Name: Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Öğrenin, glioblastoma hücreleri ile makrofaj ve mikroglia arasındaki etkileşimleri in vitro ortamda modellemek için. Bu yöntem, tümör mikroçevresindeki işlevleri ve potansiyel tedavileri araştırmaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmalar için murin mikroglia sağladığı için Dr. Konstantin Dobrenis'e teşekkür ederiz.

1. Hücre floresan etiketleme NOT: floresan boyalar 9 Etiket glioblastoma hücre hatları ve mikroglia. Seçenek olarak ise, 14 de tarif edildiği gibi konstitütif GFP / RFP gibi floresan proteinleri ifade eden hücre hatları oluşturmak. <ol><li> boyama gününde% 80 konfluent - 6 gözenekli bir plakada Plaka hücreleri 70 olacak şekilde. Fare glioblastoma hücre hattı GL261 ve insan glioblastoma hücre hattı U87, plaka 1 x 10 6 ve 1.5 x 10 6 hücre, sırasıyla boyama önce 6 cm çanak 24 saat üzerinde. </li><li> DMSO içinde floresan hücre leke boya çözeltisini hazırlayın ve ortama 5 uM boya ekleyin ya Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) veya makrofaj serum barındırmayan ortam (MSFM) de vorteks. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 için boya ile inkübe hücreleri. </li><li> boya içeren ortamı çıkarın ve hücrelere taze ortam (RPMI veya MSFM) ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: Hücreler artıklekeli ve hazır denemede kullanılır. </li></ol> 2. Ön kaplı Matrix Odası Coculture Invasion Testi <ol><li> Forbol miristat asetat (PMA) 15 kullanılarak, THP-1 hücreleri ayırt. <ol><li> Plaka 2 - 6 bölmeli bir kültür tepsisi RPMI /% 10 FBS, 1.5 ml 3 x 10 5 THP-1 hücreleri. Kaplamadan hemen sonra, 100 nM PMA ekleme ve 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. Not: 48 saat sonra, başarılı bir farklılaşma geçirmiş THP-1 hücreleri yapışkan olacak ve de yuvarlak bir morfolojisi alarak altına yayılır. </li><li> 1x bir kez PBS ile yıkanarak PMA çıkarın ve taze RPMI /% 10 FBS ile değiştirin. Hücreler tayininde kullanıma hazır olana kadar başka bir 48 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Bir tek başına medya 500 ul içeren (hiçbir serum) onları yerleştirerek ve üstüne tek başına medya 500 ul ekleyerek matris önceden kaplanmış odaları dengelenmesi. 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 için bir oda inkübe edin. <br/&gt; Not: Ön kaplı odaları üreticiden satın alındı; Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız. </li><li> yavaşça hücreler (floresan etiketli glioblastoma hücre hatları ve mikroglia / makrofajlar) çıkarmak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C&#39;de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2. </li><li> % 0.3 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> MSFM /% 0.3 BSA ortam aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet ya da (U87 ve THP-1 hücreleri için) RPMI /% 0.3 BSA (GL261 hücreleri ve mikroglia için) hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml&#39;ye eşit olduğu şekilde . hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. </li><li> 24 gözlü plakanın her bir kuyucuğu 500 ul ortam /% 0.3 BSA ekleyin. </li><li> En az 2 saat (adım 2.2) için dengelenmiş olan odaları bulunan ortamı çıkarın. Yeri Chambeiyi 500 ul medya /% 0.3 BSA (adım 2.7) ihtiva eden rs. </li><li> inhibitörleri makrofaj üzerindeki etkisini incelemek için kullanılıyorsa / mikroglia alt ve odanın üst kısımlarına hem uygun konsantrasyon ekleyin glioma işgali uyarılır. Not: CSF-1R konsantrasyonları GL261 glioblastoma istilası Referans 9 bulunabilir uyarılmış tam mikroglia inhibe etmek için kullanılır inhibitördür. </li><li> Fare glioblastoma (2.10.1) ve insan glioblastoma (2.10.2) kullanılan hücre hatları bağlı olarak, aşağıdaki iki adımda tarif edildiği gibi üst bölmeye hücreleri ekleyin. <ol><li> 1.5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) hücreleri (150 ul) ve 5 x 10 4 fare mikroglia (50 ul) (ortam detayları için adım 2.6) karıştırın. 300 ul MSFM /% 0.3 BSA eklenerek 500 ul hacim kazandırın. Üst bölmeye hücre karışımı ekleyin ve 48 st için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edilir. NOT: i tarif edildiği gibi Fare mikroglia yenidoğan farelerin izole edilmiştirn, 1 ila 6. </li></ol></li></ol> 7.5 x 10 4 U87 (glioblastoma) hücreleri (75 ul) ve 2.5 x 10 4 THP1 (makrofaj) hücreleri (25 ul) karıştırın. 400 ul RPMI /% 0.3 BSA ilave edilerek 500 ul hacim getirin. üst bölmeye hücre karışımı ekleyin. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin. <ol><li> kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. görüntü analizi için bölüm 4 geçin. NOT: Deney şu anda durdurulmuş ve 1x PBS içinde görüntüleme için kaydedilebilir. Floresan boya sinyalleri tespit sonrasında en fazla 2 hafta tespit edilebilir. </li></ol> Matrix glioma ve makrofajlar / mikroglia katıştırma 3. Invasion Testi &quot;3D&quot; <ol><li>gece boyunca 4 ° C&#39;de çözülme matriks karışımı. kaputu buz üzerinde matris kullanarak tüm diğer manipülasyonlar gerçekleştirin. </li><li> Buz üzerinde% 0.3 BSA ile ortam matrisin 10 mg / ml konsantrasyon (MSFM veya RPMI) hazırlayın. Not: matris stok konsantrasyonu tipik olarak yaklaşık 15 mg / ml&#39;dir. </li><li> matris içinde süspansiyon için (adım 1 &#39;de etiketli) hücreler hazırlamak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. Hücrelere 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C&#39;de kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2. </li><li> % 0.3 BSA ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> pelet Süpernatant aspire. Hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml&#39;ye eşit olduğu şekilde ortam /% 0.3 BSA içinde süspanse pelet. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne + 5 x 10 4 mikroglia hücreleri (50 ul) (150 ul) 1.5 x 10 5 GL261 hücreleri ekleyin.Ayrı bir 1.5 ml mikrofüj tüpe 2 x 10 5 GL261 hücreleri (200 ul) eklenir. Not: Tek başına mikroglia olmayan GL261 hücreleri, kontrol olarak hizmet eder. </li><li> 120 x g&#39;de 5 dakika boyunca mikrofuj Spin hücreleri. </li><li> buz üzerinde 200 ul soğuk matris içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> 8 mcM gözenek boyutu odası ucun üst bölmesinin merkezi üzerine plakası 50 ul (50,000 hücreler). </li><li> polimerizasyon meydana gelmesi için, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Alt de üst bölmesi ve 700 ul serum içeren hücre büyüme ortamına 200 ul serumsuz ortam ekleyin. </li><li> 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edin. </li><li> kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. bölüm 4 fo geçinr görüntü analizi. </li></ol> 4. Görüntüleme Tahliller <ol><li> % 3.7 formaldehit odaları çıkarın ve PBS 1x taze 500 ul içeren iyi yıkayın. NOT: odalar kurumasına izin vermeyin. </li><li> bir pamuklu kullanarak, yavaşça filtre yüzeyi kazınarak filtrenin üst kısmı (yan bölmesinin içine bakan) için invazif olmayan hücreler temizleyin. yavaşça başlayın ve giderek basıncı artar. odasının başına bu en az 3 kez yapın. </li><li> ya bir cam tabanlı çanak odaları yerleştirin veya 24 plaka bırakın. </li><li> Kamera ve görüntü yakalama yazılımı 9,10 ile donatılmış bir epifluorescent veya lazer konfokal floresan mikroskop sahnede örnek yerleştirin. </li><li> temsili alanların birkaç 10X veya 20X fotoğraf çekmek. </li><li> Örneğin ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak, alt 9,10 filtreyi geçti glioblastoma hücrelerinin sayısını saymak. </li><li> &quot;3D görüntüleme Eğer. 4.6 Yukarıda açıklanan - &quot;işgali tahlil (bölüm 3 açıklanan), bir floresan lazer konfokal mikroskop 5-6 kullanarak Z yığını serisi oluşturmak görüntü için filtrenin alt invaziv hücre popülasyonunu, protokolü takip 4.2 adımları. </li></ol>

<ol><li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li>
<li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+astrocytic+glioma%3A+genetics%2C+biology%2C+and+paths+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion%3A+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li>
<li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+%28CSF-1R%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li>
<li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1%2Fepidermal+growth+factor+paracrine+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li>
<li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion%2C+intravasation%2C+and+metastasis+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li>
<li>Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

yüksek dereceli astrositomların ve glioblastoma son derece invaziv doğası bu beyin kanserleri çok ölümcül olun. Bu glioblastoma işgali moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak nedenle büyük önem taşımaktadır. Çok glioblastoma işgali zaten 17 süreci hakkında öğrenilmiştir. 10 kat - Bu yazıda ayrıntılı tahlil formatları kullanarak, bizim laboratuvar tümörle ilişkili makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali uyarabilir, hem fare ve insan modellerinde gösterilmiştir. Bu Coculture modeli sadakatle potansiyel arasın...

Glioblastom tanı 1,2 andan itibaren yaklaşık 12 aylık medyan sağkalım agresif bir insan beyin kanseri olduğunu. Glioblastoma standart kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon refrakter olarak en ölümcül ve klinik zorlu kanserlerden biridir. glioblastoma yaygın doğası cerrahi tamamen rezeke gelişmiş tümör neredeyse imkansız hale normal beyinden yayılan tümör hücrelerini tanır. Bu son derece invaziv yönü glioblastoma ve diğer gelişmiş astrositomaların damgasını özelliğidir. Bu nedenle, bir çok çalışmanın odağıdır glioblastoma hücre istilası moleküler mekanizması olmuştur. Glioblastoma tümör mikro malignite 3-6 kurulmasında hayati bir rol oynar. Tümör ilişkili makrofajlar / mikroglia glioblastoma işgali 7,8 teşvik sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların çoğu, ancak kullanarak makrofajlar / mikroglia etkisini ölçtükfiziksel glioblastoma hücreleri ayırmak tahlilleri. Laboratuvarımız bize glioblastoma işgali cocultures makrofajlar / mikroglia bağlıdır nasıl çalışması ve işgali sırasında görüntü aralarındaki fiziksel etkileşimi sağlayacak izin geliştirilmiş tahlilleri üretmek için yola çıkmıştır. Klasik deneyleri hücre işgali &quot;standart&quot; Boyden çemberinin kemotaksisini ve kemo-istila formatlarını içerir ölçmek için. çalışılacak Burada hücreler belirli bir boyutu (çapı genellikle arasında 0.4 ve 8 uM) gözeneklere sahip altında bir polikarbonat filtresi içeren plastik odasına yerleştirilir. hücrelerinin istilasını süreci genellikle hücre dışı matris proteini arasında oluşan fiziksel bir bariyer kapsar. kemo-istila deneyinde, kullanılan tercih edilen matris Matrigel (bundan böyle &quot;matris&quot; olarak anılacaktır), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tarafından salgılanan bir hücre dışı matris proteini karışımı, fare sarkoma hücreleri ve büyük ölçüde col oluşmaktadırlagen tip IV ve laminin. Chambers, sonra ya da işgali uyarma şüphelenilen büyüme faktörleri olmaksızın hücre kültür ortamı ihtiva eden bir doku kültür çukuruna yerleştirilir. daha yüksek bir frekansta hücre dışı matris kaplı filtre ile istila ve filtrenin alt tarafına bağlı bir yüksek invaziv kapasitesine sahip hücreler. Biz glioblastoma hücre işgali üzerine mikroglia ve tümör ile ilişkili makrofajlar rolünü değerlendirmek için bu testte değiştirdiniz. 10 kat 9,10 - Biz mikroglia 5 iki glioblastoma hücre hatları işgali uyarabilir bu kağıt içinde açıklanan kokültürünün analizleri kullanılarak belirlemek mümkün olmuştur. Bu glioblastoma hayvan modellerinde gözlemlenmiştir yansıtan. Ayrıca, glioblastoma hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimler / mikroglia daha doğrudan incelenebilir üç boyutlu işgal tahlil geliştirildi. macropha ile uyarılan glioblastoma hücre invazyonu3D tahlilinde ges / mikroglia matrisi kaplı bölme yaklaşımı kullanılarak görülen şeyin karşılaştırılabilir. Benzer deneyler daha önce işgali 11-13 sırasında makrofajlar ile meme kanseri etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu yazıda anlatılan iki yöntem glioblastoma hücreleri makrofaj / mikroglia uyarılan işgali moleküler mekanizmasını (ler) incelemek yeteneği yardımcı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Corning BioCoat Matrigel İstila Odası: BD Matrigel Matrix</td><td>ile Corning/Fisher Scientific Cat</td><td>: 354481</td><td></td></tr><tr><td>Makrofaj Serumu İçermeyen Ortam (MSFM) (500 ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Kırmızı CMTPX Boya</td><td>Ömrü Teknolojileri/Moleküler Problar</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Yeşil CMFDA</td><td>Boya Ömrü Teknolojileri/Moleküler Problar</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>GL261 hücre hattı</td><td>Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>U87 hücre hattı</td><td>Amerikan Doku Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 hücre hattı</td><td>Amerikan Doku Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta (500 ml)</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell polikarbonat membran hücre kültürü ekleri (8 & mikro; M gözenek) paket başına 48.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Kültür Matrisi Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Ekstresi, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Kedi: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V, Isı Şoku İşlemli</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture tahliller glioblastoma invasion makrofaj ve mikroglia stimülasyon eğitim için

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastom (Evre IV glioma) 1 yıl sonrası tanı medyan sağkalım çok agresif bir insan kanser türüdür. glioblastoma doğuran moleküler olayların daha iyi anlaşılmasına rağmen, bu kanser halen geleneksel tedaviye son derece dirençli olmaya devam etmektedir. yüksek dereceli beyin tümörlerinin cerrahi rezeksiyon nedeniyle glioblastoma hücreleri son derece infiltratif doğaya nadiren tamamlandı. glioblastoma hücre işgali hafifletir tedavi yaklaşımları dolayısıyla cazip bir seçenektir. Laboratuvarımız ve diğerleri bu tümör ilişkili makrofajlar ve mikroglia (ikamet beyin makrofajlar) kuvvetle glioblastoma işgali teşvik göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol in vitro kültür analizleri kullanılarak glioblastoma-makrofaj / mikroglia etkileşimi modellemek için kullanılır. Bu yaklaşım büyük ölçüde bu habis Behav sağlayan makrofajlar ile iletişimi bozan ilaçların geliştirilmesi ve / veya keşif kolaylaştırabilirIOR. 10 kat - Biz mikroglia / makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali teşvik iki güçlü kokültürünün işgali testleri kurduk. Bir flüoresan işaretleyici ya da yapısal olarak bir flüoresan proteini ifade ile etiketlenmiş glioblastoma hücrelerinin matris kaplı polikarbonat odası ekler üzerinde olmayan ve makrofajlar / mikroglia ile kaplama ya da üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Hücre işgali filtrenin alt sadece invaziv hücreler görüntü floresan mikroskopi kullanılarak ve saymak tarafından değerlendirilir. Bu tahliller kullanılarak, çeşitli farmakolojik inhibitörleri (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib ve Semapimod) makrofaj blok tanımlanmıştır / mikroglia glioblastoma işgali uyarmıştır.

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, mikroglia ve makrofajlar esas glioblastoma hücre istilasını uyarabilir göstermiştir. İki farklı invazyon tahlilleri kullanılabilir ve Şekil 1 &#39;de tasvir edilmiştir. Şekil 2&#39;de, kurucu floresan proteini MCherry eksprese GL261 hücreler ve 48 saat mikroglia olmayan önceden kaplanmış odaları ekildi. mikroglia invaziv kapasitesi yaklaşık 10 kat artarak, ancak zaman kültür GL261 hücreleri kendi minimal invaziv id...

Kanserin kötü huylu davranışını anlamak, tümör hücrelerinin makrofajlar gibi tümör mikro çevresinin bileşenleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair doğru modeller oluşturmayı gerektirir. Burada, tümörle ilişkili makrofajlar ve mikroglia ile glioblastoma hücre etkileşimini incelemek için iki yöntem tanımlanmıştır ve burada glioblastoma invazyonu üzerindeki etki değerlendirilmektedir.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Bu deneyin genel amacı, glioblastoma hücrelerinin invazyon sırasında mikroglia ve makrofajlarla olan etkileşimini in vitro bir assay ile modellemektir. Bu yöntem, tümör mikroçevresi alanındaki; maligniteye ilerleme sürecinde mikroçevrenin bir hücre tipi olan makrofajlarla kanser arasındaki etkileşime hangi bileşiklerin veya tedavilerin müdahale edebileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajlarından biri, uygulanmasının nispeten kolay olması, makul bir sürede tamamlanabilmesi ve glioblastoma invazyonunu in vivo ortamda doğru şekilde modellediği görülmesidir.İlgili hücre hattını, aşağıdaki şekilde phorbol myristate acetate kullanarak diferansiyate ederek başlayın. İlk olarak, altı kuyucuklu bir kültür plağındaki 1,5 mililitre ortamın içine 2 ila 3 × 10⁵ THP-1 hücresi ekleyin. Ekimden hemen sonra, 100 nanomolar PMA ekleyin ve 37 °C ve %5 CO2 koşullarında 48 saat boyunca inkübe edin.48 saat sonra, medyayı aspire ederek PMA'yı uzaklaştırın, bir kez bir-X PBS ile yıkayın ve taze medya ekleyin. Hücreler analizde kullanılmaya hazır olana kadar 48 saat daha inkübe edin. Ardından, matris ön kaplamalı odaları, 500 microliter serumsuz medya içeren bir kuyucuğun içine yerleştirip üst kısımlarına 500 microliter serumsuz medya ekleyerek dengeleyin.Odacıkları 37 °C'de ve %5 CO2 ortamında iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, floresan işaretli glioblastoma hücre hatlarını, mikrogliaları ve makrofajları içeren kültür kaplarındaki medyumu nazikçe aspire edin. Daha sonra 500 µL 2 mM EDTA ve PBS ekleyin ve doku kültürü inkübatoründe 5 ila 10 dakika inkübe edin.Hücreleri %0,3 sığır serum albümini içeren beş mililitre besiyerinde toplayın ve 120 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından süpernatanı aspire edin ve hücre peletini uygun besiyerinde mililitre başına 1 × 10⁶ hücre konsantrasyonuna gelecek şekilde yeniden süspande edin. Hücreleri saymak için hemositometre kullanın. Ardından, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına %0,3 BSA içeren 500 µL uygun besiyeri ekleyin.Ardından, dengeleştirilmiş odacıklardaki besiyerini uzaklaştırın ve odacıkları 24 kuyucuklu plakadaki kuyucuklara yerleştirin. Makrofaj veya mikroglia tarafından stimüle edilen gliom invazyonu üzerindeki etkilerini incelemek için inhibitörler kullanılıyorsa, odacığın hem alt hem de üst kısımlarına uygun konsantrasyonda ekleyin. Kullanılan hücre hattına bağlı olarak; glioblastoma hücreleri ile fare mikroglia hücrelerini veya gliom hücreleri ile makrofaj hücrelerini, protokolün yazılı kısmındaki detaylara göre karıştırın.Hücre karışımını üst hazneye ekleyin ve hücre tipine bağlı olarak 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, hücreleri nazik bir aspirasyonla haznenin üst kısmından uzaklaştırın. Ardından, fiksasyon için hazneleri PBS içindeki %3,7'lik formaldehite yerleştirin.Odacıkların oda sıcaklığında 15 dakika boyunca fiksatif içinde kalmasını sağlayın. Son olarak, fiksatifi nazikçe aspire ederek uzaklaştırın ve yerine 500 µL bir-X PBS ekleyin. İlk olarak, matriks karışımını dört derece Celsius'ta gece boyunca çözdürün.Ardından, uygun besiyerinde buz üzerinde 10 mg/mL konsantrasyonunda matris hazırlayın. Daha sonra, daha önce gösterildiği gibi, matris içinde süspansiyon haline getirmek için etiketli hücreleri hasat edin. Ardından, 150 µL hacmindeki 1,5 × 10⁵ GL261 hücresini ve 50 µL'deki 5 × 10⁴ mikroglia hücresini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.Ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 200 mikrolitre hacimde 2x10⁵ GL261 hücresi ekleyin. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 120 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, hücreleri buz üzerinde 200 mikrolitre soğuk matris içinde yeniden süspande edin. Olgun jel polimerizasyonunun vaktinden önce gerçekleşmesini önlemek için bu adımda buz teknesinin çeker ocakta hazır olması, tüplerin buz üzerinde tutulması, uçların buzdolabında olması ve her şeyin soğutulduğundan emin olunması kritik önem taşımaktadır.Yeniden süspansiyon işleminin ardından, 50.000 hücreyi 50 µL hacimde, sekiz mikron gözenek boyutuna sahip bir chamber insert'in üst bölmesinin merkezine ekleyin. Ardından, polimerizasyonun gerçekleşmesi için 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. 30 dakika sonra, üst bölmeye 200 µL serumsuz besiyeri ve alt kuyucuğa 700 µL serum içeren hücre büyüme besiyeri ekleyin.48 saatlik inkübasyonun ardından, hücreleri hafif bir aspirasyonla kameranın üst kısmından uzaklaştırın. Kameraları daha önce yapıldığı gibi fikse edin ve hücreleri görüntülemeden önce fiksatifi 500 µL 1X PBS ile değiştirin. Bu temsili görüntü, mikroglia yokluğunda istila eden mCherry ekspresyonlu GL261 hücrelerini göstermektedir.Hücreler matrisle kaplı bölmelere ekildi ve 48 saat boyunca inkübe edildi. Görüntüler 10X objektif kullanılarak alındı ve ölçek çubuğu 400 mikronu temsil etmektedir. Burada GL261 hücreleri mikroglia ile birleştirilmiştir.Filtreyi geçen GL261 invaziv hücrelerinin sayısı nicelendirildi. Burada görüldüğü üzere, fare glioblastoma hücre hattı GL261'in mikroglialarla birlikte kültüre edilmesi, 2D analizinde invazyonunu 10 kata kadar artırmaktadır. Bu görüntü, farmakolojik inhibitörlerin, mikroglia ile stimüle edilmiş GL261 invazyonu üzerindeki etkisini DMSO kontrolü ile karşılaştırmalı olarak göstermektedir.Gösterilen veriler altı bağımsız deneyden elde edilmiştir. Bu analiz, insan hücre hatları kullanılarak da başarıyla uygulanmıştır. Matriks kaplı odacıklara ekilen ve CMFDA yeşili ile boyanan U87 hücreleri, 24 saatlik inkübasyon sonrası gösterilmektedir.Burada U87 hücreleri, diferansiye edilmiş THP1 makrofajları ile birlikte ekilmiştir. Bu görüntü, yalnızca invaziv U87 hücrelerini sayan analiz niceliğini göstermektedir. İnsan makrofaj hücre hattı THP1, U87 glioblastoma hücresi invazyonunu stimüle etmiştir.Gösterilen veriler 10 bağımsız deneyden elde edilen ortalama değerlerdir. GL261 ve mikroglia kokültürünün 3D invazyon analizinden alınan bu görüntü, bir Z-serisi görüntülerden oluşturulmuş kompozittir ve yalnızca matrise gömülmüş, CMFDA yeşili ile boyanmış GL261 hücrelerini göstermektedir. Burada GL261 hücreleri, CMPTX kırmızısı ile işaretlenmiş murin mikroglialar ile kokültür edilmiştir.Burada, filtrenin alt yüzeyinde yer alan ve invaziv olduğu belirlenen GL261 hücreleri gösterilmektedir. İnvaze eden toplam GL261 hücresi sayısı belirlenmiş ve monokültürdeki GL261 hücrelerine göre normalize edilmiştir. Gösterilen veriler, duble olarak gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin ortalamasını temsil etmektedir.Bu teknik bir kez uzmanlaşıldığında, baştan sona yaklaşık iki saat içinde tamamlanabilir. Deneyin nihai sonuçları ise 48 saat sonra elde edilebilir. Bu nedenle, bu tekniği uygularken tüpler ve pipetler de dahil olmak üzere her şeyin soğutulmuş olması ve 4 °C'de tutulması çok önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, makrofaj-mikroglia kokültür invazyon deneylerinde glioblastoma modelinin nasıl kurulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, indüklenmiş pluripotent kök hücreler kullanarak nöroblastom için mikroglial fagositoz testini gerçekleştiriyoruz. Test, nörodejeneratif hastalıklarda mikroglial fonksiyonun bozulmasını değerlendirmeye yardımcı olur.

Mikroglial Fagositoz Testi: iPSC Makrofajları Kullanılarak Nöroblastom Hücreleri için Mikroglial Fagositoz Modeli Oluşturmak İçin İn Vitro Test

Bu videoda, peritümöral boşluklardaki nöronlar üzerinde göç ederken glioblastoma kök benzeri hücrelerin miyelinli nöronal yolların istilasını taklit eden mikro desenli nöronlar üzerindeki glioblastoma hücrelerinin bir ko-kültür testi açıklanmaktadır. Bu tahlil, glioblastoma hücrelerinin göçünü inhibe eden farmakolojik ilaçların bir gliomdaki nöronlar üzerindeki etkilerini analiz etmeye yardımcı olabilir.

Desenli Nöronlar Üzerinde Glioblastoma Hücrelerinin Birlikte Kültürlenmesi: Glioblastoma Hücrelerinin Sıçan Hipokampal Nöronları Üzerindeki Göçünü İn Vitro İzlemek İçin Bir Teknik

Bu video, reaktif bir oksijen türü olan süperoksit radikallerinin üretimi için mikroglial hücreleri aktive etmek için β-glukanların kullanıldığı bir in vitro testi göstermektedir. Beyin kanseri hücrelerinde, üretilen reaktif oksidanlar, tümör hücresi proliferasyonunu aktif olarak baskılar ve hücre ölümünü indükler.

Beyin Kanseri Hücrelerine Karşı Bir İmmünoterapi Stratejisi Olarak Test β-Glukanı Analiz Etmek İçin Bir Test

Bu video, çok elektrotlu dizilere sahip bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hiPSC'den türetilmiş kortikal glutamaterjik nöronların ve glioma hücrelerinin bir ko-kültüründe nöronal elektriksel aktivitenin değerlendirmesini göstermektedir.

Bir ko-kültürde glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Bu videoda, glioblastoma ve mikroglia hücreleri bir polimer matris çözeltisi ile karıştırılır ve hücreleri gömerek bir jelin oluştuğu gözenekli bir oda ekine aktarılır. Mikroglia, glioblastoma hücrelerinin gözenekli ek yoluyla göçünü uyararak, tümör hücresinin çevre dokuya istilasını taklit eder, Hücreler daha sonra sabitlenir ve daha fazla analiz için hazırlanır.

Mikroglia Glioblastoma Ko-Kültürü Kullanılarak Matris Tabanlı Tümör İnvazyonu Modeli

Karsinom hücreleri ile Organotipik beyin kesit kokültürü beyin dokusu karsinoma hücre istilası sürecinde floresan gibi parlak saha (video) mikroskopisi ile görselleştirme morfolojik değişiklikler sağlar. Bu model sistem ayrıca hücre değişimi ve ikmal yaklaşımlar sağlar ve manipülasyonlar ve analizlerin bir yelpazede sunuyor.

Bir Organotipik Beyin Dilim ve kanser hücrelerinin 3D Sferoid ile Coculture Sistemi

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Öğrenin, glioblastoma hücreleri ile makrofaj ve mikroglia arasındaki etkileşimleri in vitro ortamda modellemek için. Bu yöntem, tümör mikroçevresindeki işlevleri ve potansiyel tedavileri araştırmaya yardımcı olur.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Daha fazla video keşfet