlevselliğini optimize silme desenleri seçmek için bize sağlayacaktır. 55 derece hafif belirtileri veya asemptomatik bireylerde 14,19,60-63 ile ilişkilidir - örneğin, DMD silinmesi 45 ekzon. Ekzon 45 çoklu ekzon atlatma - 55 daha önce vPMOs 22,26 sistemik enjeksiyonları bir ekson 52 delesyon (mdx52) ile DMD bir fare modelinde gösterilmiştir. Kokteyl vPMOs kullanımı da kas distrofisi diğer formları, örneğin kanıtlanmıştırFukuyama konjenital müsküler distrofi (FCMD) olarak. FCMD olarak anormal mRNA bölünmesi retrotranspozon girişinin sebep olduğu edildiği ekson yakalama, kaynaklanır. vPMOs hem bir FCMD fare modelinde ve insan hücre çizgileri 64 uç uca birleşen şeklinin kurtarmak için gösterilmiştir. yüksek etkinlik ve düşük toksisite sergileyen yeni nesil AON kimyaları klinik uygulama içine çok ekson atlama yaklaşımının etkili çevirisini kolaylaştıracaktır. Buna ek olarak, çok-ekzon atlatma potansiyel olarak disferlinopatilerin 24, 65 gibi başka genetik bozukluklar, tatbik edilebilir.

Duchenne müsküler distrofi (DMD) ilk Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1 tarafından açıklanan ilerleyici kas güçsüzlüğü ile karakterize X&#39;e bağlı resesif kas hastalığıdır. DMD her yıl 2,3 doğumlu yaklaşık 20.000 etkilenen çocuklarla, dünya çapında yaklaşık 1 3.500, çocuklar etkileyen yaygın bir genetik bir hastalıktır. Motor gelişim gecikir ve yürüyüş bozuklukları erken gençler yaklaşık olarak tekerlekli sandalye bağımlılık, ardından erken çocukluk 4 görülmektedir. Ölüm genellikle bağlı solunum veya kalp yetmezliği 5-8 20 ve 30 yaşları arasında ortaya çıkar. DMD için bir tedavi şu anda yok. Glukokortikoid ile tedavi, bir dereceye kadar, kas dejenerasyonu ilerlemesini yavaşlatmak, ancak, obezite ve diyabet mellitus 2,7,8 dahil ciddi yan etkiler ile ilişkilidir. DMD fonksiyonel distrofin Protei kaybına yol açan, distrofin (DMD) genindeki mutasyonlar sonucun. DMD 2 milyon baz çifti ve 79 ekson 9,10 ile son derece geniş bir gen olduğunu. out-of-frame mutasyonlar lider Silme, saçma ve çoğaltılması mutasyonlar DMD fenotip en sık nedenidir. 9 ve ekzon 45 - - ekzon 3 bölgeleri hastaların çoğu genin bu kısımları içinde silinmesi mutasyonlara sahip olduğu 55, DMD hastalarında 3,9,11-16 işlevsel olmayan distrofin yol &quot;mutasyon noktaları&quot; olarak adlandırılmaktadır. kas zarı stabilizasyonu önemli bir role sahip distrofin-glikoprotein kompleks (DGC), içinde distrofin fonksiyonları. Merkezi çubuk alan, daha az önemli bir rol 3,9,17 çalış N- ve C-termini, işlev için önemli alandır. Çoğunlukla DMD geninde çerçeve mutasyonlar sonucu Becker kas distrofisi (BMD) ile ilişkili hafif fenotip gözetilmesi, DMD tedavisi için atlama ekson uygulanmasını ilham kaynağı oldu. BMD hastaları kısaltılmış, ama functionA vartermini 3,6,18 hem muhafaza l, distrofin proteini. Ekzon atlatma, teorik olarak, kemik mineral yoğunluğu 3,19 görülen benzer kısaltılır-büt-fonksiyonel distrofinin protein ile sonuçlanan, okuma çerçevesi geri. Antisens oligonükleotitlerin (AON&#39;ler) birden fazla tür 2&#39;O-metillenmiş fosforotioatların (2&#39;OMePS) ve fosforodiamidat morfolino oligomerleri (PMO) de dahil olmak üzere klinik çalışmalarda, test edilmiştir. Bu AON kullanarak atlanıyor ekzon 51 ve 53 incelenmiş ve sonuçlar umut verici olsa da bu mutasyon özgü 3, 19, 20,21, 22-26 olduğu gibi tek ekson atlama, uygulanabilirliği sınırlıdır. Sorular da tek ekson 22,23 atlama üretilen sonuçlanan kısaltılmış distrofin proteinin istikrar kalır. Buna ek olarak, bazı hastalarda tek bir ekson daha okuma çerçevesi 3 geri yüklemek için atlanması gerekir. Teknik olarak daha zor olsa da, çoklu ekzon atlatma için bir yöntem olup buBu sorunları 3,19 ele alabilir. Çok ekzon atlatma önce distrofik köpek ve in vitro olarak insan hücre hatları gösterilmiştir. Buna ek olarak, mdx52 fare ve köpek X-bağlantılı kas distrofisi (CXMD) köpek modelleri, in vivo kullanılmıştır 22, 24-27 inceler. Köpek X&#39;e bağlı müsküler distrofi Japonya (CXMD J) CXMD J okuma çerçevesi ekson 6 ve 8, veya ek ekson (örneğin, ekson 3-9) multi-ekson atlama tarafından restore edilebilir av köpekleri, burada kullanıldı (Şekil 1). Beagle-merkezli CXMD Golden Retriever müsküler distrofi (GRMD) modeli ile aynı mutasyon deseni paylaşır, ancak av köpekleri böylece DMD 28,29 için yararlı bir model sağlayan dolayı vücut büyüklüğü küçük ve bakımı ucuzdur. CXMD köpekler daha yakından kemirgen gibi, küçük hayvan modellerinde daha insan DMD fenotip taklit ve toksikolojik değerlendirmeler 3,22,30,31 için daha güvenilir </s(Şekil 2)&gt; yukarı. CXMD köpekler DMD görülen benzer progresif kas çürüme, yürüyüş bozuklukları ve kalp ve solunum problemleri gösterir. tek ekson atlama ile karşılaştırıldığında, çok-ekzon atlatma hasta çok daha büyük bir oranda uygulanabilir. En yaygın üç mutasyon tipleri (silmeler, saçma ve mükerrer) arasında 80 - tüm DMD hastalarının% 45&#39;i yararlanabilir iken hastaların% 98&#39;i, özellikle atlama ekson 45, çoklu-ekson 14,32,33 atlama ile tedavi edilebilir - 55 3,19,22,34. modifiye morpholinos gelişmesiyle birlikte, ekson atlama kolaylaştırma AON kokteyl etkinliği artmıştır. -Arginin açısından zengin hücre-nüfuz peptide konjuge PMO (PPMOs) ve in vivo morpholinos (vPMOs) önemli ölçüde hücre nüfuz kabiliyeti ve istikrar 3,35-38 geliştirilmiş AON kimyaları bulunmaktadır. Endişeler uzun vadeli AON toksisite hakkında kalır; Ancak, önemli bir ilerlemeyapıldı. Morpholinos yapılan kimyasal değişimleri büyük ölçüde hedef dışı etkilerini azaltmak ve ön-klinik çalışmalar, önemli bir toksik etki 3,22,39,40 bildirilmiştir. Çoklu ekson atlama için bir diğer zorluk, her bir AON&#39;in şu anki gereksinimi bir kokteyl 3,19,22,41,42 olarak yerine birlikte tek bir ilaç olarak tek başına, toksisite için test edilecek olan. kalp hedefleyen atlama tek ve hem de çoklu ekson içeren DMD çalışmalarda, distrofik kalp dokusunda küçük bir iyileşme olmamıştır. merkezinde morpholinos etkinliği nedeniyle düşük hücre nüfuz kabiliyeti düşük olduğu düşünülmektedir. Peptit-konjuge PPMOs kalp 3,19,38 kurtarıldı fonksiyonel distrofin proteini miktarını artırarak, kalp hücreleri nüfuz AON yeteneğini geliştirmiştir. Burada, bizim AON kokteyl yaklaşım ESEfinder yazılımını 43 kullanılarak AON dizilerinin tasarımı da dahil olmak üzere, uzun uzadıya tartışıldı. ProtocÇoklu-ekson atlama köpek deneyler için OLS de tarif edilmiştir. CXMD J av köpekleri ekson 6 ve 8 atlama deneyleri için kullanılmıştır. CXMD köpek modelinde atlama Çok ekson umut verici sonuçlar gösterir, ancak zorluklar bunlar klinik uygulanabilir önce ihtiyaç aşılması kalır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">2'OMePS Köpek Myoblastlarının Transfeksiyonu&nbsp; </güçlü</td></tr><tr><td>>3 ml 6 oyuklu plakalar</td><td>IWAKI</td><td>5816-006</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofektin&nbsp;</td><td>Canlandırıcı&nbsp;</td><td>18292-011</td><td>Lipofektin için 2:1 oranında opti-MEM ortamında toplam 100 ml hacim. 5 mg RNA için 10 ml lipofektin.</td></tr><tr><td>2' OMePS</td><td>Eurogentec&nbsp;</td><td></td><td>Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU) ve Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC).&nbsp;</td></tr><tr><td>At Serumu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16050-114</td><td>%2</td></tr> <tr><td>streptomisin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333&nbsp;</td><td>200 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>köpek miyoblastlarının morfolino transfeksiyonu 
Antisense morpholinos'un kültürlenmesi için Köpek Miyoblastlarının MePS Transfeksiyonundan elde edilen tüm malzemeler</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gen araçları</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; opti-MEM ortamında 100 L'lik son hacme kadar seyreltin. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; Salin</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gen araçları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1&nbsp içinde 32 mg / ml'de 200 mg / kg morfolinos; ml / plaka</td></tr><tr> < td colspan = >< " güçlü >RNA Ekstraksiyonu ve Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) < / güçlü ></td></tr><tr><td>guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>1 & nbsp; ml / plaka</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td>200 & # 956; l&nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 ml Tüpler&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>% 75 etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34852</td><td></td></tr><tr><td>UV Spektrometresi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekzon 5&nbsp'de ileri astar;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>CTGACTCTTGGTTTTTGGA&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 & # 956; </td></tr><tr><td>Ekzon 10&nbsp'de M Ters astar;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TGCTTCGGTCTGTGTCAATG&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.5 &#956; l 10 & # 956; M</td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Clontech</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Tek Adımlı RT-PCR kiti&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>210210</td><td></td></tr><tr><td>Termo-döngüleyici</td><td>Scinco</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Tamamlayıcı DNA (cDNA) Dizilimi&nbsp; < / güçlü ></td></tr> <tr><td>Jel ekstraksiyon kiti & nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terminator v3.1 Döngü Sıralama Kiti&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler&nbsp;</td><td>4337454</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kas içi enjeksiyonlar veya açık kas biyopsisi</td></tr><tr><td>Cerrahi Aletler</td><td></td><td></td><td>Makas, neşter, iğne, cerrahi iplik&nbsp;</td></tr><tr><td>Veteriner Merhem&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İyodoforlar&nbsp;</td><td>webtextiles</td><td>12190-71-5</td><td></td></tr><tr><td>kloroheksidin</td><td>Peridex</td><td>12134</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Örtüler&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scrubs Yüz Maskesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Eldivenler&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baş Örtüsü&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiyopental sodyum&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott laboratuvarları&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>%2-3</td></tr> <tr><td>Antisens morpholinos&nbsp;</td><td>Gen araçları</td><td></td><td>Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT),&nbsp; Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; opti-MEM ortamında 100 L'lik son hacme kadar seyreltin. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 120&ndash; Tuzlu su 27&nbsp'de 32 mg / ml'de 200 mg / kg morfolinos</td></tr><tr><td>; G İğneleri</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml şırınga</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfin hidroklorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dil Bastırıcı&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sefaleksin</td><td></td><td>15 ila 30 mg / kg & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sefazolin</td><td></td><td>15 ila 30 mg / kg & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin&nbsp;</td><td></td><td>0.01 mg / kg</td><td></td></tr><tr><td>buprenorfin hidroklorür ve nbsp;</td><td>0.02 mg / kg</td><td></td><td></td></tr><tr> < td colspan = >< güçlü >Sistemik Enjeksiyonlar< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Şırınga infüzyon pompası & nbsp;</td><td>Muromachi&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22&nbsp; G Kalıcı iğneler</td><td>TERUMO</td><td>SG3-2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27&nbsp; G İğneleri&nbsp;</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td>SG3-2325&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml şırınga</td><td>TERUMO</td><td>SG2-03L2225&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Ohtsuka-Pharmaceutical</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Köpeklerin Klinik Derecelendirmesi</td></tr><tr><td>Video Kamera&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dur saat&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Manyetik rezonans görüntüleme (MRI)&nbsp; </güçlü></td></tr><tr><td>3 Tesla MRG l&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 cm çap/18 cm uzunluk insan ekstremite bobini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Kas örneklemesi ve hazırlanması (nekropsi)</güçlü></td></tr><tr><td>Tiyopental sodyum&nbsp;</td><td>Mitsubishi Tanabe Pharma&nbsp;</td><td></td><td>20 mg/kg&nbsp;</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott laboratuvarları&nbsp;</td><td>05260-05</td><td>%2-3</td></tr> <tr><td>Tragacanth sakızı</td><td></td><td></td><td>10-20 ml</td></tr><tr><td>Sıvı Azot&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mantar Diskler</td><td>Iwai-kagaku&nbsp;</td><td>101412-806</td><td></td></tr><tr><td>Kuru Buz Cımbızı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin&ndash; kaplamalı slaytlar</td><td>Fisher</td><td>22-037-216</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat Mikrosistemi&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>CM1900&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemistry&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150 dilüsyon&nbsp;</td></tr><tr><td>DYS2</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS2&nbsp;</td><td>1:150 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 594 keçi antimouse IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1: 2.500 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 594 keçi antimouse IgG2&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11005</td><td>1: 2.500 seyreltme</td></tr><tr><td>DAPI ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td> Keçi Serumu <td>montaj maddesi içerir</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td>% 15</td></tr> <tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nem odası&nbsp;</td><td>Bilimsel Laboratuvar Laboratuvarı&nbsp;</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>Hazne kaydırağı&nbsp;</td><td>Lab-tek&nbsp;</td><td></td><td></td>154453</tr><tr><td>Kapaklı Camlar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Hidrofobik bariyer kalemi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20X büyütmede 594 nm.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Western Blotting&nbsp; </güçlü></td></tr><tr><td>Damıtılmış Su&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>El Homojenizatörü&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 kez; Laemmli SDS yükleme tamponu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0,1 m tris&ndash; HCl (pH 6.6),% 2 (a / h) SDS,% 2 (0.28&nbsp; M) beta-merkaptoetanol, %20 gliserol, %0.01 bromofenol mavisi&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS jelleri&nbsp;</td><td>Biyo-Rad&nbsp;</td><td>161-1210</td><td>%5 çözülen</td></tr><tr><td>SDS jelleri</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>Invitrogen, WG1601BOX</td><td>%3-8</td></tr> <tr><td>PVDF membran&nbsp;</td><td>GE</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çalışma tamponu (10 kez;)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 mM Tris-Base, 1.920 mM Glisin</td></tr><tr><td>Çalışma tamponu (1 kez;)</td><td></td><td></td><td>% 10 10 kez; tampon,% 20 metanol & nbsp;</td></tr><tr><td>%0,05 PBS/Tween 20 (PBST)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>2.000 ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3 kez; PBST/%5 süt tozunu yıkamak için 200 ml</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protein Test Kiti</td><td>BCA</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Beta Merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Asetat</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Western blotting için yükleme/numune tamponu</td><td>NuPage Invitrogen</td><td>NP007</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz kokteyl inhibitörü ve nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Katot Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.025 M Tris tabanı + 40&nbsp; mM 6-aminokaproik asit +% 20 Metanol</td></tr><tr><td>Anot Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.03 M Tris Baz +% 20 Metanol</td></tr><tr><td>Merkezli Anot Tamponu</td><td></td><td></td><td>0.3 M Tris tabanı +% 20 Metanol</td></tr><tr><td>desmin antikoru &nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8592</td><td></td></tr><tr><td>DYS1&nbsp;</td><td>Novocastra&nbsp;</td><td>NCL-DYS1&nbsp;</td><td>1:150 dilüsyon&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ Yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

köpek x-bağlantılı musküler distrofi kokteyl antisens oligonükleotidleri kullanılarak atlanıyor Çok ekson

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

Duchenne müsküler distrofi (DMD), dünya çapında, distrofin (DMD) genindeki mutasyonlar neden olduğu en sık görülen ölümcül genetik hastalıklardan biridir. Ekson atlama okuma çerçevesini yeniden ve daha kısa ama fonksiyonel proteinleri üretmesi antisens oligonükleotidler (AON&#39;ler) olarak adlandırılan kısa DNA / RNA benzeri molekülleri kullanır. (Tek bir AON ilaçla tedavi edilebilir hastaların sadece% 13 kadar) sınırlı uygulanabilirlik ve kesik proteinlerin belirsiz fonksiyonu: Ancak, ekson atlama tedavisi iki önemli engellerle karşı karşıyadır. Bu sorunlar bir kokteyl AON yaklaşımla ele alındı. DMD hastalarının yaklaşık% 70&#39;i tek ekson atlama tarafından (kombine tüm ekson) tedavi edilebilir olsa da kokteyl antisens ilaçlar kullanarak atlama birden ekson fark edilebilir eğer bir potansiyel DMD hastalarının% 90&#39;ından fazlasını tedavi olabilir. köpek X-bağlantılı kas distrofisi (CXMD) köpek modeli, olan bir fenotip, insan DMD hastalarında daha benzerdir, sistemik effic test etmek için kullanıldıAcy ve ekson 6 ve 8&#39;de CXMD köpek modeli çoklu ekson atlama güvenlik distrofin mRNA ekson 7 eksikliğine yol intron 6 bir ek bölge mutasyon barındırır. CXMD okuma çerçevesini geri ekson 6 ve 8 multi-ekson atlama gerektirir; Bu nedenle, CXMD çoklu ekson atlama etkinliğini ve güvenilirliğini test etmek için iyi bir orta boyutlu hayvan modelidir. Bu çalışmada, ekzon 6 ve ekson 8 hedefleyen antisens morpholinos bir kokteyl tasarlanmış ve vücut genelinde iskelet kaslarında distrofin ifade restore edilmiştir. transfeksiyon / kokteyl oligo enjeksiyon ve etkinliği ve CXMD köpek modelinde çoklu-ekson atlama güvenlik değerlendirilmesi için yöntemler sunulmaktadır.

In vitro deneyler Miyoblastlar her AON etkinliğini karşılaştırmak amacıyla çeşitli 2&#39;OMePS tedavi koşulları ile transfekte edildi. 600 nM&#39;de Ex6A, Ex6B, Ex8A veya Ex8B her biri ile tek AON tedaviler 600 nM&#39;de her 4 AON dizilerin her bir kokteyl tedavisi olarak, hem de yapıldı. RNA örnekleri, dört gün sonra transfeksiyon toplanmıştır. RT-PCR sonra, her muamele için örnekler işlenmemiş (NT) örnekleri ile birlikte jel üzerinde çalışıldı. Jel üzerinde yüksek bantlar out-of-frame DMD ürünlerini temsil eder; Bu bantlar NT, Ex8A görüldü ve Ex8B miyoblastları tedavi. Ex6A, Ex6B, Ex8A ve kokteyli ile tedavi edilen miyoblastlar çerçeve ürünleri göstermektedir. Ex8A sadece% 30 çerçeve ürünler (Şekil 7) gösterdi kokteyli ve Ex6A / B,% 100 çerçeve ürünleri göstermektedir. ekson atlama ve restorasyon onaylamak içinokuma çerçevesi, bir cDNA dizilimi yapılmıştır; 9 gerçekten (Şekil 7) atlanır olmuştu - sonuçları ekzon 6 belirtti. İmmünohistokimya AON ile tedavi edilen köpekler NT örneklerinde (Şekil 8) göre distrofin pozitif lifler arttığını gösterdi. In vivo deneyler Çeşitli AON tedavi koşulları verimliliğini karşılaştırmak için, CXMD köpekleri (0,5-5 yaş) 1.2 mg Ex6A veya farklı dozajlarda Ex6A, Ex6B ve Ex8A bir kokteyl ile bir kez enjekte edildi. İki hafta enjeksiyonundan sonra, kas örnekleri alındı ​​ve distrofin-pozitif elyaf sayısını karşılaştırmak için DYS-1 ile boyandı. Tüm kokteyli ile tedavi edilen örnekler NT örneklere göre artan distrofin ekspresyonu gösterdi. Distrofin pozitif lifler AON doz (Şekil 9) ile birlikte arttı. aşağıdaki sistemIC enjeksiyonu, vahşi tip (WT), NT, ve kokteyl ile muamele CXMD kas örnekleri Dys-1 (Şekil 10) ile boyanmıştır. Kokteyl ile muamele CXMD köpekler CT ve kalp kas örnekleri, hem NT CXMD köpeklere kıyasla distrofin ekspresyonunda artış gösterdi. Bununla birlikte, AON ile tedavi edilen iskelet kası (BT) ile muamele kalp kası ile karşılaştırıldığında distrofin daha yüksek ekspresyonu gösterdi. WT, NT, ve çeşitli morfolino kokteyli ile tedavi edilen kaslar karşılaştıran bir bağışıklık aynı sonuca yol açtı. Tedavi iskelet kası örneklerinde dystrophin ifade geniş bir ürün yelpazesi (Şekil 10) da vardı. Hematoksilen ve eosin (HE) boyama CXMD tedavi olduğunu göstermiştir Köpekler NT CXMD köpekler (Şekil 11) ile karşılaştırıldığında merkezi-çekirdekli liflerin (CNF) önemli bir azalma ile geliştirilmiş histopatoloji gösterdi. Bu NT köpek meydana daha dejenerasyon / rejenerasyon, distrofik kas patolojisi bir işareti olmadığını gösterir. Buna ek olarak, tedavi edilen köpekler daha hızlı vardıKlinik dereceleme ölçeğinde süreleri ve geliştirilmiş puanları koşuyor. Arıtılmış CXMD köpekler tüm kategorilerde NT CXMD köpekler (Şekil 12) daha iyi skorlar gösterdi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig1.jpg" /> CXMD köpek ve ekzon 6 Şekil 1. mutasyon örneği -., Bir antisens kokteyl ile 8 Atlama Stratejileri CXMD köpekler distrofik köpek mRNA ekson 7&#39;nin bir kaybına yol açan ekson 6 bir nokta mutasyonu vardır. Bu mRNA kaybolur dışı çerçeve ve distrofin proteini üretimi ile sonuçlanır. AON kokteyl ile tedavi edilen köpeklerde gri çubuk kısa AON dizileri temsil 8. - Kısa AON dizileri etkin bir 6 ekson atlama mRNA ekleme sonuçlanır 6 ve 8, ekson bağlamak için tasarlanmıştır. Ekson 9 menteşe alanını kodlar ve bazen kendiliğinden kısadır proteinler ancak işlevini distrofin için ekson 6 ve 8 karşı AON ile sonuçlanan mRNA kodları eklenmiş olanark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53776/53776fig2.jpg" /> 1 yaşındaki Canine X&#39;e bağlı Musküler Distrofi (CXMD) Animal Şekil 2. Başlıca Klinik belirtiler. A 1 yaşındaki vahşi tip beagle ve CXMD köpek gösterilir. proksimal, uzuv ve temporal kasların tutulumu genellikle 2 aylıktan itibaren gözlenir. Eklem kontraktürü ve pelvis bir değişen yaş 4 ay açık bulunmaktadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig3.jpg" /> ) Intramuscul bir köpek. A Şekil 3. Genel Anesteziar enjeksiyonlar ve kas biyopsileri izofluran ile genel anestezi altında yapılmaktadır. B) Sistemik enjeksiyonlar için hayvanın Holding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig4.jpg" /> Yabani-tip Şekil 4. Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRI), CXMD işlenmemiş ve CXMD tedavi. Arka bacak MRG 3 ay VT ve NT CXMD köpeklerde 5 ay. ve AON sonrası enjeksiyon (ilk enjeksiyondan önce 1 hafta) tedavi CXMD arka bacak MRG öncesi iki örnek resimler gösterilir. 2703MA 200 mg / kg bir kokteyl morpholinos 7x haftalık muamele edilmiştir. 2001MA 120 mg / kg bir kokteyl morpholinos 5x haftada IV enjeksiyon ile muamele edilmiştir. Kontrol ve tedavi köpekler yaş olarak eşleştirilmiş edildi. Arıtılmış köpekler T2 sinyalleri azalma göstermektedir. Görüntüler adap vardır<html> Yokota ve ark izniyle ted. (copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig5.jpg" /> Şekil 5. Kas Köpek. A Biyopsi Prosedürü) bir alt ekstremite kas biyopsisi için sabittir. B) forseps yardımıyla, alt ekstremite tutulur. C) BT kas maruz kalmaktadır. Açık biyopsi tekniği enjekte sitelerin kas örnekleri elde etmek için kullanılır. Konu biyopsi örnekleri tutmak için kullanılır. Diseksiyonu sonrası kitre zamkı D) Kas örnekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /53776/53776fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6. Yarı-kuru Transfer Metodu. Western blot yarı kuru transfer yönteminin bir temsili sunulmuştur. Konsantre anot tampon batırılmış üç kağıtları negatif ucundan aşağı koyulur; anot tampon batırılmış 3 bildiri bunun üzerine dizilir. MB PVDF kağıt 6 kağıtları üzerine yerleştirilir önce ve sonra metanol ve anot tamponu içinde ıslatılır. katot tampon batırılmış olan jel, PVDF kağıt üzerinde hafifçe yatırılır. Son olarak, katod tamponu ile ıslatılmış 3 kağıt jel üzerine serilir. pozitif terminali üstünde yer almaktadır. 1 saat, mA sistemi aracılığıyla çalıştırılır 400. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig7.jpg" /> Şekil 7. CXMD miyoblastların de ekson Atlama. </stRong&gt; CXMD miyoblastlar Ex6A, Ex6B, Ex8A, ya da tek başına Ex8B, ya da dört bir kokteyli ile transfekte edilmiştir. 600 nM&#39;lik bir toplam tek tek diziler için kullanıldı ve kokteyl her dizinin 600 nM kullanılmıştır. A) CXMD köpek miyoblastların tedavi 2&#39;OMePS. Ex6A, Ex6B ve kokteyli ile tedavi edilmiş numuneler çerçeve ekson atlanan transkript beklenen pozisyonunda güçlü bantlar. Ex8A bir ara bant, Ex8B zayıf bant gösterir, ve NT çerçeve konumunda bir bant göstermez. Tek başına Ex6A arasında, 4 gün sonra transfeksiyon B) cDNA dizileme. Görüntüler Yokota ve ark. Izniyle uyarlanmıştır (telif hakkı 2009 John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig8.jpg" /> Şekil 8. Artan Dystrop2&#39;O-metillenmiş fosforotioat (2&#39;OMePS) &#39;de hin ifadesi nakil CXMD miyoblastlar. CXMD miyoblastlar, tek başına Ex6A veya kokteyl 2&#39;OMePS ile transfekte edilmiştir. DYS-2 (kırmızı) ve DAPI (mavi) boyama gösterilmiştir. tedavi miyoblastlar vahşi tip (WT) ve tedavi edilmeyen (NT) iskelet hücreleri karşılaştırılmıştır. Görüntüler Yokota ve ark izni ile uyarlanmıştır. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig9.jpg" /> İntramüsküler yalnız CXMD Köpekler. Ya Ex6A içinde morpholinos arasında enjeksiyonları veya Ex6A, Ex6B ve Ex8A bir kokteyl ile distrofin İfade Şekil 9. Kurtarma CXMD köpeklerin BT kas içine enjekte edildi. yabani tip Distrofin (DSY-1) boyama(WT), (NT) muamele edilmemiş, ve işlenmiş CXMD köpekler gösterilmiştir. Köpekler, ya tek başına 1.2 mg Ex6A veya 1.2 mg kokteyli ile tedavi edildi. Görüntüler Yokota ve ark izni ile uyarlanmıştır. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 10," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig10.jpg" /> CXMD köpekler. Distrofin sistemik kokteyl Morfolino Tedavi (dis-1) sonra, Şekil 10. Artan distrofin ekspresyonu boyama, (NT) (negatif kontrol) muamele edilmemiş, vahşi tip (WT) (pozitif kontrol) distrofin ifade karşılaştırmak için kullanıldı ve CXMD köpek / kg morfolino kokteyli (her AON&#39;in 40 mg / kg), 120 mg. morfolino kokteyli Ex6A, Ex6B ve Ex8A ihtiva etmiştir. Köpekler damardan 5 kez enjekte edildi bizBu kokteyl ile ekly. A) distrofin WT, NT kranial tibia (BT) kaslarda ifade ve tedavi edilen köpeklerde karşılaştırılması. B) NT ve morfolino kokteyli ile tedavi edilen köpekler arasında kalp dokusunda distrofin ifade bir karşılaştırması. bir yükleme kontrolü olarak desmin ile distrofin C) İmmünoblot WT, NT, ve morfolino kokteyli ile tedavi edilen köpekler için gösterilir. Aşağıdaki kasları tedavi köpekler için gösterilmiştir: triceps brachii (TB), biseps (BB), diyafram (DIA), özofagus (ESO), BT, adduktor (ADD), ekstansör digitorum longus (EDL), masseter (MAS), ve kalp. Görüntüler Yokota ve ark izni ile uyarlanmıştır. (Copyright 2009, John Wiley &amp; Sons) 40. Bar = 200 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 11," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig11.jpg" /> şekilCXMD Köpeklerde Histopatolojisi Geliştirilmiş 11. 240 mg / kg Morfolino Kokteyli ile 7 hafta boyunca tedavi. Yarım yıl beş yaş arasında değişen CXMD köpekler kez 240 mg / kg morfolino kokteyl (Ex6A, Ex6B ve Ex8A) intravenöz 7 hafta boyunca haftada. Ondört gün son enjeksiyondan sonra, yemek borusu kasları alındı ​​ve hematoksilen ve eozin (HE) boyama yapıldı. HE olmayan tedavi (NT) gelen yemek borusu kas boyama ve morfolino kokteyl ile tedavi edilen (Tedavi) CXMD köpekleri (40X objektif lens). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 12," src="/files/ftp_upload/53776/53776fig12.jpg" /> Klinik Vermedeki üzerinde Şekil 12. Geliştirilmiş Skorlar ve Morfolino Tedavisi. Morfotmo tedavi edilen köpeklerde sonra Çalışma Süresi 15 m olmayan tedavi (NT) yavru ile karşılaştırılmıştırs. Grafikteki Hata çubukları SEM&#39;i göstermektedir. A) Klinik tasnif sınav Toplam skor tedavi öncesi ve sonrası hesaplandı ve tedavi edilen hayvanların NT littermates ile karşılaştırıldı. B) ile muamele edilmiş ve NT köpeklerin 15 m yürütülmesini kez bir karşılaştırması. B&#39;ye benzer ° C); Ancak, genç köpekler kullanıldı. Görüntüler Yokota ve ark. Izniyle uyarlanmıştır (telif hakkı 2009 John Wiley &amp; Sons) 40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53776/53776fig12large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antisens oligonükleotit </td><td> Nükleotid Dizisi </td></tr><tr><td> Ex6A </td><td> GTTGATTGTCGGACCCAGCTCAGG </td></tr><tr><td> Ex6B </td><td> ACCTATGACTGTGGATGAGAGCGTT </td></tr><tr><td> Ex8A </td><td> CTTCCTGGATGGCTTCAATGCTCAC </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Anti-duyu oligonükleotid tasarımı.

Ekson atlama şu anda Duchenne kas distrofi (DMD) için en umut verici bir tedavi seçeneğidir. DMD hastalarında için uygulanabilirlik genişletmek için ve sonuçta elde edilen kesilmiş distrofin protein stabilitesi / fonksiyonu optimize etmek için, kokteyl antisens oligonükleotidler kullanılarak bir yaklaşım atlama çok ekson geliştirilmiş ve bir köpek modelinde sistemik distrofin kurtarma gösterilmiştir.

Köpek X-bağlantılı Musküler Distrofi Kokteyl Antisens oligonükleotidleri kullanılarak atlanıyor Çok ekson

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

Bu deneyin genel amacı, Duchenne kas distrofisi (DMD) köpek modelinde, kokteyl antisens oligonükleotidler veya AON'ler kullanılarak gerçekleştirilen çoklu ekzon atlamanın etkinliğini ve toksisitesini incelemektir. Bu yöntem, antisens oligonükleotidlerin büyük bir hayvan modelinde çoklu ekzon atlamasını tetikleyip tetikleyemeyeceği ve distrofi ekspresyonunu ortadan kaldırıp kaldıramayacağı gibi, antisens ekzon atlama terapisinin translasyonel araştırmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir çalışmada köpek modelinin kullanılmasının temel avantajı, daha büyük hayvanlardaki terapötik sonuçların DMD hastalarına daha güvenilir bir şekilde ekstrapole edilebilmesidir.Ekzon atlama, DMD için oldukça gelecek vaat eden bir tedavi olsa da, konjenital musküler distrofi ve uzul-kuşak musküler distrofi gibi diğer genetik hastalıklara da uygulanabilir. İn vitro deneylerin gösterimi laboratuvar şefimiz Dr. Yoshitsugu Aoki tarafından, in vivo deneylerin gösterimi ise bölümümden doktora sonrası araştırmacı Dr. Mutsuki Kuraoka tarafından gerçekleştirilecektir. Yazılı protokole uygun olarak AON'leri tasarladıktan sonra, santimetrekare başına 1 ila 5 x 10³ CXMD miyoblastını %10 FBS ve %1 pen-strep içeren 3 mL DMEM içerisinde ekmek için 6 kuyucuklu plakalar kullanın.Hücreleri %60 ila %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C'de inkübe edin. Hücreler istenen konfluense ulaştığında, katyonik lipozom transfeksiyon reaktifini toplam hacmi 100 µL olacak şekilde düşük serumlu besiyeri ile seyreltin ve karışımı oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika bekletin. Ardından, AON'leri düşük serumlu besiyeri ile nihai hacmi 100 µL olacak şekilde seyreltin.Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini seyreltilmiş AON'lerle birleştirin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Bu sırada, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri taze besiyeri kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, transfeksiyon karışımına 0,8 mililitre besiyeri ekleyin ve ardından çözeltinin tamamını yeni yıkanmış hücrelere ilave edin.37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Ardından, hücrelere farklılaşma ortamı (DM) ekleyin ve farklılaşmanın gerçekleşmesi için 10 güne kadar inkübe edin. Üçüncü gün civarında başlayarak farklılaşmayı kontrol edin.Köpek miyoblastlarının morfolino transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi CXMD miyoblastlarını kültüre edin. Kokteyl morfolinoları 65 °C'de 10 dakika boyunca ısıtın. Ardından bir peptit iletim reaktifi ekleyin ve morfolinoyu üç ila altı µM nihai konsantrasyona ayarlayın.Ardından, miyoblastlardaki besiyerini değiştirmek için DM kullanın ve her kuyucuğa final konsantrasyonu 1 µM olacak şekilde morfolino ekleyin. 16 ila 18 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, RNA ekstraksiyonu için hücreleri toplamak amacıyla, hücreleri plakadan ayırmak için üzerlerine 1 mL guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Her tüpe 200 µL kloroform ekleyin ve RNA tabakası, protein tabakası ve DNA tabakası olmak üzere üç ayrı tabaka görülene kadar oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. Tüpleri 12.000 ×g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.Ardından, üstteki süpernatant tabakasını uzaklaştırın ve 500 µL izopropanol içeren bir tüpe aktarın. Süpernatantı uzaklaştırıp RNA peletini saklamadan önce süpernatant tüplerini santrifüjleyin. Peleti yıkamak için etanol kullanın ve 8,000 ×g'de, 4 °C'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Kalan etanolün uçması için tüpü 15 dakika boyunca altüst edin ve ardından 15 ila 30 µL RNaz içermeyen su ekleyin. Daha sonra, RNA miktarını belirlemek için 260 nm'de UV-Vis spektroskopisi kullanın. RT-PCR işlemini gerçekleştirmek için aşağıdaki reaktifleri birbirine karıştırın ve final hacmi 25 µL olacak şekilde su ekleyin.Numuneleri bir termosiklet cihazına yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, ürünü dört derece Celsius veya 20 derece Celsius'ta saklayın. İntramüsküler enjeksiyon gerçekleştirmek için, hayvanı cerrahiye hazırlayıp metin protokolüne uygun olarak anestezi uyguladıktan sonra, kranial tibial (CT) üzerinde yaklaşık beş santimetre boyunca boylamsal olarak deri kesisi yapmak için bir skalpel kullanın. Enjeksiyon bölgelerini işaretlemek için, iki santimetre aralıklarla iki dikiş işareti koyarak derin fasyayı dikmek amacıyla cerrahi iğne ve cerrahi ip kullanın.Daha doğru bir biyopsi yapılmasına olanak tanıdığı için enjeksiyon bölgesinin iplikle işaretlenmesi çok önemlidir. Ardından, 27 gauge bir iğne kullanarak kas içine istenen konsantrasyondaki AON'leri enjekte edin ve iğneyi bir dakika boyunca içeride bırakın. Daha sonra, açık kas biyopsisi gerçekleştirmek için, CT kasından yaklaşık iki santimetre uzunluğunda bir kas dokusu parçasını almak için cerrahi bisturi kullanın.Kas fasyasını kasın üzerine geri yerleştirin ve dokuyu kapatmak için 000 absorbabl sütür kullanın. Ardından, cildi kapatmak için 000 naylon sütür kullanın. Bir iğne kullanarak, kilogram başına 0,02 mg buprenorfin hidroklorür intramüsküler enjeksiyonunu uygulayın.Her bir AON'den eşit miktarlar içeren bir kokteyli ekstremite venine enjekte etmek için, hayvanı metin protokolüne uygun şekilde tutarken, ekstremite venine indwelling bir venöz iğne yerleştirin. Üretici talimatlarını izleyerek, bir infüzyon pompası veya şırınga sürücüsü kullanarak, 20 dakika boyunca dakikada 2,5 mililitre hızla toplam 50 mililitre enjekte edin. Tekrarlanan enjeksiyonlarla distrofin ekspresyonu birikeceği için enjeksiyonları haftalık veya iki haftada bir tekrarlayın.Toksisiteyi incelemek amacıyla haftalık kan testleri gerçekleştirmek için, ön veya arka ekstremite subcutaneous venlerinden birinden bir iğne kullanarak üç mililitre kan toplayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek aşağıdaki değerlendirmeleri yapın. Metin protokolüne göre ileri analizleri gerçekleştirin.Her bir AON'un etkinliğini karşılaştırmak amacıyla miyoblastlar çeşitli 2'OMePS tedavi koşullarıyla transfekte edilmiştir. Burada gösterilen jel, tedaviden dört gün sonra toplanan RNA'dan elde edilen RT-PCR örneklerini temsil etmektedir. Jel üzerinde daha yukarıda yer alan bantlar, çerçeve dışı (out-of-frame) DMD ürünlerini temsil etmekte olup, tedavi edilmemiş Ex8A ve Ex8B ile tedavi edilmiş miyoblastlarda görülmüştür.Ex6A, Ex6B, Ex8A ve kokteylle işlem görmüş miyoblastlar çerçeve içi (in-frame) ürünler göstermiştir. cDNA dizilemesi, Ekzon 6'dan 9'a kadar olan kısmın atlandığını doğrulamıştır. Bu şekilde görüldüğü üzere, immünositokimya, AON ile işlem görmüş köpek hücrelerinin işlem görmemiş örneklere kıyasla artmış distrofin-pozitif liflere sahip olduğunu ortaya koymuştur.Çeşitli AON tedavi koşullarının etkinliğini karşılaştırmak için CXMD köpeklerine farklı dozlarda Ex6A veya Ex6A, Ex6B ve Ex8A kokteyli enjekte edilmiştir. DYS1 için boyanan kas örnekleri, kokteyl ile tedavi edilen örneklerde distrofin ekspresyonunda bir artış olduğunu ve distrofin-pozitif fiberlerin distrofin dozajıyla birlikte arttığını göstermektedir. Sistemik enjeksiyonları takiben, kokteylle tedavi edilen CXMD köpekleri, hem CT hem de kalp kası örneklerinde, NT CXMD köpeklerine kıyasla artmış distrofin ekspresyonu göstermiştir.Buna karşın, AON ile tedavi edilen iskelet kasları, tedavi edilen kalp kasına kıyasla çok daha yüksek distrofin ekspresyonu göstermiştir. Ayrıca, tedavi edilen CXMD köpekleri, NT CXMD köpeklerine kıyasla, merkezi çekirdekli liflerde belirgin bir azalma ile iyileşmiş histopatoloji sergilemiştir. Uzmanlaşıldığında, hem in vitro hem de in vivo deneyler, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde birkaç saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, köpeğin sağlık durumunun dikkatle izlenmesi önemlidir. Sistemik ekzon atlamanın geliştirilmesinin ardından, bu alandaki araştırmacıların DMD hastalarında insan klinik deneylerine başlamasının önü açılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, köpeklerin antisense oligonükleotidler ile nasıl tedavi edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

multi-exon-skipping-using-cocktail-antisense-oligonucleotides-canine

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Çeşitli antianlamlı oligonucleotides (AONs) exon eklenmesi (splice modülasyon) teşvik ve spinal kas atrofisi (SMA) için SMN ifade kurtarma gösterilmiştir. Burada, biz AON lipotransfection SMN2 gen ve SMA hasta fibroblastlar etkinliğini belirlemek için değerlendirme yöntemleri exon eklenmesi ikna etmek için bir iletişim kuralı tanımlamak.

Tarafından indüklenen Exon dahil değerlendirilmesi Splice SMA hasta fibroblastlar anahtarlama antianlamlı Oligonucleotides

Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Burada, geçici exosomes normal myogenic atası hücrelerden türetilmiş dikim tarafından Duchenne kas distrofisi farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için bir protokol mevcut.

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.

iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Burada klinik çalışmada Sanger sıralama, RT-PCR ve batı lekeleme kullanarak distrofin 38 ekspresyonunun moleküler karakterizasyonunu satMaktadır.

Antisense Oligonükleotidlerin Klinik Çalışmalarında DMD Hasta Örneklerinde Exon Atlama Etkinliğinin Karakterize Edilmesi

Bu makalede, distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyon değerlendirmek için MYOD1-dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücreleri kullanarak Duchenne musküler distrofi kasının verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanır.

İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Biz köpek hindlimb kas gücü ve tekrarlanan eksantrik kasılmalar kas yanıtı ölçmek için bir minimal invaziv ve ağrısız bir yöntem açıklanmaktadır.

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

Bir yapılandırılmış protokol hücresel dielektrik spektroskopi (CDS) kullanarak idiopatik skolyoz prognozu tahmin etmek için bir fonksiyonel test olarak bir hücre bazlı deney için sunulmuştur. Deney, taze ya da dondurulmuş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ile yapılabilir ve prosedür 4 gün içinde tamamlanır.

Hücresel Dielektrik Spektroskopisi kullanarak İdiopatik Skolyoz Prognostik Tahmininde Hücre-tabanlı Deney Protokolü

Tükürükten DNA ekstraksiyonu, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozunma/parçalanma olmadan, kolayca bulunabilen bir yüksek moleküler ağırlıklı DNA kaynağı sağlayabilir.  Bu protokol, tükürük toplama/saklama ve DNA ekstraksiyonu için yüksek kalite gereksinimlerine sahip alt DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize edilmiş parametreler sağlar.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

Öğrenin, Duchenne kas distrofisi köpek modelinde kokteyl antisens oligonükleotidlerle çoklu ekson atlaması yöntemini. Bu teknik, sistemik distrofin kurtarımı sağlayarak gen tedavisi potansiyelini gösterir.

Köpek X-bağlantılı Musküler Distrofi Kokteyl Antisens oligonükleotidleri kullanılarak atlanıyor Çok ekson

Daha fazla video keşfet