Basit ve Etkin Yaklaşım Mutant Vaccinia Virüs Vektörler Construct

Bu deneyin genel amacı, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak mutant vaccinia virüsü üretiminin verimliliğini artırmaktır. Bu yöntem, biyolojik araştırmalar ve tıbbi araştırmalar için, özellikle gen terapisi ve aşılama için yeni aşı virüsü vektörlerinin oluşturulmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemle viral gösterim kritiktir, çünkü pozitif plakların tanımlanması ve toplanması zordur.

Bu tekniğin temel avantajı, mutantımızı vaccinia virüsü haline getirmedeki verimliliği önemli ölçüde artırmasıdır. Hasat edilmiş CV-1 hücrelerinden başlayarak, konsantrasyonlarını mililitre başına 100.000 hücreye ayarlayın. Daha sonra, transfeksiyon için altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna iki mililitre süspansiyon tohumlayın.

Ertesi gün, hücreleri 0.5 nanogram gRNA-N2 plazmid ve 0.5 nanogram pSTCas9 plazmidi ile transfekte edin. Sonra onları 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra ortamı değiştirin.

Ardından, VVL15 virüsünü hazırlayın. Omurga VVL15 virüsünü DMEM ile mililitre başına 200.000 PFU'ya seyreltin. Daha sonra, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinin her bir oyuğuna 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs ekleyin.

İki saat sonra, HR ekspresyonu için hücreleri mekik donör vektörünün bir mikrogramı ile transfekte edin ve hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, bir hücre kazıyıcı kullanarak transfekte edilmiş CV-1 hücrelerini ayırın. Daha sonra hücre süspansiyonunu bir kriyoviyal içine toplayın ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Modifiye edilmiş VV'nin saflaştırılmasının ilk turuna başlamak için, oyuk başına 300.000 modifiye edilmemiş CV-1 hücresi ile 15 altı oyuklu plakayı tohumlayın. Ertesi gün, transfekte edilmiş CV-1 hücrelerinin donmuş süspansiyonunu üç dakika boyunca 37 santigrat derecede çözün ve daha sonra hücreleri parçalamak için süspansiyonu 30 saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra lizatın bir mikrolitresini üç mililitre DMEM ile seyreltin.

Bu seyreltmenin yarım mililitresini, değiştirilmemiş CV-1 hücrelerinin her bir plaka kuyusuna ekleyin. Ardından plakaları iki gün boyunca inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak RFP pozitif plakları tanımlayın.

10X'lik bir hedefle tespit edilebilirler. Tanımlandıkları gibi, bir işaretleyici kalem kullanarak plakanın altındaki plakaları doğru bir şekilde etiketleyin. Şimdi hasat edilecek her pozitif plak için 200 mikrolitre serumsuz DMEM içeren bir kriyovial hazırlayın.

Daha sonra, tüm ortamı etiketli plaklarla kuyulardan aspire etmek önemlidir. Daha sonra, 30 mikrolitreyi aspire etmek için 200 mikrolitrelik bir pipet seti kullanarak, pipeti kriyoviyalden 10 mikrolitre ortamla kısmen yükleyin ve ardından plakayı kazıyın ve kalan aspirasyonla hücreleri çekin. Bunu kriyoviyal içine çıkarın ve mümkün olduğunca çok hücre toplamak için aynı RFP pozitif plağı hedefleyerek bu prosedürü iki kez daha tekrarlayın.

Koleksiyonları eksi 80 santigrat derecede saklayın veya ikinci saflaştırma turu hemen yapılacaksa, kriyoviyalleri kuru buz üzerinde 10 dakika dondurun. Modifiye edilmiş VV'nin saflaştırılmasının ikinci turu, ilk turdaki donmuş hücreler kullanılarak tıpkı birincisi gibi gerçekleştirilir. Bununla birlikte, her RFP pozitif hat için altıdan fazla RFP pozitif plak seçilebilir.

Bir pozitif plaktan oluşturulan tüm plaklar RFP pozitif olana kadar seçim işlemini tekrarlayın, bu da plağın saf olduğunu gösterir, bu da üç ila beş tur daha sürebilir. Bir gün önceden, oyuk başına yarım milyon CV-1 hücresi içeren altı duvarlı bir plaka hazırlayın. Ertesi gün, donmuş saflaştırılmış plağı 37 santigrat derecede üç dakika boyunca çözdürün.

Daha sonra bir lizat yapmak için plağı 30 saniye kuvvetlice girdaplayın. Hücre kalıntıları da dahil olmak üzere tüm lizatı bir CV-1 hücresi kuyusuna ekleyin ve plakayı üç gün boyunca inkübe edin. Diğer beş kuyuyu kullanmayın.

Hücreleri günlük olarak mikroskop altında inceleyin. Hücrelerin yarısından fazlası sitopatik göründüğünde, enfekte olmuş hücreleri toplayın. İdeal olarak tüm hücreler sitopatik olmalıdır.

Hücreleri kültür ortamı ile 15 mililitrelik bir tüpte toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Daha sonra hücreleri üç dakika boyunca 300 g'da pellet yapın. Süpernatanı atın ve mutant VV'nin modifikasyonunu doğrulamak için PCR kullanmaya devam edin veya daha sonra yapmak için hücre peletini eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Açıklanan yöntem, geleneksel protokollere kıyasla rekombinasyon verimliliğini 100 kattan fazla artırır. Örneğin, VV N1LG'nin modifikasyonu hedeflendi. Tarif edildiği gibi, Cas9'u eksprese eden plazmalar ve N1L'ye özgü bir gRNA, homolog rekombinasyon için verimliliklerini arttırmak için CV-1 hücrelerine birlikte transfekte edildi.

Transfeksiyondan bir gün sonra, RFP CV-1 hücrelerinde eksprese edildi. Daha sonra, CV-1 hücreleri homolog rekombinasyondan tüm lizat ile enfekte edildi. CV-1 hücrelerinde RFP pozitif ve negatif plakların her ikisi de gözlendi.

Saflaştırma protokolünü takiben, saf bir rekombinant elde edildi. Mutant vaccinia virüsü ile saf bir plaktan türetilen hücre lizatı ile enfeksiyondan sonraki tüm plaklar bir RFP sinyali sundu. Hedeflenen genin delesyonunu doğrulamak için PCR kullanıldı.

Modifiye edilmiş virüs, RFP için pozitif bir sinyal gösterdi ve sağlam N1L kontrolünün aksine N1L için sinyal göstermedi. Hepsi hedeflenmemiş gen A52R için pozitifti. Bu videoyu izledikten sonra, yeni bir vaccinia virüsü vektörünün nasıl hızlı bir şekilde oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 10 gün içinde yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyomedikal bilimler alanındaki araştırmacıların, kanser ve bulaşıcı hastalıkların tedavisi ve önlenmesi için biyolojik ajanların geliştirilmesinde yeni viral vektörleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.