Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Bu yeni hücre kültürü yönteminin genel amacı, daha yüksek verimlilikle farklılaşmış yağ hücreleri üretmektir. Yöntemimiz, rejeneratif tıp alanında çalışan araştırmacıların adipojenik, osteojenik ve kondrojenik hücrelerin üretilmesinde yer alan çeşitli süreçler hakkındaki temel soruları yanıtlamalarına yardımcı olabilir. Hücre kültürü protokolümüzün birincil avantajı DEFAT hücrelerinin kalitesini arttırması olduğundan, yakın gelecekte hücre tedavisi ve doku mühendisliğindeki mevcut uygulamaları geliştirmek için uygulanabilir.

Hastanın deri altı yağ örneğini ameliyathaneden laboratuvara getirdikten sonra, dokuyu tartın ve bir ila iki gram yağ dokusu örneğini 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra numuneyi beş mililitre PBS ile yıkayın ve ardından numuneyi 10 santimetrelik plastik bir kaba aktarın. PBS'yi çıkarın.

Daha sonra numuneyi içeren tabağa hacim başına 10 mililitre steril %0.1 ağırlıkça kolajenaz ekleyin. Ardından, dokuyu püre haline gelene kadar kıymak için cerrahi makas kullanın. Kıyılmış dokuyu ve kollajenaz çözeltisini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 60 RPM'de çalkalayarak sindirin.

Sindirimin ardından, sindirilmiş numuneyi 100 mikronluk bir filtreden geçirerek 15 mililitrelik yeni bir tüpe süzün. Ardından, %2 FBS ile takviye edilmiş 10 mililitre DEFAT kültür ortamını filtreden geçirin. Yağ hücrelerini hücre süspansiyonundan izole etmek için, önce filtrelenmiş hücreleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 100 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında, 15 mililitrelik bir tüpte% 2 FBS ile desteklenmiş beş mililitre DCM hazırlayın. Daha sonra, santrifüjlenmiş tüpten yüzen yağ hücrelerini çekmek için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve hücreleri ortam içeren 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin. DCM ortamını hücrelerle karıştırmak için tüpü hafifçe sallayın.

Ardından, tüpü oda sıcaklığında bir dakika boyunca 100 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpün altındaki ortamı çıkarmak için 18 gauge iğne ve 20 mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra hücrelere %2 FBS takviyeli 10 mililitre DCM ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak karıştırın.

Hücreleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 100 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Kaplamaya başlamak için, 12,5 santimetrelik bir şişeye% 20 FBS ile desteklenmiş 41 mililitre DCM veya DMEM ekleyin. Daha sonra 40 mikrolitre yağ hücresi çekmek için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve bunları şişeye ekleyin.

Daha sonra şişeyi% 20 FBS ile desteklenmiş DCM veya DMEM ile doldurun. Hücrelerin ortama yayılması çok önemlidir. Şişeyi düz tutmak için yuvarlak bir Petri kabının kapağına yerleştirin.

Son olarak, şişeyi %5 karbondioksit ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörün içine yerleştirin ve yedi gün boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Bir haftalık inkübasyondan sonra, şişeyi ters çevirin ve farklılaşmış yağ hücrelerini kontrol edin. Ardından, ortamı aspire edin ve ardından şişeye% 20 FBS ile desteklenmiş beş mililitre DCM veya DMEM ekleyin.

Ortamı değiştirdikten sonra DEFAT hücrelerinin bir hafta daha büyümesine izin verin. Bir hafta sonra, çeşitli hücre kültürü koşulları altında üretilen DEFAT hücrelerinin sayısını saymak için bir hücre sayacı kullanın. Bu görüntü, DMEM'de 14 günlük kültürü takiben DEFAT hücre kolonilerini göstermektedir.

Burada DEFAT hücreleri, DCM'de 14 günlük kültürden sonra gösterilir. Her durumda, ölçek çubuğu 200 mikronu temsil eder. DEFAT hücre proliferasyonu, bir hücre sayacı kullanılarak ölçüldü ve DCM ve DMEM'in DEFAT hücreleri oluşturmadaki etkinliği karşılaştırıldı.

Burada görüldüğü gibi, DCM kullanımı ile gelişmiş hücre proliferasyonu gözlenir. Burada, DCM kullanılarak üretilen insan DEFAT hücreleri, DEFAT hücrelerinin yeniden farklılaşma ve farklılaşma yeteneklerini değerlendirmek için uygun indüksiyon ortamında üç hafta boyunca kültürlendi. Hücreler, alkalen fosfataz boyası ve Alizarin Red S ile boyanarak osteojenik kapasite için pozitifti. Son olarak, adipojenik kapasite bir Yağ Kırmızısı O boyası ile gösterildi.

Yüksek kaliteli DEFAT hücrelerini başarılı bir şekilde oluşturmak için temel kollajenaz ve yağ hücresi izolasyonunun her ikisinin de azami özenle gerçekleştirilmesini sağlamak oldukça önemlidir. Bu çabalar sayesinde, doğrulanmış hücre kültürü yöntemimiz, gelişim biyolojisi ve rejeneratif tıp alanlarında hem mevcut hem de gelecekteki araştırma çabalarını kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.