Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı

Bu prosedürün genel amacı, IgM izotipine odaklanarak terapötik potansiyele sahip antikorlar için antijenleri tanımlamaktır. Bu yöntem, biyomedikal alandaki bir bilgi boşluğunu doldurur ve kanser araştırmaları ve merkezi sinir sistemi hastalıkları için yeni biyobelirteçlerin ve immünoterapötik ajanların tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, büyük terapötik potansiyele sahip ihmal edilmiş bir antikor sınıfına kapı açmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, antikor bazlı terapötikler tarafından hedeflenebilecek tüm hastalıkların teşhis ve tedavisine kadar uzanır. Bu konu, IgM antikorlarının antijenleri ve büyüyen doku ve alt kültürler hakkında fikir verebilir. Ayrıca, tüm türlerden diğer antikor izotipleri için bir yanıklık olabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, farklı biyokimyasal uygulamalarda IgM antikorunun spesifik ve belirgin bir şekilde bağlandığını fark ettiğimde aklıma geldi. Prosedürü göstermek için Robert Kahoud ve Jens Watzlawik olacak. Bu işleme başlamak için, kafatasını kulak hizasında öne doğru bir kesik yapın ve kafatasını geriye doğru soyun.

Ardından, beyni yavaşça 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve hemen kuru buz üzerinde saklayın. Beş dakika sonra beyni temiz bir tartı kağıdına aktarın ve temiz bir tıraş bıçağı kullanarak beyincik ve beyin sapını hızla çıkarın. Daha sonra, donmuş serebrumları buz üzerindeki 15 mililitrelik tüpe geri aktarmadan önce tartın.

Mikrolitre lizis tamponu başına 150 mikrogram beyin dokusunun son konsantrasyonuna buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Daha sonra, bir mililitrelik bir pipet ucundan öğütme ve ardından 27 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırıngadan öğütme yoluyla beyni lizis tamponunda homojenize edin. Bundan sonra, tam doku lizizine izin vermek için beyin lizatını buz üzerinde 30 dakika daha inkübe edin.

30 dakika sonra deterjanı, çözünmeyen materyali ve beyin lipitlerini seri santrifüjlemeye çıkarın. Miyelin ve pelet içeren hücre kalıntılarını atın, ancak her santrifüjleme adımından sonra süpernatanı koruyun. Beyin parçalayıcısını alın ve 80 santigrat derecede saklayın.

Bu adımda, BSA ile 200 mililitre IP Tamponu ve BSA olmadan 200 mililitre IP Tamponu hazırlayın. İmmünopresipitasyon reaksiyonu için, 100 mikrolitre Protein L agaroz bulamacını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe BSA ile bir mililitre IP tamponu ekleyin.

Ardından, ters çevirerek manuel olarak karıştırın. Daha sonra, Protein L agaroz boncuklarını santrifüjleme ile dört kez yıkayın. Bundan sonra, agaroz peletini bozmadan süpernatanı çıkarın ve yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, Protein L agarozuna IP tamponu içeren taze BSA ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede bir silindirde inkübe edin. BSA ve 30 miligram parçalanmış beyin dokusu içeren 800 mikrolitre IP tamponunda, 20 mikrogram deneysel antikor, kontrol antikoru veya PBS ekleyin. 30 miligram parçalanmış beyin dokusunu, dört santigrat derecede gece boyunca 1.5 milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpünde IgM antikoru ile buz gibi soğuk IP tamponunda inkübe edin.

Ertesi gün, Protein L agaroz boncuklarını bir tezgah üstü santrifüjde döndürün. Agaroz peletini bozmadan süpernatanı atın. Ardından, soğutulmuş antikor beyin lizat çözeltisini Protein L agaroza ekleyin.

Antikor antijeni olan Protein L agaroz süspansiyonunu dört santigrat derecede bir silindir üzerinde iki saat inkübe edin. İki saat sonra, agaroz L'ye bağlı antikor antijen kompleksini santrifüjleme yoluyla yıkayın. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın ve üzerine %0,2 BSA içeren bir mililitre buz gibi soğuk IP tamponu ekleyin.

%0,2 BSA içeren buz gibi soğuk IP tamponu kullanarak yıkama adımını bir kez daha ve BSA'sız buz gibi IP tamponu kullanarak iki kez daha tekrarlayın. Bundan sonra, agaroz L'ye bağlı antikor antijen kompleksini aşağı doğru döndürün. Protein L agaroz peletinin üstünde yaklaşık 50 mikrolitre çözelti kalana kadar süpernatanı atmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Ardından, tamamen çıkarmak için 10 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Tüm numuneleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, her 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 40 mikrolitre IP elüsyon tamponu ekleyin. Tüpü altı kez parmakla kaydırın ve 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

Bundan sonra, numuneyi iki dakika boyunca buzun üzerine koyun ve 30 saniye boyunca döndürün. Ardından, 35 mikrolitre süpernatanı, peleti bozmadan yeni bir 1.5 milimetre mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, iç tüp duvarında az miktarda seyreltilmiş numuneyi durulayarak Protein L agaroz boncuklarının olmadığını doğrulayın.

Protein L agaroz boncukları varsa, numuneyi 13.000 kez g'de 30 saniye daha döndürün ve süpernatanı temiz bir tüpe aktarın. Hiçbir agaroz boncuk tespit edilemeyene kadar bu adımı tekrarlayın. Ardından, bir SDS poliakrilamid jel ve bir tris-glisin SDS tampon sistemi üzerine oyuk başına 10-20 mikrolitre seyreltilmiş numune yükleyin ve jeli ek soğutma olmadan tezgah üzerinde 100 voltta yaklaşık bir saat çalıştırın.

Yavaş yavaş, proteinleri bir PVDF zarına aktarın. Proteinler, soğuk transfer tamponu kullanılarak soğuk odada 100 voltta iki buçuk saat boyunca aktarılır. Membranı, bir tezgah üstü orbital çalkalayıcı üzerinde 25 santigrat derecede bir saat boyunca PBS-T'de hacim başına %10 ağırlık kuru süt tozu ile bloke edin.

PBS-T ile her seferinde 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. Membranı PBS-T'de% 5 BSA'da birincil antikor ile araştırın. Gece boyunca soğuk odada bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.

Ertesi sabah, membranı 25 santigrat derecede fazla PBS-T ile bir kez yıkayın, ardından bir orbital çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca PBS-T ile üç yıkama yapın. Daha sonra, membrana PBS-T'de ikincil antikor ve% 5 kuru süt tozu ekleyin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bundan sonra, membranı 25 santigrat derecede fazla PBS-T ile bir kez yıkayın, ardından bir orbital çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca PBS-T ile üç yıkama yapın.

Bir mililitre soğutulmuş geliştirilmiş kemilüminesans HRP substrat bileşeni A'yı 25 santigrat derecede bir mililitre B bileşeni ile karıştırın. Fazla sıvıyı çıkarmak için zarı bir kağıt havlu üzerine aktarın. Ardından, zarı tekrar aktarmadan önce kabı kağıt havluyla kurulayın.

Hemen, önceden karıştırılmış geliştirilmiş kemilüminesans HRP substratından iki mililitre membrana ekleyin ve 25 santigrat derecede iki dakika inkübe edin. Membranı eşit şekilde nemlendirmek için kabı her 20 saniyede bir elinizle eğin. Bundan sonra, zarı şeffaf plastik bir kılıfa aktarın ve fazla sıvıyı ve hava kabarcıklarını kağıt havluyla temizleyin.

Plastik kılıfı kasete bantlayın ve kapatın. Bu şekil, HigM12'nin antijenini serebral beyin lizatlarından immünopresipite ettiğini ve Western lekelerinde bir tespit ajanı olarak hareket ettiğini göstermektedir. Ne izotip kontrol antikoru ne de agaroz L boncukları, aşağı çekmenin özgüllüğünü gösteren benzer bir antijeni immünopresipite etmez.

Burada, yabani tip ve NCAM nakavt farelerden elde edilen CNS lizatlarını kullanan Western lekeleri, HIgM'nin NCAM içeren PSA'ya özgüllüğünü göstermektedir ENDO-NF kullanılarak vahşi tip farelerden CNS dokusunun enzimatik sindirimi, NCAM'a bağlı PSA'yı HIgM12 için spesifik bağlanma apitopu olarak tanımlar. Burada özetlenen yöntem kullanılarak, yüksek saflıkta IBA-1 pozitif sıçan mikroglial kültürleri elde edilir. Mikroglia'nın aksine, HIgM12 ve A2B5 hedef hücre yüzey antijenleri, canlı hücre koşulları altında sıçan OPC kültürlerinde yüksek oranda zenginleştirilmiştir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik 13 çalışma saati içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, antikorların birleşme ve birleşme sabitlerine bağlanma afinitelerini tanımlamak için Biacore veya yüzey plazmon rezonans teknolojisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser araştırmaları, immünoterapiler ve doğal otoantikorlar alanındaki araştırmacıların, insanlarda terapötik IgM antikorları için antijen olarak benzer proteinler üzerindeki karbonhidrat apitoplarını tanımlamasının yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, insan IgM antikorlarını içeren araştırma çalışmaları için glikoprotein antijenlerinin nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Veriler, MS tedavisi için yeni bir hedef sunmaktadır. Geliştirdiğimiz antikor tedavisi olan PSA ENCAP, Multipl Skleroz'a benzer şekilde hastalıkta ve değersizleştirici hastalıkta bulunan titiz modeli kullanarak bir aktivite kutusunda fonksiyonel iyileşme gösteren ilk tedavilerden biridir.