Name: Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Öğrenin, IgM antikorları için antijenleri immünopresipitasyon ve Western blot yöntemleriyle belirlemeyi. Bu teknik, kanser ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında yeni biyobelirteçler ve immünoterapötik ajanlar keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık (R01 GM092993, R01 ve R21 NS048357 NS073684) National Institutes of hibe ile desteklenmiştir, Ulusal Bilim Vakfı (KARİYER Ödülü), Biyoteknoloji Minnesota Ortaklığı Ödülü ve Tıbbi Genomik, Ulusal Multipl Skleroz Derneği (CA1060A) ve klinik ve Translational Bilim Mayo Clinic Merkezi (CCaTS). Yazarlar Applebaum, Hilton, Peterson ve Sanford Vakıflar, Ay ve Marilyn Parkı Müdürlüğü Fonu ve McNeilus ailesinden destek için minnettarım.

Remiyelinizasyonu ve CNS onarımını destekleyen antikorların patentleri Mayo Clinic'e aittir ve Mayo Clinic'e aittir. Yazarların potansiyel bir çıkar çatışması vardır.

İnsan doğal IgM oto-antikorları imünoterapiler için adaylar çekicidir ve kanser ve merkezi sinir sistemi bozukluklarının 1-7 de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisi için terapötik bir potansiyel göstermiştir. Avantajlı bir şekilde, bu antikorlar, nötralize edici antikorların üretimi esas etkin terapötik dozu ve etkinliğini azaltır bir bağışıklık karşılığını ortaya olmaz. Önemli olarak, terapötik potansiyeli olan tüm antikorlar IgM izo türünün edilmiş ve NAb repertuar 3-5,8,9,37,40,42-45 ait olan. IgM antikorlarının potansiyel klinik uygulama için önemli bir engel, birçok durumda belirlenmiş değildir antigenleri, tanımlanmasıdır. IgG antikorları için kullanılan standart teknikler çoğu zaman bir IgM en antijeni belirlemek için geçerli değildir. Bu protokol, hayvan modellerinde etkili rejeneratif insan IgM antikoru HIgM12 için antijen olarak PSA NCAM tanımlanmasını açıklarMS ve ALS 15-18. kullanılan yöntem ne olursa olsun, antikorun izotipi, VκI hafif zincirleri belirli bir VK hafif zincirlerin VκI, VκIII ve VκIV ve fare antikorları ile insan antikorları esas olarak uygulanabilir. Bu protokolde en önemli nokta, afinite kromatografisi uygulamalarında IgM antikorlarının kullanılmasıdır. Daha özel olarak ise, başarılı bir antikorları izole etmek için veya karmaşık doku ya da hücre kültürü lizatlarının üzerinden bir antijen ettirecek İmmüno açılan maddeler olarak hareket etmeleri gerekmektedir. Zenginleştirilmiş antijen parçacıkları izotip kontrol antikorları arasında İmmüno göre ve ardından kütle spektrometrisi ile farklılıkların analiz edilebilir. Bir temel gereksinim ya da bu aşama sınırlama proteini L agaroza antikor bağlanmasını sağlamak için doğru bir antikor VK hafif zincir ve ana bilgisayar (insan, fare) varlığıdır. agaroza bağlanmış manan bağlayıcı proteinin kullanımı (aynı zamanda called yerine protein L agaroz) lektin mannoz bağlayan özel VK hafif zincirleri olmadan IGMS immünopresipitasyon için potansiyel bir alternatiftir. Arnold et al., 35 tarafından belirtildiği gibi, ancak, antijene bağlı IgM antikorları IgM kendi antijenine bağlandığı sonra, hedef glıkan erişilemez hale görünen ve manan-bağlayıcı proteine ​​bağlanmazlar. Bu bulgulara dayalı olarak manan-bağlayıcı protein antijen yüklü IgM 35 molekülleri immünopresipitasyon bir bağlayıcı matris olarak kullanılamaz. Diğer potansiyel alternatifler ikincil agaroz bağlı anti-IgM IgG antikorları 46,47 veya yüzey aktif manyetik boncuk 48 kullanım kullanımı olabilir. IGMS karşı IgG antikorları ilgili antijen ile elute edilen antikor ölçüde azaltmak için A veya agaroz G agaroz kimyasal olarak çapraz bağlanmış olabilir. başarılı bir şekilde tespit antijenleri ile bağlantılı olarak IgM immüno farklı varyantları arasında uygun bir karşılaştırma IEn asyonlar izole ya da antijenleri daha fazla ilgi olmadan IGMS tüketmek için yapıldı çünkü zor. Buna ek olarak, IGMS kullanılarak imüno esas olarak saflaştırılmış antijenleri 49 antikor maruz önceden bilinen etkileri tek bir antijen teyit etmek için kullanıldı. Başlangıç ​​malzemesi 50 ile karşılaştırıldığında çökeltilir IgM moleküllerinin - (% 15 10), insan IGMS karşı agaroz çiftli IgG&#39;lerin bir dezavantajı çok düşük bir verim elde edilmiştir. Bunun aksine, yüzey aktif manyetik boncuk başarılı skrapi ile ilişkili fibriller 48 immünopresipitasyon IgM dahil olmak üzere farklı izotiplerin antikorlarının uygulanmıştır. Bu yöntem, özel bir kappa (VK) veya lambda (λ) zincir ya da belirli bir ana bilgisayar ile sınırlı değildir ve büyük ölçüde İmmüno kullanılan IgM antikorlarının daha geniş bir spektrumda olabilir. protokol önemli bir adım, bir det olarak işlev antikorun yeteneğiWestern blotlar ya da başka bir tarama platformlarında antikor (birinci antikor) ecting. Başarılı antikorlar, antijen iyonik olmayan bir ya da muhtemelen iyonik deterjanlar varlığında bağlanma sağlamak için yeterli derecede yüksek afiniteye sahip, antijen hedeflemelidir. Yüksek afinite antikorları afinite olgunlaşmış IgG antikorları arasında yaygın, ama nispeten biyokimyasal ayarlarında ajanları tespit olduğunca az piyasada mevcut IgM antikorları vardır nedenlerinden biri olan IgM izo, antikorların arasında daha az yaygındır. antikorların yüksek bağlanma eğilimi moleküler antijenlerin İmmüno ve Western lekeleme için bir gerekliliktir. Deterjan konsantrasyonlarını veya IP tamponlar ve lizis tampon deterjanların yokluğu düşürücü, Fab alanı üzerinden, düşük afiniteli antikorlar ile hedef antijen sağlar. Bunun aksine olarak, Fc kısmına ile Protein L agaroz hedef antikorun kabiliyeti önemli ölçüde farklı deterjan konsantre ve aralığında izotip kontrolleri arasında etkilenmezyerel yönetim bu. Bununla birlikte, liziz tamponu ve IP tampon maddesi içinde düşük bir deterjan konsantrasyonu hücre membran bozulması ve spesifik moleküllerin izole önler. Benzer bir şekilde, Western Blot yıkama tampon içinde düşük bir deterjan konsantrasyonu (örneğin, PBS-T) düşük afiniteli antikorların antijen bağlama sağlar ama aynı zamanda spesifik olmayan bağlanma artar ve bu nedenle bir seçenek değildir. bir antijen proteini çekirdek varlığı bu yöntem için bir gerekliliktir. Posttranslasyonel modifikasyonlar (örneğin, glikoproteinler, lipoproteinler) ve değişikliğe uğratılmamış protein, ancak tek başına lipitler veya karbonhidrat sahip proteinler, Western blotlar da tespit edilebilir. Deterjan varlığında veya yokluğunda, doku ya da hücre lisatlanndan lipidler (örneğin, sfingolipitler) immünopresipitasyon mümkün değildir. Aynı zamanda deterjanlar bozmak için gerekli olan süre deterjanlar ve lipid fiziko-kimyasal özellikleri, seçici bir lipit-antikor etkileşimi sağlamak için çok benzerdiriçin membranlar spesifik moleküllerin seçici izolasyon sağlamak için. bir protein çekirdeğinin olmaması bizim en iyi bilgi, sadece karbonhidrat oluşan İmmüno, için, daha önce rapor edilmemiştir. IgM antikorları sıklıkla mutlaka bir protein birimine bağlantılı değildir karbonhidrat ve glikolipitler, hedef, çünkü bu özellikle ilgili olur. Diğer kromatografik teknikler, bir protein çekirdek yokluğunda, lipidler ve karbohidratlar ayrılması ve immünolojik tespiti için gereklidir. Örneğin, TLC plakası (immüno-TLC) ile daha sonra bir antikor tespiti hücresel lipidlerin ince tabaka kromatografisi (TLC), 51,52 uygulanabilir. Diğer anti-PSA antikorlar ticari olarak temin edilebilen bir anti-PSA IgM gibi HIgM12 kıyasla daha önceki çalışmalar ve sonuç olarak tarif edilmiştir (klon 2-2B). PSA alanında en çok kullanılan antikor fare monoc olarak mevcut bir IgG antikoru (klon 735) olanlonal veya tavşan poliklonal antikoru 53. Bu anti-PSA IgG antikor mikroglial hücreleri 41 dahil olmak üzere farklı MSS hücre tipleri üzerinde SynCAM ve NCAM üzerinde PSA algılar. Anti-PSA IgG antikoru tersine, insan IgM antikorları HIgM12, HIgM42 ve anti-PSA fare IgM (klon 2-2B) farelerinde çeşitli embriyonik ve erken doğum sonrası aşamada SynCAM PSA hedef yapamaz (ancak NCAM üzerine) olarak 15, non-polisialilatlanmış SynCAM ise kolayca saptanabilir. Kullanılan IgM antikorları da mikroglial hücreleri (Şekil 3 + 4) üzerine PSA tespit etmek mümkün değildir. izotiplerle arasında gözlemlenen farkların için olası bir açıklama, anti-PSA IgG&#39;ye IgM antikorlarının bağlanması potansiyel olarak daha düşük bir afinite ile birlikte, PSA-NCAM seviyelerine göre düşük PSA SynCAM seviyeleri olabilir. Bu hipotezi test etmek için, &lt;SynCAM mevcut büyük miktarda embriyonik evre E17 de NCAM KO hayvanlarda asyonlar gerçekleştirilen ve bir &quot;pull-down ajanı&quot; olarak HIgM12 kullanılansup&gt; 15. E17 WT yavru içinde HIgM12 akıtılan antijenler kullanılarak sonraki Western blot dansitometri tarafından tespit edilen IGMS ağır zincir ile karşılaştırıldığında PSA-NCAM &quot;aşağı çekti&quot; benzer şiddetleri gösterdi bir ölçüde PSA-NCAM immunoprecipitated kontrolleri. Bu sonuç, hedef PSA HIgM12 en azından yeterli bir yakınlık önerdi. WT yavru aksine HIgM12 NCAM KO hayvanlarda SynCAM bağlı PSA tespit etmedi kontrol eder. Aynı sonuçlar, insan anti-PSA IgM HIgM42 kullanılarak İmmüno elde edilmiştir. HIgM12 ve HIgM42, hem de fare anti-PSA IgM (klon 2-2B) embriyonik ve doğum sonrası gelişim aşamalarında VT ve NCAM KO hayvanlardan Western lekeleme SynCAM PSA hedef yapamaz. Düşük afiniteleri yalnız olası görünmektedir özellikle 15 CNS doku (oyuk başına 0.1 ug CNS dokusu) küçük miktarlarda kullanılarak Western lekeleme ile NCAM bağlı PSA tespit etmek için gerekli olan HIgM12 düşük bir miktar (0.1 ug / ml) verilenÜç farklı yöntemler HIgM12 PSA-SynCAM algılama tam olmaması sorumludur. Anti-PSA IgM antikorları ve sık sık yayınlanan anti-PSA IgG antikoru (klon 735) arasında önemli farklılıklar vardır sonucuna vardık. piyasada mevcut anti-PSA IgM antikorları HIgM12 zaten farklı hastalık modellerinde etkinliğini kanıtlamıştır çünkü bu özellikle ilginçtir antiPSA IgG antikoru 735 ile elde edilen sonuçları doğrulamak için geçmişte daha sık kullanılan değildi neden belli değildir. diğer anti-PSA IgM antikorları benzer terapötik etkilere sahip olabilir iken, anti-PSA IgG antikoru (klon 735) MS ve ALS modellerinde benzer terapötik sonucu olup olmadığını belirsizliğini koruyor. Kısaca, burada açıklanan yöntemler, MS için potansiyel klinik denemeler ve muhtemelen diğer nörodejeneratif hastalıklar desteklemek için rejeneratif insan antikoru HIgM12 antijeni belirlemek için temel olarak kullanılmıştır. karınca tanımlanmasıbiyolojik aktivite ile antikorlar için igens etki mekanizmalarını anlamak için önemli bir adımdır. Bu, şu anda insan denemelerinde güvenlik ve etkinlik için test edilen pek çok monoklonal antikorlar bağlamında özellikle uygun olur. Bugüne kadar klinik olarak test IgM antikorlarının sayısı küçük olsa da, bu antikor 1-10,37,40,42-45 terapötik potansiyelini vurgulayan çalışmalar artan sayısı ile birlikte hibridom teknolojisindeki son gelişmeler, yeni ve gelişmesini çağrısı protein-olmayan IgM antijenlerin belirlenmesi için değiştirilmiş yöntemler uygulanabilir.

IgM izo türü antikorların kanser ve merkezi sinir sistemi bozukluklarının 1-7 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisi için büyük terapötik potansiyeli göstermektedir. Vollmers &#39;grubu tümöre özel biyolojik veya apoptotik yollar 4,8,9 indükleyerek kötü huylu hücreleri öldürmek mümkün olan aktif terapötik olarak potansiyel kullanımı için kanserli hastalarda çeşitli antikorlar tespit edilmiştir. İlginç bir şekilde, terapötik potansiyeli olan tüm tanımlanan antikorlar, IgM izo türünün ve &quot;doğal otoantikorlar&quot; (yakalar) grubuna aittir. Benzer şekilde, Rodriguez grup fare ve multipl skleroz (MS) bir model Kronik miyelin kaybetmiş omurilik lezyonları yeniden miyelin oluşumunu teşvik insan antikorları tespit edilmiştir. Anti-kanser etkilere sahip antikorlar ile aynıdır, her remiyelinasyon teşvik antikorlar yakalar ve IgM izo 1,6,7,10 arasında. saptanabilir IGMS için kesin antijenler de saptanmamış olanBen klinik çalışmalar MS hastalarında 11 şu anda Faz insan remiyelinizasyon teşvik antikor rHIgM22 dahil olmak üzere, d. Akademik ortamda ve sanayi 11 ortaklığı ile hem lipit ve karbonhidrat araştırma alanında uzmanlar tarafından tekrarlanan çabalarına rağmen, rHIgM22 en antijen başarılı olmamıştır tanımlamaya çalışır. IgM antikorları ile çalışmak için IgG antikorlarının antijenler tanımlamak için kullanılan standart teknikler başarısızlığı bu antikorlar en olası hedef karbonhidrat ya da lipid antijenleri için özel yöntemler geliştirmek için önemli bir ihtiyaç tanımlar. Bu yazının odak noktası insan rejeneratif antikor HIgM12 ve antijeni tanımlamak için kullanılan deneysel prosedürler olduğunu. Antikor HIgM12 Waldenström makroglobulinemisi hastalardan tespit edilmiştir, in vitro 12-14 nörit gelişimini uyarır ve nöral hücre adhezyon molekülü (PSA-NCA bağlı polysialic asit (PSA) hedefM) 15,16. HIgM12 ALS 17 bir fare modelinde ömrünü uzatır ve Theiler ensefalomiyelit virüsü murin (TMEV) ile enfekte olan fareler, fonksiyonel iyi sonuçlar alınabilir. Intraperitoneal, tek bir düşük doz antikor 18 enjekte sonra Özellikle, HIgM12 küçük ve orta çapı omurilik aksonlarının sekiz haftalık kronik demiyelinize fare ve gittikçe artan sayıda spontan yatay ve dikey motor aktivitesini uyarır. Nöral hücre adhezyon molekülü (NCAM) süper nöronlar, glia, iskelet kası, ve doğal öldürücü hücreler 19-25 hücre yüzeyi üzerinde eksprese edilen immünoglobülin (Ig) &#39;in bir glikoproteindir. NCAM180, NCAM140 ve NCAM120 olarak adlandırılan üç ana NCAM izoformları kendi sitoplazmik alanında yalnızca değişir birincil transkriptin seçenek dilim varyantı bulunmaktadır. CNS içindeki, NCAM uzun negatif yüklü sialik asit homopolimerleri majör polisialilatlanmış molekülü (&gt;% 95) &#39;dir. Polysialic birn&gt; 10 ile cid PSA denir ama daha kısa oligomerik yapılar da biyolojik ilgili olduğunu mevcuttur. MSS ifade Diğer polisialilatlanmış proteinler SynCAM1 26, Nöropilin-2 (NRP-2) 27,28 ve bir sodyum kanal alt birimi 25 (inceleme için 29 bakınız). Burada tarif edilen yöntemler bağımsız antikorun izotipini (örneğin, IgG, IgM spesifik kappa (VK) hafif zincirler (insan antikorları ve fare antikorları için VκI hafif zincirler için VκI, VκIII ya VκIV hafif zincirleri) içeren insan ve fare immünoglobulin Antigen tanımlanmasına izin , IgA, IgD veya IgE). Bu sınırlama, IgM izo türü antikorların ile imüno-protein L agaroz kullanımına dayanmaktadır. Alternatif stratejiler Inc fazla IgM antikorları, bu yöntemin uygulanabilirliği genişletebilmemiz mannoz bağlayıcı lektinler kovalent boncuk agaroz ile bağlantılı sekonder IgG anti-IgM antikorları içerebilirlambda (λ) hafif zincirleri olan luding (tartışmaya bakınız). 1. 30: sağlıklı bireylerden elde edilen IgM λ hafif zincirlerin kıyasla sadece serum IgM VK hafif zincirlerinin oranı 1.5 bulunmaktadır. Ayırmak zenginleştirmek ve immünolojik belirli molekülleri 31 algılamak için buraya kullanılan kromatografik metodolojisine dayanan, tüm antijenler, en az bir küçük protein etki alanı dahil gerekmektedir. Antikorun spesifik bağlama epitopu içinde veya (glikoproteinler, lipoproteinler örneğin,) proteini etki alanı dışında olabilir. potansiyel aday listesini daraltmak için ilgili, HIgM12 için spesifik antijen tanımlamak için kullanılan ilk biyokimyasal adımlar, bu yöntemde en önemli adımlardır. Hücre tipi özel hazırlıklar ve hücre morfolojisi tabanlı karakterizasyonları glial hücreler için tarif edilmiştir ama bu metodoloji içinde veya MSS dışındaki diğer hücre tiplerini karşılamak için çıkarım olabilir. acil varAntikor hedefler karbonhidrat ya da lipit yapılardır terapötik özellikle durumlarda farklı insan bozukluklar için potansiyel (IgM antijenlerin çoğunluğu) ile IgM antikorlarının artan sayıda uygulanabilir, yeni ya da değiştirilmiş teknikleri geliştirmek gerekir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-013-CVRF</td><td>Yüksek glikoz, glutaminli, sodyum piruvatlı, 500 ml</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11330-032</td><td>500 ml, L-glutamin, sodyum piruvat, yüksek glikoz</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml, 100 ml</td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>B-27 Takviye Edici Gıda (50x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td>serum içermez, 10 ml</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sulama için steril su</td><td>Baxter Healthcare</td><td>#2F7114</td><td>USP-1.000 ml, 12/CA</td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür</td><td>Sigma</td><td>P7886-50MG</td><td>D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys ve orta nokta; xHBr, Moleküler Ağırlık 30.000-70.000 g/mol, 50 mg</td></tr><tr><td>sığır serum albümin fraksiyonu V</td><td>Sigma</td><td>A-3294-100G</td><td>ısı şoku fraksiyonu, proteaz içermez, pH 7,&nbsp; saflık %98, 100 g</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td>C6H12O6, Molekül Ağırlığı: 180.16 g / mol, ACS reaktifi, sığır</td></tr><tr><td>pankreasından</td> 500 g <td>Tripsin Sigma</td><td>T9935-100mg</td><td>esasen tuzsuz, liyofilize toz, sığır pankreasından 9.000 BAEE birim / mg protein</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td>Tip IV, liyofilize toz, 2.000 Kunitz birim / mg protein</td></tr><tr><td>Rekombinant Sıçan FGF temel Protein R</td><td>& D sistemleri</td><td>3339-FB-025</td><td>Taşıyıcı protein olarak BSA, 25 & # 181; g, liyofilize, > %95, 16.2 kDa</td></tr><tr><td>Rekombinant Sıçan PDGF-AA Protein</td><td>R& D sistemleri</td><td>1055-AA-50</td><td>taşıyıcısız, 50 & # 181; g, liyofilize, > %97, E. coli türevi, 12,5 kDa</td></tr><tr><td>Neurobazal-A</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10888-022</td><td>500 ml, Glutamin İçermez, Aspartik Asit Yok, Glutamik Asit Yok</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td>kristal, 1 kg, reaktif sınıfı, Molekül Ağırlığı 30.03 g/mol (monomer olarak)</td></tr><tr><td>Tris[hidroksimetil]aminometan (Tris bas</td><td>Biorad</td><td>#1610719</td><td>1 kg, %99,8 saf, toz</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td> <td>Biorad</td> <td># 1610302</td><td>1 kg, toz</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-381-5</td><td>C < alt > 2 < / alt >H < alt > 5 < / alt > NO < alt > 2 < / alt >, Molekül ağırlığı: 75.07 g / mol, Beyaz kristal Toz, 5 kg</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>NaCl, Molekül Ağırlığı: 58.44 g / mol, 5 kg</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>S0751-500G</td><td>NaH2PO4, Molekül Ağırlığı: 119,98 g/mol, 500 g</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Çözelti 1x (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-040-CV</td><td>Kalsiyum ve Magnezyum İçermez, 6 x 500 ml</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Tabağı</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>#353002</td><td>60 mm Hücre Kültürü Kabı, TC ile muamele edilmiş polistiren, 20/paket, steril</td></tr><tr><td>Falcon 60 mm x 15 mm Petri kabı</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td> <td># 351007</td><td>TC ile Muamele Edilmemiş Bakteriyolojik Petri Kabı, 20 / Paket</td></tr><tr><td>6 kuyucuklu hücre kültürü plakaları</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3516</td><td>6 kuyulu, düz tabanlı (Ayrı ayrı sarılmış), gama ışınlanmış, büyüme alanı 9.5 c</td></tr><tr><td>75 cm ve sup2; doku kültürü şişesi</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>430720U</td><td>75 cm&sup2; U-Şekilli Eğimli Boyun Hücre Kültürü Şişesi, Fiş Mühür Kapaklı</td></tr><tr><td>Pierce & trade; Protein L Plus Agaroz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#20520</td><td>2 ml, çapraz bağlı %6 boncuklu agaroz (CL-6B), bağlama kapasitesi: 10 ila 20 mg IgG</td></tr><tr><td>%4 - %20 Mini-PROTEAN TGX Prekast Jel</td><td>Biorad</td><td>456-1094</td><td>10 kuyulu, 50 & mikro; l, Mini-PROTEAN elektroforez hücreleri ile kullanım için</td></tr><tr><td>Immobilon-P Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF, 0.45 & m, 26,5 cm x 3,75 m rulo</td></tr><tr><td>Anti-Polisialik Asit-NCAM Antikoru, klon</td><td>Millipore</td><td>MAB5324</td><td>50 mikrolitre, Ev sahibi: fare, monoklonal IgM</td></tr><tr><td>4x Laemmli Numune Tamponu</td><td>Biorad</td><td>#1610747</td><td>10 ml, 4x önceden karıştırılmış protein numune tamponu</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>#1610710</td><td>25 ml, %98 saf, 14,2 M</td></tr><tr><td>Endoneuraminidase-N (Endo-N)</td><td>ABC Scientific</td><td>ABC0020</td><td>50 mikrolitre, 200 & g/ml, 3.500 U/mg</td></tr><tr><td>25 mm cam lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Daireler No. 1; Kalınlık: 0,13 ila 0,17 mm; Boyut: 25 mm</td></tr><tr><td>HEPES tampon çözeltisi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>100 ml, 1 M</td></tr><tr><td>Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi 1x (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-022-CV</td><td>500 ml, Kalsiyum, Magnezyum, Fenol içermez</td></tr><tr><td>Kırmızı Papain</td><td>Worthington Biyokimyasal İşbirliği</td><td>LS003119</td><td>liyofilize toz, 100 mg</td></tr><tr><td>Magnezyumsülfat</td><td>Sigma</td><td>M-2643-500G</td><td>toz, 500 g</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>#25030-081</td><td>100 ml, 200 mM&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kappa (vk) için antikor bağlama Özgünlük hafif zincir içeren İnsan (igm) antikorlar: polysialic asit (psa) bir vaka Çalışması olarak ncam bağlı

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

IgM izotipinin antikorları, insan deneylerinde, insan hastalıklarının hayvan modellerinde ve standart laboratuvar tekniklerinde tespit edici ajanlarda potansiyel terapötikler olarak genellikle ihmal edilir. Buna karşılık, birkaç insan IgM'si, kanser modellerinde ve multipl skleroz (MS) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) dahil olmak üzere CNS bozukluklarının modellerinde etkinlik kanıtı göstermiştir. Dikkate alınmamalarının nedenleri arasında IgM antikorlarının eksprese edilmesi, saflaştırılması ve stabilize edilmesindeki zorluklar, (protein olmayan) antijenlerin tanımlanmasındaki zorluklar, düşük afiniteli bağlanma ve karbonhidrat ve lipid araştırmalarındaki temel bilgi boşlukları yer almaktadır. 
Bu el yazması, Western blotting, immünopresipitasyon ve immünositokimya ile antijenleri tespit etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak için örnek olarak HIgM12'yi kullanır. HIgM12, nöral hücre adezyon molekülüne (NCAM) bağlı polisialik asidi (PSA) hedefler. Üç ana merkezi sinir sistemi (CNS) ek varyantı NCAM180, 140 ve 120'den yoksun vahşi tip (WT) ve NCAM nakavt (KO) farelerinden elde edilen erken doğum sonrası fare beyin dokusu, HIgM12'ye bağlanma için NCAM'in önemini değerlendirmek için kullanıldı. CNS dokusunun ve kültürlenmiş CNS hücrelerinin endonöraminidazlar kullanılarak daha fazla enzimatik sindirimi, PSA'yı HIgM12 için spesifik bağlanma epitopu olarak tanımlamamıza yol açtı.

Bu bölüm, CNS&#39;de insan IgM-spesifik PSA antijenler inceleyerek elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. biyokimyasal ortamlarda ve floresan immünsitokimya spesifik VK hafif zincirleri içeren insan IgM antikorlarının kullanılması gösterilmektedir. HIgM12 serebral beyin lizatları antijenine imüno ve Western lekeleri bir tespit maddesi (birincil antikor) gibi davranır. Ne izotop kontrol antikoru ne agaroz L boncuk aşağı çekme (Şekil 1) özgüllüğünü gösteren benzer bir antijen, immünopresipitasyon. VT ve NCAM KO farelerinden MSS lizatları kullanılarak Western blotlar PSA ihtiva eden NCAM (Şekil 2A) için HIgM12 bağlayıcı özgünlüğünü göstermektedir. Endo-NF kullanılarak WT farelerin merkezi sinir sistemi dokusu enzimatik sindirimi HIgM12 için spesifik bağlama epitopu (Şekil 2B olarak NCAM bağlı PSA tanımlar). Bu tarifnamede belirtilen yöntemi kullanarak, yüksek saflıkta IBA-1-pozitif fare mikroglial kültürleri (Şekil 3) elde edilir. Ticari olarak temin edilebilen anti-PSA antikoru (klon 2-2B) sabit hücre yüzeyi ya da iç PSA havuzları etiket ve floresan mikroskopisi ile IBA-1 pozitif mikroglial hücreler permeabilize değildir. HIgM12 saflaştırılmış sıçan mikroglia hücre yüzey antijenleri etiket yok mikroglia 16,41 PSA-NCAM hiçbir hücre yüzey ifadesi raporları önceden yayınlanmış literatürde, tutarlı. İlginç bir şekilde, özel organel (Şekil 3) ile sınırlı olmayan bir hücre içi bölgesi, sabit ve permeabilize mikroglia sonuçları, perinükleer örüntüsü HIgM12 markalama. Sonuçlar Golgi 41 seviyesinde mikroglia PSA SynCAM hedefleyen anti-PSA IgG antikoru (klon 735) 26, kullanılarak elde edilen ters düşer. mikroglia aksine, HIgM12ve canlı hücre koşulları (Şekil 4) karşı oldukça Zenginleştirilmiş Sıçan OPC kültürlerinde A2B5 hedef hücre yüzey antijenleri. OPC kültürleri mikroglial hücreleri kirletici ~% 5 ihtiva eder. 5 GFAP-pozitif astrositler HIgM12 ve anti-PSA mAb (klon 2-2B) arasında bir hemen hemen aynı hücre yüzeyi boyama desen (Şekil 5A) göstermektedir Şekil. Endo-NF-sindirilmiş WT astrositlerin immünofloresan markalama HIgM12 astrositik PSA (Şekil 5B) varlığını gösterir kullanılarak kontrol ile muamele edilmiş WT astrositler tampon ile karşılaştırıldığında. In vivo olarak, PSA-pozitif astrositler mevcudiyeti, yine de teyit edilmesi gerekir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig1.jpg" /> Şekil 1:. HIgM12 bir HIgM12 kullanarak üç aylık farelerin toplam beyin lizattan imüno asyonlar Ajan &quot;aşağı çekme&quot;, insan izotip kontrol HIGM gibi davranırSadece &quot;aşağı çekme&quot; ajan olarak 126 veya agaroz L boncuk. Ayrıştırılan proteinler HIgM12 karşı problanmış membranlı Western lekeleme ile çalıştırılmıştır. (- 73 kDa ~ 65) IGMS ağır zincir ilave olarak 200 kDa - HIgM12 kaplı boncuklar elüt proteinlerin molekül ağırlıkları 160 aralığında idi. Bu rakam J. modifiye edilmiş Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54139/54139fig2.jpg" /> Şekil 2: HIgM12 Polysialic Asit (PSA) NCAM üzerinde Parçası Hedefler. P7, P13, P16 ve P27 NCAM A. Beyin homojenatlarında KO fareler ve heterozigot yavru kontrolleri HIgM12, PSA ve p-aktin yükleme kontrolü olarak karşı probed membran ile Western lekeleri çalıştırıldı toplam. <stronPBS içinde% 1 NP40 yetişkin WT fare beyin lizatının g&gt; B. 10 ug, pH 6.5 ile muamele edilmiştir endoneuraminidase N (endo-H) (ekzo) α2-3 polysialic asit polimeri özgüllük (siyalidaz) ile nöraminidaz veya PBS gece boyunca 37 ºC, Western lekeleme çiftli olarak çalıştırın ve yükleme kontrolü olarak HIgM12, PSA ve β-aktin karşı probed. Bu rakam J. modifiye edilmiş Neurochem. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54139/54139fig3.jpg" /> Şekil 3:. Sıçan mikroglia üzerinde PSA yokluğu Sıçan mikroglia poli-D-lizin kaplı cam lamelleri 48 saat süreyle kültüre edildi HIgM12 Etiketleme bir eksikliği ile Aynalı ve ya HIgM12 veya HIgM12 veya anti-ile tespit sonrasında buz üzerinde canlı olarak etiketlenmiş -PSA mAb (klon 2-2B). Hücreler, T idiRiple mikroglia işaretleyici IBA-1 (yeşil), HIgM12 / PSA (kırmızı) ve DAPI (mavi) ile etiketlenmiş. Görüntüler mikroglial hücre HIgM12 (üst sıra) kullanarak bağlama yüzeyi ve anti-PSA eksikliği primer sıçan mikroglia (alt satırdaki) hücre yüzeyinde ve iç mağazalara (klon 2-2B) bağlanma eksikliği göstermektedir. Bipolar morfolojisi ve IBA-1 boyanma olmaması dayanarak, küçük PSA-pozitif hücre (alt sıra) OPC olduğu öne sürüldü. Sabit hücrelerde, HIgM12 boyama özel organellere sınırlı değildi ve non-spesifik bağlayıcı (orta sıra) kabul edildi noktalı, perinükleer desen sonuçlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54139/54139fig4.jpg" /> Şekil 4: HIgM12 Rat OPC Hücre Yüzey PSA-NCAM Hedefler Rat OPC ve mikroglia cultu vardı.HIgM12 ya A2B5 (yeşil), iç makrofaj / monosit işaretleme CD68 ile buz canlı etiketli poli-D-lisin kaplamalı cam lamel ve üç ile ilgili çoğalma ortamı içinde 4 gün boyunca, kırmızı (klon ED-1) (kırmızı) ve DAPI (mavi) . Görüntüler OPC işaretleyici A2B5 (üst sıra) ve birkaç CD68-pozitif mikroglia ile HIgM12 (alt sıra) (~% 5) için hücre popülasyonları majorly olumlu göstermektedir. Faz kontrast ve DAPI görüntüleri her nüfus için hücre bütünlüğü ve hücre sayıları ortaya çıkarmak için ilave edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54139/54139fig5.jpg" /> Şekil 5: HIgM12 ve anti-PSA mAb Fare Karışık Glia bir Astrositik ICSI&#39;nin ko-etiket. WT ve NCAM A. Fare karışık glial hücreler astrositler, oligodendrosit-soy hücreleri ve microg içeren KO hayvanlar toplamlia 3 gün kültürlendi ve HIgM12 (yeşil), anti-PSA mAb (klon 2-2B) (kırmızı) ve daha sonra astrositik markör GFAP (mor) ve DAPI (mavi) ile buz üzerinde canlı etiketli. HIgM12 ve anti-PSA GFAP-pozitif WT astrositler üzerinde sanal özdeş boyanma paterni ortaya ama NCAM KO farelerden elde kültürlü astrositler bağlama yoksundur. Bu rakam J. modifiye edilmiş A. altında açıklanan ve (nazik Dr Martina Muehlenhoff tarafından sağlanan) endoneuraminidase-NF veya PBS kontrolü ile gecede tedavi olarak Neurochem. 15. B. Karışık glia aynı kültüre edildi. Hücreler HIgM12 (yeşil) ve daha sonra, iç belirteçler GFAP (kırmızı) ve DAPI (mavi) boyanmış buz canlı etiketlenmiştir. HIgM12 PBS-kumanda üzerindeki hücre yüzey antijenleri karışık glial kültürlerin tedavi değil endoneuraminidase-NF karışık glia tedavi hedefliyor. Bu rakam JNSCI 16 modifiye edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/54139fig5large.jpg" target="_blank">Pl</a>kolaylık, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Tüm resimler aynı enstrüman ayarları kullanılarak 60X büyütmede çekilen ve aynı işlendi. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54139/54139table1.jpg" /> Tablo 1:. Tampon ve Çözüm Tarifler <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54139/Table1.xls">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> CNS dokusu </td><td> Endo-UF / PBS </td><td> liziz tamponu </td><td> Toplam ses </td></tr><tr><td> 1. WT fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) endo-NF </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 2. WT fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> 2 ul PBS </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 3. WT fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> Resim PBS veya endo-NF </td><td> 9.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 4. NCAM KO fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> 2 ul (12 ug) endo-NF </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 5. NCAM KO fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> 2 ul PBS </td><td> 7.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 6. NCAM KO fare </td><td> 67 ug (0.45 ul) </td><td> Resim PBS veya endo-NF </td><td> 9.55 ul </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: P7 WT ve NCAM KO farelerin MSS dokusunun ENDO-NF sindirim.

Spesifik kappa (Vκ) hafif zincirlerine sahip insan ve fare IgM antikorları için antijen içeren protein kısımlarını tanımlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol IgM sınıfı antikorlarla sınırlı değildir, ancak immünopresipitasyonlar sırasında antijenlerini yeterince yüksek afinite ile hedefleyen tüm immünoglobulin izotipleri için geçerlidir.

Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Bu prosedürün genel amacı, IgM izotipine odaklanarak terapötik potansiyele sahip antikorlar için antijenleri belirlemektir. Bu yöntem, biyomedikal alandaki bir bilgi boşluğunu doldurmakta olup kanser araştırmaları ve merkezi sinir sistemi hastalıkları için yeni biyobelirteçlerin ve immünoterapötik ajanların tanımlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, büyük terapötik potansiyele sahip ancak ihmal edilmiş bir antikor sınıfına kapı açmasıdır.Bu tekniğin etkileri, antikor bazlı terapötiklerle hedeflenebilen tüm hastalıkların teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, IgM antikorlarının antijenleri ile büyüyen dokular ve alt kültürler hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca, tüm türlerden diğer antikor izotipleri için de uygulanabilir.Bu yöntemle ilgili fikri ilk kez, farklı biyokimyasal uygulamalarda IgM antikorunun spesifik ve belirgin bağlanmasını fark ettiğimde edindim. Prosedürü Robert Kahoud ve Jens Watzlawik uygulamalı olarak gösterecekler. Bu prosedüre başlamak için, kafatasının ön tarafına doğru kulak hizasından bir kesi yapın ve kafatasını geriye doğru soyun.Ardından beyni nazikçe 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve hemen kuru buz üzerinde saklayın. Beş dakika sonra beyni temiz bir tartım kağıdına aktarın ve temiz bir jilet kullanarak serebellum ve beyin sapını hızla çıkarın. Sonra, donmuş serebrumu buz üzerindeki 15 mililitrelik tüpe geri aktarmadan önce tartın.Lizis tamponu başına 150 mikrogram beyin dokusu olacak nihai konsantrasyona ulaşana kadar buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin. Ardından, önce bir mililitrelik pipet ucuyla ardından 27 gauge iğne takılmış beş mililitrelik bir şırınga ile tritürasyon uygulayarak beyni lizis tamponu içinde homojenize edin. Daha sonra, doku lizisinin tamamen gerçekleşmesi için beyin lizatını buz üzerinde 30 dakika daha inkübe edin.30 dakika sonra, deterjanı, çözünmeyen materyalleri ve beyin lipidlerini uzaklaştırmak için ardışık santrifügasyon uygulayın. Miyelin ve hücre kalıntılarını içeren peleti atın, ancak her santrifügasyon adımından sonra süpernatantı saklayın. Beyin lizatını alikotlara ayırın ve 80 °C'de saklayın.Bu adımda, BSA içeren 200 mililitre IP Tamponu ve BSA içermeyen başka bir 200 mililitre IP Tamponu hazırlayın. İmmünopresipitasyon reaksiyonu için, 100 mikrolitre Protein L agaroz süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe bir mililitre BSA içeren IP tamponu ekleyin.Ardından, tersyüz ederek manuel olarak karıştırın. Daha sonra, Protein L agaroz boncuklarını santrifüjleme yoluyla dört kez yıkayın. Bundan sonra, agaroz peletini bozmadan süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama prosedürünü üç kez daha tekrarlayın.Ardından, Protein L agarozuna IP tamponu içeren taze BSA ekleyin ve 4 °C'de bir rotor üzerinde gece boyunca inkübe edin. BSA içeren 800 µL IP tamponu ve 30 mg lizlenmiş beyin dokusuna 20 µg deneysel antikor, kontrol antikoru veya PBS ekleyin. 30 mg lizlenmiş beyin dokusunu, IgM antikoru ile birlikte buz soğukluğundaki IP tamponunda, 1,5 mm'lik bir mikro santrifüj tüpünde 4 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, Protein L agaroz boncuklarını masaüstü santrifüjle çöktürün. Agaroz peletini bozmadan süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, soğutulmuş antikor beyin lizat çözeltisini Protein L agarozuna ekleyin.Antikor antijenini, Protein L agaroz süspansiyonu ile birlikte bir döner karıştırıcıda, dört derece santigrat sıcaklıkta iki saat boyunca inkübe edin. İki saatin ardından, agaroz L'ye tutunmuş antikor antijen kompleksini santrifüjleme yoluyla yıkayın. Peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve üzerine %0,2 BSA içeren bir mililitre buz gibi soğuk IP tamponu ekleyin.%0,2 BSA içeren buz gibi soğuk IP tamponu ile yıkama adımını bir kez daha, ardından BSA içermeyen buz gibi soğuk IP tamponu ile iki kez daha tekrarlayın. Bundan sonra, agaroz L'ye bağlı antikor antijen kompleksini santrifüjle çöktürün. Protein L agaroz peletinin üzerinde yaklaşık 50 µL çözelti kalana kadar süpernatantı uzaklaştırmak için 200 µL'lik bir pipet kullanın. Ardından, kalan kısmı tamamen temizlemek için 10 µL'lik bir pipet kullanın.Tüm örnekleri buz üzerinde tutun. Ardından, her bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 40 µL IP elüsyon tamponu ekleyin. Tüpleri parmaklarınızla altı kez tıklatarak karıştırın ve 95 °C'de beş dakika boyunca ısıtın.Ardından, örneği iki dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, pellete dokunmadan süpernatantın 35 µL'sini yeni bir 1.5 mm mikrocentrifüj tüpüne aktarın. Son olarak, tüpün iç çeperinden küçük bir miktar seyreltilmiş örneği durulayarak Protein L agaroz boncuklarının bulunmadığını doğrulayın.Protein L agaroz boncuklar mevcutsa, örneği 13,000 ×g'de 30 saniye daha santrifüjleyin ve süpernatanı temiz bir tüpe aktarın. Agaroz boncuklar tespit edilemeyene kadar bu adımı tekrarlayın. Ardından, seyreltilmiş örneklerden kuyu başına 10-20 µL'yi bir SDS poliakrilamid jele ve tris-glisin SDS tampon sistemine yükleyin ve jeli ek soğutma yapmadan tezgah üzerinde yaklaşık bir saat boyunca 100 V'da çalıştırın.Ardından, proteinleri bir PVDF membrana aktarın. Proteinler, soğuk transfer tamponu kullanılarak soğuk odada 100 volt ile iki buçuk saat boyunca aktarılır. Membranı, PBS-T içinde ağırlıkça hacimce %10 kuru süt tozu ile 25 °C'de, masaüstü orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca bloke edin.PBS-T ile her seferinde 10 dakika olmak üzere iki kez yıkayın. Membranı, %5 BSA içeren PBS-T içindeki primer antikor ile inkübe edin. Soğuk odada, orbital sarsıcılıda gece boyunca inkübe edin.Ertesi sabah, membranı 25 °C'de bir kez fazla miktarda PBS-T ile yıkayın ve ardından orbital sarsıcıda her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez PBS-T ile yıkayın. Sonra, membrana sekonder antikoru ve PBS-T içinde %5 kuru süt tozunu ekleyin ve orbital sarsıcıda 25 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bundan sonra, membranı 25 °C'de bir kez fazla miktarda PBS-T ile yıkayın ve ardından orbital sarsıcıda her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez PBS-T ile yıkayın.Soğutulmuş geliştirilmiş kemilüminesans HRP substrat bileşeni A'nın bir mililitresini, 25 °C'de bileşen B'nin bir mililitresi ile karıştırın. Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için membranı bir kağıt havlu üzerine aktarın. Ardından, membranı tekrar içine yerleştirmeden önce kabı kağıt havluyla kurulayın.Hemen ardından, önceden karıştırılmış geliştirilmiş kemilüminesans HRP substratının iki mililitresini membrana ekleyin ve 25 °C'de iki dakika boyunca inkübe edin. Membranı tekdüze şekilde nemlendirmek için kabı her 20 saniyede bir elinizle eğerek sallayın. Ardından, membranı şeffaf bir plastik kılıfa aktarın ve fazla sıvıyı ve hava kabarcıklarını kağıt havluyla temizleyin.Plastik kılıfı kasete bantlayın ve kapatın. Bu şekil, HigM12'nin serebral beyin lizatlarından antijenini immünopresipite ettiğini ve Western blot analizlerinde bir tespit ajanı olarak görev yaptığını göstermektedir. Ne izotip kontrol antikoru ne de agaroz L boncukları benzer bir antijeni immünopresipite etmemekte olup, bu durum pull down işleminin özgünlüğünü kanıtlamaktadır.Burada, vahşi tip ve NCAM nakavt farelerden elde edilen CNS lizatları kullanılarak yapılan Western blotlar, HIgM bağlanmasının PSA içeren NCAM'a özgüllüğünü kanıtlamaktadır. Vahşi tip farelerin CNS dokusunun ENDO-NF kullanılarak enzimatik sindirimi, NCAM'a bağlı PSA'nın HIgM12 için spesifik bağlanma epitopu olduğunu belirlemektedir. Burada özetlenen yöntem kullanılarak, yüksek saflıkta IBA-1 pozitif sıçan mikroglial kültürleri elde edilmiştir. Mikrogliaların aksine, canlı hücre koşulları altındaki sıçan OPC kültürlerinde HIgM12 ve A2B5 hedef hücre yüzeyi antijenleri oldukça zenginleşmiştir.Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem 13 çalışma saati içerisinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, antikorların bağlanma afinitelerini, asosiyasyon ve disosiyasyon sabitlerini belirlemek için Biacore veya yüzey plazmon rezonans teknolojisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; kanser araştırmaları, immünoterapiler ve doğal otoantikorlar alanındaki araştırmacıların, insanlardaki terapötik IgM antikorları için antijen olarak proteinler üzerindeki karbonhidrat epitoplarını tanımlamasına olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, insan IgM antikorlarını içeren araştırma çalışmaları için glikoprotein antijenlerinin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir. Elde edilen veriler, MS tedavisi için yeni bir hedef sunmaktadır. Geliştirdiğimiz antikor tedavisi PSA ENCAP, Multiple Sclerosis'e benzer hastalıkları ve bu hastalıkların ilerlemesini değerlendiren titiz bir model kullanılarak aktivite kutusunda fonksiyonel iyileşme gösteren ilk tedavilerden biridir.

antibody-binding-specificity-for-kappa-v-light-chain-containing-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bu protokol, deniz memelilerinin miyoglobine güçlü bir şekilde reaktif olan iki IgG sınıfı monoklonal antikorun (mAb) gelişimini açıklar. Bu mAb'ler, deniz memelilerinin Mb'sini fok ve diğer hayvanlardan ayırt etmek için sandviç formatına dayalı bir kolloidal altın immünokromatografik test şeridi üzerine uygulanır.

Deniz Memelileri Miyoglobin Tespiti için bir Kolloidal Altın merkezli İmmunokromatografik Testi Strip Gelişimi

Burada yazarlar, saflaştırılmış bir monoklonal antikor ve nokta-leke hibridizasyonulama yoluyla peptit taraması kullanarak doğrusal bir antijenik epitop tanımlamak için basit ve verimli bir protokol sunmaktadır. Tanımlanan epitop daha sonra terapötik ve tanısal uygulamalarda kullanılabilir.

Peptid, bir monoklonal antikor tarafından tanınan lineer B-hücresi epitopunun belirlenmesi: Tarama destekli

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

Burada, içinde bispecific antikor GPC3-S-Fab üretmek için bir protokol mevcut Escherichia coli. Saf GPC3-S-Fab güçlü sitotoksisite karşı GPC3 pozitif karaciğer kanseri hücreleri vardır.

GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite

Biz glikoproteinlerin biyofiziksel ve yapısal karakterizasyonu için yaklaşımlar ile immünglobulin kat biolayer Interferometry, izotermal titrasyon Kalorimetre ve x-ışını kristalografisi tarafından mevcut.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

BSelex yöntemi tanımlamak ve insan periferik kan mononükleer hücrelerden bireysel antijen özgü antikorlar kurtarmak için tek hücreli PCR ve klonlama ile akış sitometri birleştirir.

Zenginleştirilmiş İnsan Hafızası B Hücre Popülasyonlarından İstenilen Özgülliklerle Antikorların Seçimi ve Geri Kazanımı İçin Tek Hücreli Tarama Yöntemi

Genetik kod genişlemesi, tanımlanmış bir bölgede taşıyıcı protein üzerinde biyortgonal fonksiyonel bir grup taşıyan doğal olmayan bir amino asitin getirilmesi için uygulanır. Biorthogonal fonksiyon daha homojen bir glikokonjugate aşısı sağlamak için bir karbonhidrat antijen site seçici kaplin için kullanılır.

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

Burada, radyoaktif işaretli antikorların immobilize antijenlere bağlanma afinitesini (KD) belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. KD , radyoaktif etiketli bir antikorun antijenine çeşitli konsantrasyonlarda toplam, spesifik ve spesifik olmayan bağlanmasını ölçerek bir doygunluk bağlama deneyinden belirlenebilen denge ayrışma sabitidir.

Radyoaktif Etiketli Antikorların İmmobilize Antijenlere Bağlanma Afinitesinin (KD) Belirlenmesi

Bu protokol, plazma zarı proteinlerinin nano ölçekli mekânsal organizasyonunu çözmek için tek antikor etiketlemesini (SAL) tanımlar. Tek molekül düzeyinde kümülatif antikor-epitop etkileşimlerini kullanarak, membran SAL (mSAL), yerel epitop dağılımlarını haritalandırırken aynı zamanda doğal hücresel ortamda antikor bağlanma davranışını yakalar.

Tek Antikor Etiketleme Kullanarak Zar Proteinlerinin Tek Moleküllü Lokalizasyon Mikroskopisi

Öğrenin, IgM antikorları için antijenleri immünopresipitasyon ve Western blot yöntemleriyle belirlemeyi. Bu teknik, kanser ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında yeni biyobelirteçler ve immünoterapötik ajanlar keşfetmeye yardımcı olur.

Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı (Video) | JoVE Journal

Kappa (VK) için Antikor Bağlama Özgünlük Hafif Zincir içeren İnsan (IgM) Antikorlar: Polysialic Asit (PSA) bir Vaka Çalışması olarak NCAM Bağlı

Daha fazla video keşfet