Köpek X-bağlantılı Musküler Distrofi Kokteyl Antisens oligonükleotidleri kullanılarak atlanıyor Çok ekson

Bu deneyin genel amacı, Duchenne kas distrofisi veya DMD'nin bir köpek modelinde kokteyl antisens oligonükleotidler veya AON'lar kullanılarak çoklu ekzon atlamanın etkinliğini ve toksisitesini incelemektir. Bu yöntem, antisens oligonükleotidlerin büyük bir hayvan modelinde çoklu ekzon atlamasını indükleyip indükleyemeyeceği ve distrofi ekspresyonunu yok edip edemeyeceği gibi, antisens ekzon atlama tedavisinin translasyonel araştırmasındaki kilit sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bir çalışmada köpek modelini kullanmanın temel avantajı, daha büyük hayvanlardaki terapötik sonuçların DMD hastalarına daha güvenilir bir şekilde tahmin edilebilmesidir.

Ekzon atlama DMD için çok umut verici bir tedavi olmasına rağmen, konjenital musküler distrofi ve ekstremite-kuşak musküler distrofi gibi diğer genetik hastalıklara da uygulanabilir. İn vitro deneylerin gösterilmesi laboratuvar şefimiz Dr.Yoshitsugu Aoki tarafından yapılacak ve in vivo deneylerin gösterilmesi benim bölümümden doktora sonrası araştırmacı olan Dr.Mutsuki Kuraoka tarafından yapılacaktır. AON'ları metin protokolüne göre tasarladıktan sonra,% 10 FBS ve% 1 pen-strep ile üç mililitre DMEM'de santimetre kare başına 10 ila üçüncü CXMD miyoblastlarını bir ila beş kez tohumlamak için 6 oyuklu plakalar kullanın.

Hücreleri 37 santigrat derecede% 60 ila 80 birleşene kadar inkübe edin. Hücreler istenen birleşmeye ulaştığında, bir katyonik lipozom transfeksiyon reaktifini toplam 100 mikrolitre hacme seyreltmek için indirgenmiş serum ortamı kullanın ve karışımın oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika beklemesine izin verin. Daha sonra, azaltılmış serum ortamı ile AON'ları 100 mikrolitrelik bir nihai hacme seyreltin.

Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini seyreltilmiş AON'larla birleştirin ve oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. Bu arada, ortamı hücrelerden çıkarın ve hücreleri üç kez yıkamak için taze ortam kullanın. Daha sonra, transfeksiyon karışımına 0.8 mililitre ortam ekleyin ve ardından tüm çözeltiyi yeni yıkanmış hücrelere ekleyin.

37 santigrat derecede üç saat inkübe edin. Daha sonra, hücrelere farklılaşma ortamı veya DM ekleyin ve farklılaşmanın gerçekleşmesi için 10 güne kadar inkübe edin. Üçüncü günden başlayarak, farklılaşma olup olmadığını kontrol edin.

Köpek miyoblastlarının morfolino transfeksiyonunu gerçekleştirmek için, bu videoda daha önce gösterildiği gibi CXMD miyoblastlarını kültürleyin. Kokteyl morfolinolarını 65 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. Daha sonra bir peptit dağıtım reaktifi ekleyin ve morfolinoyu üç ila altı mikromolar nihai konsantrasyona ayarlayın.

Daha sonra, miyoblastlardaki ortamı değiştirmek için DM kullanın ve morfolinoyu her bir mikromolar nihai konsantrasyonda her bir oyuğa ekleyin. 16 ila 18 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, RNA ekstraksiyonu için hücreleri toplamak için, hücrelere plakadan ayırmak için bir mililitre guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekleyin.

Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Her tüpe 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve RNA tabakası, protein tabakası ve DNA tabakası olmak üzere üç ayrı tabaka görülene kadar oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin. 15 dakika boyunca 12.000 kez g ve dört santigrat derecede tüplere santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantın üst tabakasını çıkarın ve 500 mikrolitre izopropanol içeren bir tüpe aktarın. Süpernatanı çıkarmadan ve RNA peletini kurtarmadan önce süpernatan tüplerini döndürün. Peleti yıkamak için etanol kullanın ve beş dakika boyunca 8.000 kez g ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

15 ila 30 mikrolitre RNaz içermeyen su eklemeden önce kalan etanolü buharlaştırmak için tüpü 15 dakika ters çevirin. Ardından, RNA'yı ölçmek için 260 nanometrede UV-Vis spektroskopisini kullanın. RT-PCR'yi gerçekleştirmek için, aşağıdaki reaktifleri karıştırın ve 25 mikrolitrelik son hacme kadar su ekleyin.

Numuneleri bir termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, ürünü dört santigrat derece veya 20 santigrat derecede saklayın. Kas içi enjeksiyon yapmak için, hayvanı ameliyata hazırladıktan ve metin protokolüne göre uyuşturduktan sonra, cildi kraniyal tibial üzerinde uzunlamasına yaklaşık beş santimetre kesmek için bir neşter kullanın veya enjeksiyon bölgelerini işaretlemek CT.To, iki santimetre aralıklarla iki dikiş işaretçisi yaparak derin fasyayı dikmek için cerrahi bir iğne ve cerrahi iplik kullanın.

Enjeksiyon bölgesini iplikle işaretlemek çok önemlidir, çünkü bu daha doğru biyopsi yapılmasına izin verir. Daha sonra, 27 gauge bir iğne kullanarak, istenen AON konsantrasyonunu kas içine enjekte edin ve iğneyi bir dakika bekletin. Ardından, açık bir kas biyopsisi yapmak için, BT kasından yaklaşık iki santimetre uzunluğunda bir kas dokusu parçasını çıkarmak için cerrahi bir neşter kullanın.

Kas fasyasını kasın üzerine geri yatırın ve dokuyu kapatmak için 000 emilebilir bir iplik kullanın. Ardından cildi kapatmak için 000 naylon iplik kullanın. Bir iğne kullanarak, kilogram buprenorfin hidroklorür başına 0.02 miligramlık bir kas içi enjeksiyon uygulayın.

Her AON'dan eşit miktarda içeren bir kokteyli bir uzuv damarına enjekte etmek için, hayvanı metin protokolüne göre tutarken, bir uzuv damarına bir venöz kalıcı iğne yerleştirin. Bir infüzyon pompası veya şırınga sürücüsü kullanarak, üreticinin talimatlarını izleyerek 20 dakika boyunca dakikada 2,5 mililitre olmak üzere toplam 50 mililitre enjekte edin. Tekrarlanan enjeksiyonlarla distrofin ekspresyonu birikeceğinden enjeksiyonları haftada bir veya iki haftada bir tekrarlayın.

Toksisiteyi incelemek için haftalık kan testleri yapmak için, ön veya arka bacağın deri altı damarlarından birinden üç mililitre kan toplamak için bir iğne kullanın. Üreticinin talimatlarına uyarak aşağıdaki değerlendirmeleri ekleyin. Metin protokolüne göre daha fazla analiz yapın.

Miyoblastlar, her bir AON'un etkinliğini karşılaştırmak için çeşitli 2'OMePS tedavi koşulları ile transfekte edildi. Burada gösterilen jel, tedaviden dört gün sonra toplanan RNA'dan RT-PCR örneklerini temsil eder. Jel üzerindeki daha yüksek bantlar, çerçeve dışı DMD ürünlerini temsil eder ve tedavi edilmemiş Ex8A ve Ex8B ile muamele edilmiş miyoblastlarda görülmüştür.

Ex6A, Ex6B, Ex8A ve kokteylle muamele edilen miyoblastlar çerçeve içi ürünleri gösterdi. cDNA dizilimi, Ekzon 6'dan 9'a kadar atlandığını doğruladı. Bu şekilde görüldüğü gibi, immünositokimya, AON ile tedavi edilen köpek hücrelerinin, tedavi edilmeyen örneklere kıyasla distrofin pozitif liflerin arttığını ortaya koydu.

Çeşitli AON tedavi koşullarının etkinliğini karşılaştırmak için, CXMD köpeklerine Ex6A veya çeşitli dozlarda Ex6A, Ex6B ve Ex8A kokteyli enjekte edildi. DYS1 için boyanan kas örnekleri, kokteyl ile muamele edilen örneklerde distrofin ekspresyonunda bir artış ve distrofin dozu ile artan distrofin pozitif lifler gösterir. Sistemik enjeksiyonları takiben, kokteylle tedavi edilen CXMD köpekleri, hem BT hem de kalp kası örneklerinde NT CXMD köpeklerine kıyasla artmış distrofin ekspresyonu gösterdi.

Bununla birlikte, AON ile tedavi edilen iskelet kasları, tedavi edilen kalp kasına kıyasla çok daha yüksek distrofin ekspresyonu gösterdi. Ek olarak, tedavi edilen CXMD köpekleri, NT CXMD köpeklerine kıyasla merkezi çekirdekli liflerde önemli bir azalma ile gelişmiş histopatoloji gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, hem in vitro hem de in vivo deneyler, uygun şekilde yapılırsa birkaç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, köpeğin sağlık durumunu dikkatlice izlemek önemlidir. Sistemik ekzon atlama, geliştirilmesinden sonra bu alandaki araştırmacıların DMD hastalarında insan klinik çalışmalarına başlamasının yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, antisens oligonükleotidli köpeklere nasıl davranılacağını iyi anlamış olmalısınız.