Name: Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Keşfedin sentetik kimyasal dönüştürücülerle proteinler arası yapay sinyal iletimini. Bu yöntem, PDGF aptameri ve GST inhibitörü kullanarak yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Minerva Vakfı, HFSP Örgütü ve Avrupa Araştırma Konseyi Grant tarafından desteklenmiştir (Grant 338265 Başlangıç).

&#39;Kimyasal Transducer&#39; 1. Sentezi <ol><li> ön hazırlıklar <ol><li> ultra saf su 114 ml asetik asit ve 400 ml trietilamin 278 ml karıştırılarak 2M trietilamonyum asetat (TEAA) tamponu hazırlayın. karanlık şişe tutun 7 pH ayarlamak ve 1 L&#39;lik bir son hacme su ilave edilir. Not: Bu çözelti, yıl stabildir. </li><li> ultra saf su, 20 ml, askorbik asit, 18 mg eritilmesi ile 5 mM askorbik asit çözeltisi hazırlayın. taze bir çözüm kullanın; Çözelti bir gün için stabildir. </li><li> 11 ml dimetil sülfoksit (DMSO) içinde TBTA 10, aşırı saf su ile yıkanır ve 58 mg bakır (II) sülfat pentahidrat 25 mg çözülmesiyle 10 mM Cu (II) / tris (benzyltriazolylmethyl) amin (TBTA) çözeltisi hazırlayın. İki çözüm karıştırın. Oda sıcaklığında tutun ve ışıktan korumak. </li></ol></li><li> birleşme prosedürü <ol><li> 80 ul değiştirilmiş oligonükleotid, 100 nmol (ODN-1) çözündürüntaze ultra-saf su. pH = 7, askorbik asit (su içinde 5 mM) yeni hazırlanmış bir çözeltiye 80 ul ekle 2 M TEAA 20 ul ekle. </li><li> DMSO, 180 ul azido-değiştirilmiş etakrinik asit, 1.5 umol (574,5 ug) çözülür ve solüsyona ekleyin. Cu (ll) / TBTA çözeltisi (% 55, 10 mM (h / h) DMSO / su) 40 ul hızla 60 saniye boyunca argon ile ve çözelti gaz çıkışına. </li><li> sıkıca kapatın, Argon ile tekrar temizleyin ve bir gece boyunca karıştırın. </li><li> (Mobil faz A) reaksiyonun ilerlemesini izlemek ve RP-HPLC ile saflaştırılması konjügat,% 5 asetonitril,% 5 TEAA,% 90 saf su; B)% 65 asetonitril,% 5 TEAA,% 30 saf su). 24 </li></ol></li></ol> 2. PDGF tarafından GST Etkinliği Kontrol <ol><li> ön hazırlıklar <ol><li> 8 mM son fosfat konsantrasyonunun ve reklam elde etmek için, aşırı saf su 16,1 ml fosfat tamponlu tuz (PBSx1) 33.9 mi karıştırılarak deney tamponu 50 ml hazırlamakD MgCl2 23.8 mg 5 mM nihai konsantrasyon elde etmek için. </li><li> 50 mM Tris pH 7.5, 50 mM NaCI ihtiva eden bir tampon içinde proteinin ile GST M1-1 bir stok çözeltisi hazırlanır, 1 mM ditiotreitol (DTT) ve 30 uM bir nihai konsantrasyon 5 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA). -80 ° C&#39;de bu küçük kısma çözüm ve mağaza bölün. Deney tamponu içerisinde, bölüm 2.1.5.1 uygun olarak, yeni seyreltilir ve buz üzerinde tutulur. Not: enzim aktivitesinde bir azalma oluncaya kadar solüsyon yaklaşık 5 saat boyunca sabit olabilir veya olacaktır. </li><li> Aşağıdaki talimatlara göre alt-tabakanın hazırlanması: <ol><li> 100 mM&#39;lik bir stok çözeltiden bir son konsantrasyona kadar, aşırı saf su 325 ul indirgenmiş glutatyon (GSH), 10 mg çözülür. 2.1 mM çalışma çözeltisinin bir son konsantrasyon için deney tamponu 979 ul bu stok çözeltinin 21 ul seyreltilir. </li><li> e 492 ul 2,4-dinitroklorobenzen 10 mg (CDNB) çözülür100 mM stok çözeltisi, bir nihai konsantrasyona kadar -metanol. 4.32 mM&#39;lik çalışma çözeltisi bir son konsantrasyon için, bir deney tamponu 956,8 ul stok çözeltisinden 43,2 ul seyreltilir. </li></ol></li><li> 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ayrı bir hat (12 kuyu), her alt-tabakanın koydu. çözelti, hızlı ve kolay bir çekme izin vermek için her bir kuyunun içine en az 60 ul ekle. Hafif korunması için bir alüminyum levha ile plaka örtün. </li><li> Deney tamponu aşağıdaki stok çözelti hazırlayın: <ol><li> dimer 0.6 uM nihai konsantrasyona kadar 50 ile GST M1-1 seyreltilir. </li><li> 30 uM stok çözeltisine &#39;kimyasal dönüştürücüyü&#39; sulandırmak. </li><li> 40 uM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar PDGF seyreltilir. </li><li> 250 uM nihai konsantrasyona kadar PDGF aptamer seyreltilir. </li></ol></li></ol></li><li> &#39;Kimyasal transdüser&#39; Varlığında ve PDGF GST Etkinliği ölçün. <ol><li> deneysel prosedür i kurmakkinetik ölçüm için plaka okuyucu n tane. <ol><li> bir &#39;standart protokolü&#39; olarak yeni bir deneme oluşturun. </li><li> &#39;Prosedür&#39; basın prosedürü ayarları penceresini açmak için. </li><li> Pencerenin üst tarafındaki açılır listesinde, plaka üreticiye göre &#39;384 plakalı&#39; türü seçin. </li><li> Sol menüde Basın &#39;Oku&#39;. </li><li> algılama yöntemi &#39;Absorbans&#39; seçim ile ilgili olarak. </li><li> okuma türüne ilişkin &#39;End noktası&#39; seçin. </li><li> dalgaboyu penceresinde 340 nm yazınız. </li><li> Sağ üst taraftaki &#39;Tam plaka&#39; alt Basın ve kuyu seçmek ölçülecek. </li><li> Basın &#39;ok&#39; kapatmak için &#39;oku&#39; penceresi. </li><li> Seç, sol menüde &#39;kinetik başlıyorum. </li><li> çalışma süresi 10 dk olun. </li><li> Asgari aralıkları seçeneğini seçin. </li><li> Basın &#39;Tamam&#39; kinetik penceresini kapatmak için. </li><li> &#39;Oku&#39; satır i sürükleyinkinetik ölçüm nto. </li><li> &#39;Doğrulamak&#39; düğmesini ve ardından &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li><li> Denemeyi kaydedin. </li><li> &#39;Oynamak&#39; düğmesine basın. Bir iletişim kutusu belirecektir - Ölçüm geçilmelidir yalnızca &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li></ol></li><li> , Kopyaların deneyi gerçekleştirmek dört numune &quot;Kimyasal transdüktörün &#39;ve GST M1-1 3.25 ul, her biri 3.25 ul hazırlanması için. sırasıyla her bir örnek, 0, 1.2, 2.4, ya da PDGF ve 123.5, 122.3, 121.1, 4.9 ul ya da deney tamponu 118.6 ul ekle. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin. </li><li> 384 şeffaf plaka, her bir oyuğa örnek 40 ul yerleştirin. Alt tabaka eklenmesi için çok pipet kullanımına izin vermek için sadece tek kuyularda veya yalnızca aynı çizgide bile kuyularda örnekleri yerleştirin. </li><li> 12 kanallı çok pipet kullanarak hızlı bir şekilde t her birinden 10 ul96 oyuklu plaka (bölüm 2.1.4) &#39;de önceden hazırlanmış O alt-tabakalar. kabarcıkları önlemek için yavaşça ve hızlı bir şekilde karıştırın. okuyucu plaka takın ve kinetik ölçümü başlatın. GST kinetiği oldukça hızlı olduğundan, substrat ilavesi ve kinetik ölçüm başlangıcı arasındaki süreyi en aza indirmeye çalışın. </li></ol></li><li> GST Aktivasyon &#39;kimyasal transdüser tarafından&#39; Aracılı / İnhibisyon yapar. <ol><li> , Kopyaların deneyi gerçekleştirmek 5 numune deney tamponu 84.5 ul, &#39;Kimyasal transdüktörün&#39; 3.25 ul ve GST M1-1 3.25 ul içeren her hazırlanması için. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Tahlil tamponu 3.65 ul numuneler 2-5 PDGF 1 ve 3.65 ul örnek ekleyin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> örneklerin 1-2 deney tamponu 3.12 ul ve örnekler 3-5 PDGF aptamer 3.12 ul ekle. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> örnekler deney tamponu 24.4 ul ekleörneklerin 4-5 PDGF 1-3 ve 24.4 ul. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe 5. örnek örnekleri 1-4 ve PDGF aptamer 7.8 ul deney tamponu 7.8 ul ekle. </li><li> 384 şeffaf plaka, her kuyuya örnek 40 ul yerleştirin. Sadece tek içine veya sadece aynı çizgide bile kuyulara takın örnekleri. </li><li> 12 kanallı çok pipet kullanarak hızlı bir şekilde her alt-tabakadan 10 ul (96 oyuklu plaka içerisinde önceden hazırlanmış). kabarcıkları önlemek için yavaşça ve hızlı bir şekilde karıştırın. okuyucu plaka takın ve kinetik ölçümü başlatın. </li><li> T 340 nm = aktivasyon / inhibisyon geri dönüşüm değerlendirmek için t 340 nm = 1.5 dakika ölçülen OD 0,5 dakikada ölçülen OD çıkarılarak her koşul altında V 0 [MOD / dak] hesaplayın. 25 </li></ol></li><li> Çevre Değişiklik Yapılması &#39;kimyasal transdüser&#39; Gerçek zamanlı Yanıtı değerlendirin. <ol> &lt;li&gt; PDGF ek Gerçek zamanlı etkisi <ol><li> kinetik ölçüm için plaka okuyucu deneysel prosedür ayarlayın. </li><li> Yineleyin 2.2.1.1-2.2.1.10 adımları. </li><li> çalışma süresi 3.5 dakika yapın. </li><li> Asgari aralıkları seçeneğini seçin. </li><li> Basın &#39;Tamam&#39; kinetik penceresini kapatmak için. </li><li> kinetik ölçüm içine &#39;Oku&#39; çizgiyi sürükleyin. </li><li> Sol menüde / In Out Plate seçin. </li><li> seçeneği &#39;plaka dışarı (hiçbir iletişim)&#39; seçiniz. </li><li> Sol menüde &#39;Delay&#39; seçeneğini seçin ve 30 saniye girin. </li><li> Sol menüde / In Out Plate seçin. </li><li> seçenek &#39;(hayır iletişim kutusunda) plaka&#39; seçin. </li><li> 2.2.1.14 ancak bölüm 2.2.1.11 25 dk yerine 10 dk olmak üzere kinetik set - adımlarını 2.2.1.4 yineleyerek ikinci bir kinetik ölçüm oluşturun. </li><li> &#39;Doğrulamak&#39; düğmesini ve ardından &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li><li> Denemeyi kaydedin. </li><li> &#39;Pla basıny &#39;düğmesine basın. Bir iletişim kutusu belirecektir - Ölçüm geçilmelidir yalnızca &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li><li> GST M1-1 1 ul ve Tahlili tamponu 38 ul &#39;kimyasal transdüser&#39; 1 ul karıştırılarak iki örnek hazırlayın. Bu iki kuyu arasında boş bir kuyu bırakarak, 384 şeffaf plaka iki kuyu içine örnekleri yerleştirin. </li><li> hızlı, her bir alt tabaka 10 ul hafifçe karıştırın ve hızlı bir şekilde kabarcıkları önlemek için, okuyucu plaka takın ve kinetik ölçümü başlatın, bir 12 kanallı multi-pipet kullanarak. </li><li> Plaka (3.5 dakika sonra) kadar açıldığında, hızlı, kuyu birine PDGF 1.125 ul ekleyin hafifçe karıştırın ve plaka kalan kinetik ölçümler için yukarı kapatmak için izin verir. </li></ol></li><li> PDGF aptamer ekleme Gerçek zamanlı etkisi <ol><li> Yineleyin 2.4.1.1-2.4.1.15 adımları. </li><li> GST M1-1 1 ul, 1 ul karıştırılarak iki numune hazırlama &#39;Kimyasal dönüştürücü &quot;ve deney tamponu 36.9 ul PDGF 1.125 ul. Bu iki kuyu arasında boş bir kuyu bırakarak, 384 şeffaf plaka iki kuyu içine örnekleri yerleştirin. </li><li> , Kabarcıkları önlemek okuyucu plaka takın ve kinetik ölçüm başlatmak için hızlı hızlı, her bir alt tabaka 10 ul hafifçe karıştırın ve bir 12 kanallı multi-pipet kullanarak. </li><li> Plaka (1.5 dakika sonra) kadar açıldığında, hızlı, kuyu birine PDGF aptamer 1.2 ul ekleyin hafifçe karıştırın ve plaka kalan kinetik ölçümler için yukarı kapatmak için izin verir. </li></ol></li></ol></li><li> &#39;Kimyasal transdüser&#39; ve PDGF Varlığında GST tarafından JS-K Ön ilaç Etkinleştirme ölçün. <ol><li> kinetik ölçüm için plaka okuyucu deneysel prosedür ayarlayın. <ol><li> bir &#39;standart protokolü&#39; olarak yeni bir deneme oluşturun. </li><li> &#39;Prosedür&#39; basın prosedürü ayarları penceresini açmak için.</li><li> Pencerenin üst tarafındaki açılır listesinde plaka üreticiye göre &#39;384 plakalı&#39; türü seçin. </li><li> Sol menüde Basın &#39;Oku&#39;. </li><li> algılama yöntemi &#39;Absorbans&#39; seçti ilgili. </li><li> okuma türüne ilişkin &#39;End noktası&#39; seçin. </li><li> dalgaboyu penceresinde 305 nm yazınız. </li><li> Sağ üst taraftaki &#39;Tam plaka&#39; düğmesine basın ve kuyu seçmek ölçülecek. </li><li> Basın &#39;ok&#39; kapatmak için &#39;oku&#39; penceresi. </li><li> Seç, sol menüde &#39;kinetik başlıyorum. </li><li> çalışma süresi 10 dk olun. </li><li> Asgari aralıkları seçeneğini seçin. </li><li> Basın &#39;Tamam&#39; kinetik penceresini kapatmak için. </li><li> kinetik ölçüm içine &#39;Oku&#39; çizgiyi sürükleyin. </li><li> &#39;Doğrulamak&#39; düğmesini ve ardından &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li><li> Denemeyi kaydedin. </li><li> &#39;Oynamak&#39; düğmesine basın. Bir iletişim box görünecektir - Ölçüm geçilmelidir yalnızca &#39;Tamam&#39; düğmesine basın. </li></ol></li><li> NO üretimi için ölçümler nitrit / nitrat kalorimetrik kiti kullanın. 96 oyuklu bir plaka üçüncü bir satıra bir satıra ikinci bir satıra Reaktif Griess 70 ul ve Griess reaktifi II 70 ul deney tamponu 50 ul yerleştirin. </li><li> , Kopyaların deneyi gerçekleştirmek dört numune &#39;kimyasal transdüser&#39; her içeren 4.8 ul hazırlamak için. Deney tamponu 155.2 ul, örnek 1 ile; GST-M1-1 3.2 ul ve Tahlili tampon 152 ul ekleyin, 2 örnek; PDGF 9.6 ul ve Tahlili tampon 145.6 ul ekleyin, 3 örnek; ve 4 örnek GST-M1-1 3.2 ul, PDGF 9.6 ul ve analiz tamponu 142.4 ul ekle. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin. </li><li> 384 şeffaf plaka, her kuyuya örnek 50 ul yerleştirin. yalnızca tek ya da sadece insert örnekleriaynı satırda da kuyu alt-tabaka eklenmesi için bir çoklu pipet kullanımına izin vermek için. </li><li> Her bir oyuğa, JS-K 0,54 ul (DMSO içinde 5 mM) eklenir. </li><li> hızlı kabarcıklarını önlemek için hızlı bir şekilde (96-çukurlu plaka içinde önceden hazırlanmış), yavaşça karıştırın GSH çözeltiden 10 ul ve 12 kanallı bir çoklu pipet kullanarak. okuyucu plaka takın ve kinetik ölçümü başlatın. </li><li> Griess I reaktifi 50 ul ve 50 ul hemen kinetik ölçümden sonra, 12 kanallı bir çoklu pipet kullanarak, önceden hazırlanmış 96 oyuklu plaka içerisinde deney tamponu satıra her örnekten 50 ul almak ve hızlı bir şekilde ekleme Griess II reaktif. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile ışıktan koruyarak inkübe ve 550 nm&#39;de absorbans ölçümü. Not: Deney Tamponu ve reaktifler miktarlar kitleri protokolü bağlıdır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling%E2%80%942000+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling—2000 and Beyond.</a> Cell. 100, 113-127 (2000).</li>
<li>Levitzki, A., Klein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Signal transduction therapy of cancer.</a> Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).</li>
<li>Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+signal+transduction+therapy%3A+a+futuristic+approach+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment.</a> Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).</li>
<li>Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Communication+and+Enzyme+Activation+Mediated+by+a+Synthetic+Chemical+Transducer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer.</a> J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).</li>
<li>Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Applications+of+Bifunctional+Small+Molecules%3A+Why+Two+Heads+Are+Better+Than+One%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One.</a> ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).</li>
<li>Rutkowska, A., Schultz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Tango%3A+The+Toolbox+to+Capture+Interacting+Partners%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).</li>
<li>Meyer, C., Köhn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+T%C3%AAte-%C3%A0-T%C3%AAte+Arranged+by+a+Designed+Adaptor+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).</li>
<li>Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+as+a+Regulatory+Mechanism+in+Signal+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction.</a> Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).</li>
<li>DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+signaling+at+will%3A+chemically-inducible+dimerization+%28CID%29+techniques+resolve+problems+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology.</a> Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).</li>
<li>Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+control+over+protein-protein+interactions%3A+beyond+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput.+Screen%22%5BJournal%5D)">Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors.</a> Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).</li>
<li>Diezmann, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-guided+display+of+proteins+and+protein+ligands+for+the+interrogation+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).</li>
<li>Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Controlled+Reversible+Switching+of+Peptide+Conformation+and+Bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).</li>
<li>Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA-Controlled+Switching+of+Protein+Kinase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity.</a> ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).</li>
<li>Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Small+Molecule+Chimera+with+Responsive+Protein-Binding+Ability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).</li>
<li>Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Binding+Molecular+Switches+via+Host-Guest+Stabilized+DNA+Hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+for+high-performance+bivalent+nucleic+acid+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Logical+Molecular+Circuit+for+Programmable+and+Autonomous+Regulation+of+Protein+Activity+Using+DNA+Aptamer-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).</li>
<li>Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Protein+Surface+Sensors+as+a+Tool+for+Analyzing+Small+Populations+of+Proteins+in+Biological+Mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).</li>
<li>Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular%2C+DNA-Based+Beacon+for+Single-Step+Fluorescence+Detection+of+Antibodies+and+Other+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).</li>
<li>Franzini, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Structure-Activity+Relationships+from+Screening+a+Structurally+Compact+DNA-Encoded+Chemical+Library%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).</li>
<li>Unger-Angel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recognition+by+bivalent%2C+%27turn-on%27+fluorescent+molecular+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein recognition by bivalent, 'turn-on' fluorescent molecular probes.</a> Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).</li>
<li>Nissinkorn, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+Protein+Surfaces+with+Targeted+Fluorescent+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors.</a> Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).</li>
<li>Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Liquid+Chromatography+of+Oligonucleotides+on+Nonporous+Alkylated+Styrene-Divinylbenzene+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers.</a> Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).</li>
<li>Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+class+of+bivalent+glutathione+S-transferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors.</a> Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).</li>
<li>Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-based+systems+for+input-controlled+and+non-covalently+regulated+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Supramol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding.</a> Supramol. Chem. , 1-16 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Doğal olarak ilgisiz iki protein olan GST ve PDGF arasında doğal proteinleri değiştirmeden yapay iletişimi indükleyebilen bir 'kimyasal dönüştürücünün' tasarlanması ve test edilmesi için bir yöntem sunduk. Doğal olmayan GST-PDGF iletişimleri, 'kimyasal dönüştürücü' varlığında GST aktivitesindeki değişiklikleri takip eden ve PDGF konsantrasyonlarını artıran enzimatik tahliller kullanılarak gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir. PDGF tarafından GST'nin aktivasyonunu tespit etmeye ek olarak, bu tahliller, GST'nin rakip bi...

Sinyal transdüksiyon yollarının hemen hemen her türlü hücresel işlemde önemli bir rol oynamaktadır ve hücre hızlı çevresel sinyallere cevap verir. 1. Bu yollar sık sık, hücre içi enzimlerin aktivasyonu ile sonuçlanır hücre dışı bir reseptör, bir sinyal molekülünün bağlanması ile tetiklenir. Amplifikasyon ve hücre içinde, bu sinyalin yayılma enzimleri tersine çevrilebilir yüksek özgüllük ile aktive olan protein-protein etkileşimleri, bir ağ oluşturmak proteinlerin sinyal fonksiyonunun aracılık eder. Bu ağların düzensizliği sık kanser gelişimine yol açar, çünkü uyuşturucu malign sinyal yolları bozmak için tasarlanmış bu sayede &#39;kanser sinyal iletim tedavisi&#39;, 2 kurulmasında çok ilgi olmuştur. Biz son zamanlarda doğal olmayan sinyal iletim yollarını oluşturmak için ilaçların yeteneklerine bağlıdır iletim tedavisi sinyal alternatif bir yaklaşım önerdi. <suÖzellikle p&gt; 3 biz sinyal proteinlerinin fonksiyonunu taklit eden sentetik maddeler tasarlayarak, dolaylı hücrenin fonksiyonunu modüle etmek mümkün olacağı düşünülmektedir. Örneğin, bu yapay ağlar ön ilaçlarını bölen enzimleri aktive protein biyobelirteçlerini sağlayabilir. Alternatif olarak, bu sinyal protein taklitleri terapötik etkilere neden doğal olmayan hücre sinyal yolları aktive mümkün olabilir. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermek için, son zamanlarda bir glutatyon-S-transferaz (GST), aktive ederek bir antikanser ön ilacın bölünmesini tetiklemek için, trombosit türevli büyüme faktörü (PDGF) sağlayan sentetik bir &quot;Kimyasal transdüser &#39;4 oluşturduk değil doğal bağlama ortağı. Bu &#39;transdüktörün&#39; yapısı GST için bir iki değerli önleyici ile modifiye edilmiş bir anti-PDGF DNA aptamer oluşur. Bu nedenle, bu sentetik madde için bağlanma yerleri bir molekül ailesine aitFarklı proteinler, dimerizasyonunun 5-7 gibi kimyasal uyarıcılar (Müşteri Kimlikleri) 8-10 ve oligonükleotid-sentetik bir molekül konjugatlarının göre protein bağlayıcı grup. 11-21 Bu tür sistemlerin tasarımını temel genel ilkeleri burada tarif edildiği ve sentezlemek ve konvansiyonel enzimatik deneyleri ile bu &#39;transdüser&#39; fonksiyonunu test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanır. Bu çalışma, hücre içi protein-protein iletişim aracılık etmek ve bunun sonucu olarak, yapay hücre sinyalizasyon yolları uyarılması için kullanılabilecektir Bu sınıf, ilave &#39;dönüştürücüleri&#39; geliştirilmesinin kolaylaştırılması için tasarlanmıştır. Şekil 1 doğal olmayan protein-protein iletişimi aracılık sentetik &#39;kimyasal dönüştürücüler&#39; çalışma prensiplerini açıklar. prot için sentetik bağlayıcı entegre Bu resimde, bir &#39;kimyasal transdüser&#39; inEins I ve II (bağlayıcı I ve II), doğal bağlanma ortağı olmayan proteinin katalitik aktivitesi I tetiklemek için protein II sağlar. Protein II yokluğunda, dönüştürücü enzimi (protein I) &#39;e katalitik bağlayan ve aktivitesi (Şekil 1, durumu ii) inhibe eder. Protein II &#39;transdüktörün&#39; bağlanmasının, ancak, bunun bir sonucu olarak etkili konsantrasyonunu proteini I&#39;e doğru yakınlığını azaltır bağlayıcı I ve protein II yüzeyi (Şekil 1, konum III), arasındaki etkileşimi teşvik &#39; çözelti içinde serbest &#39;dönüştürücü transformatör-protein ayrışmasına yol açan azaltılır karmaşık ve protein ı yeniden aktive etmek (Şekil 1, durumu iv). (1) &#39;dönüştürücü&#39;, protein hedeflerinin her biri için (2) etkileşim betwe belirli bir bağlayıcı olmalıdır: Birlikte ele alındığında, bu adımlar verimli &#39;dönüştürücüler&#39; tasarımı altında yatan üç temel ilkeleri vurgulamakbağlayıcı II ve protein tr II Ben protein II yüzeyi ile etkileşim mümkün olmalıdır bağlayıcı I ve protein I ve (3) bağlayıcı arasındaki etkileşim daha güçlü olmalıdır. Bu son prensibi mutlaka protein II doğru yüksek bir afiniteye ve seçimliliğe sahip olur yalnız bu bağlayıcı gerekli değildir. Bunun yerine, bir proteine denk gelen sentetik bir molekül getiren bu molekülün ve protein yüzeyi arasındaki etkileşimi teşvik etmek için olası olduğunu göstermiştir son çalışmalara dayanmaktadır. 19,22,23 <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54396/54396fig1.jpg" /> Şekil 1:. &#39;Kimyasal dönüştürücü&#39; aktif protein I (devlet i) eklendiğinde &#39;kimyasal dönüştürücüler&#39; ve Çalışma prensipleri, bu bağlayıcı aracılığıyla aktif sitesine I bağlanır ve faaliyetlerini (devlet ii) inhibe eder. protein II varlığında, ancak, bağlanmamış &quot;Kimyasal transducer &#39;bağlayıcı I ve protein II yüzeyi arasındaki etkileşimi teşvik bağlayıcı II yoluyla protein II ile etkileşir. Bu uyarılmış bağlayıcı I-protein II etkileşimi Ben karmaşık ve proteine ben etkinleştirme (devlet iv). &#39;Transducer&#39;-protein ayrışmasına yol açar bağlayıcı I etkili konsantrasyonunu azaltır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54396/54396fig1large.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .</a>

<table><tbody><tr><td>1-kloro-2,4-dinitrobenzen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237329</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Bio Lab</td><td>01070521</td><td></td></tr><tr><td>Asetnitril</td><td>J.T.Baker</td><td>9017-03</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Bakır(II) Sülfat pentahidrat</td><td>Merck-Millipore</td><td>102790</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Merck-Millipore</td><td>802912</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Biyolojik</td><td>Endüstrileri</td><td>02-023-5A</td><td></td></tr><tr><td>Etakrinik asit</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd,</td><td>E0526</td><td></td></tr>, <tr><td>Glutatyon-s-transferaz M1-1</td>, <td>İsrail Yapısal Proteomik Merkezi (Weizmann Bilim Enstitüsü, Rehovot, İsrail)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JS-K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>J4137</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatyonu azaltılmış</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>J.T.Baker</td><td>0162</td><td></td></tr><tr><td>nitrat/nitrit kolorimetrik tahlil kiti</td><td>Cayman Chemical</td><td>780001</td><td></td></tr><tr><td>Oligonükleotidler</td><td>W. M. Keck Yale Üniversitesi'nde</td><td></td><td>Biyoteknoloji özel sipariş</td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>İsrail Yapısal Proteomik Merkezi (Weizmann Bilim Enstitüsü, Rehovot, İsrail)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Tuz giderme kolonu</td><td>GE Healthcare</td><td>illustra MicroSpin G-25 Sütunları</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Suları&nbsp;</td><td>2695 ayırma modülü</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sütunu</td><td>Sular</td><td>XBridgeTM OST C18 sütunu (2.5 &mu; M, 4,6 mm ve süreler; 50 mm)</td><td></td></tr> <tr><td>HPLC sütunu</td><td>Sular</td><td>XBridgeTM OST C18 sütunu (2.5&nbsp; &mu; M, 10 mm ve süreler; 50 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>synergy H4 hybrid</td><td></td></tr></tbody></table>

sinyal proteinlerin fonksiyonu taklit: yapay sinyal İletimi tedavisi doğru

Mimicking the Function of Signaling Proteins: Toward Artificial Signal Transduction Therapy

Hücrelerin çeşitli çevresel sinyallere tepkisini kontrol eden sinyal iletim yollarına, birbirleriyle etkileşime giren ve birbirlerini yüksek özgüllükle aktive eden sinyal proteinlerinin işlevi aracılık eder. Bu proteinlerin işlevini taklit eden sentetik ajanlar, bu nedenle, doğal olmayan sinyal iletim adımları oluşturmak ve sonuç olarak hücrenin işlevini değiştirmek için kullanılabilir. Doğal proteinler arasında yapay iletişimi indükleyebilecek 'kimyasal dönüştürücüler' tasarlamak için yönergeler sunuyoruz. Ek olarak, iki ilgisiz protein arasındaki iletişimi indükleyebilen spesifik bir 'dönüştürücüyü' sentezlemek ve test etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz: trombositten türetilmiş büyüme faktörü (PDGF) ve glutatyon-S-transferaz (GST). Bu doğal olmayan PDGF-GST iletişiminin, bir antikanser ön ilacının bölünmesini kontrol etmek için nasıl kullanılabileceği de sunulmakta ve bu tür sistemlerin 'yapay sinyal iletim terapisinde' kullanılma potansiyelini göstermektedir. Bu çalışma, hücre içi protein-protein iletişimine aracılık etmek ve sonuç olarak yapay hücre sinyal yollarını indüklemek için kullanılabilecek bu sınıftan ek 'dönüştürücülerin' geliştirilmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Tasarımı, sentezi ve PDGF ve GST arasındaki yapay iletişim uyarabilir &quot;kimyasal transdüktörün &#39;etki mekanizması, Şekil 2&#39;de sunulmaktadır.&#39; Transdüktörün &#39;yapısı, PDGF, DNA aptamer ve bis-etakrinik amid entegre (BEA ) sırasıyla 26 nM ve 144 nM arasında bilinen bir GST önleyicisi (Şekil 2a). 19 Bu bağlayıcı maddeler (ayrılma sabitleri, Kd &#39;dönüştürücüyü &quot;, yani, farklı afinitelere sahip iki PDGF ve GST b...

Doğal olarak ilgisiz proteinler arasındaki iletişimi indükleyebilecek sentetik 'kimyasal dönüştürücüler' geliştirmek için kılavuzlar sunuyoruz. Ek olarak, bir büyüme faktörünün detoksifiye edici bir enzimi aktive etmesini ve sonuç olarak bir antikanser prodoksifiye edici ilacın bölünmesini düzenlemesini sağlayan spesifik bir 'dönüştürücünün' sentezlenmesi ve test edilmesi için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır.

Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins ...

Bu deneyin genel amacı, sentetik bir kimyasal dönüştürücü tarafından tetiklenen iki protein arasındaki doğal olmayan iletişimi spektroskopik olarak takip etmektir. Bu çalışma, doğada bulunmayan sinyal iletim yollarını gerçekleştirebilecek sinyal proteinlerinin sentetik analoglarını geliştirme olasılığını ortaya koyacaktır. Yaygın bir spektrofotometre ile doğal olmayan proteinler arası iletişimi takip edebilme yeteneği, yapay kimyasal dönüştürücülerin fonksiyonlarının geliştirilmesine ve iyileştirilmesine yardımcı olabilir ve bizi yapay sinyal iletim tedavisine ulaşmaya daha da yaklaştırabilir.Kimyasal dönüştürücü; bir trombosit türevli büyüme faktörü veya PDGF aptameri, bivalent bir etakrinik amid GST inhibitörü, bir florofor ve bir söndürücüden oluşmaktadır. Kimyasal dönüştürücünün sentezi bu videoda gösterilmeyecektir.Ancak metin protokolünde açıklanmıştır. Kimyasal dönüştürücünün çalışma prensipleri burada gösterilmiştir. Kimyasal dönüştürücü, iki EA grubu enzimlerin aktif bölgelerine bağlandığında GST'nin enzimatik aktivitesini inhibe eder.PDGF eklenmesi, PDGF kimyasal dönüştürücü kompleksinin oluşumuna yol açar. Bu durum, dönüştürücü-GST etkileşimini bozarak GST enzim aktivitesini yeniden geri kazandırır. Ardından modifiye edilmemiş bir PDGF aptamerinin eklenmesi, kimyasal dönüştürücüyü serbest bırakır ve enzimi yeniden inhibe etmesine olanak tanır.PDGF tarafından GST aktivitesinin kontrolünü incelemek için deneylere başlamadan önce, plak okuyucuda kinetik ölçüm için bir deney prosedürü ayarlayın. Standart bir protokol olarak yeni bir deney oluşturun. Prosedür Ayarları penceresini açmak için Procedure seçeneğini seçin.Pencerenin üst kısmındaki açılır listeden, plaka üreticisine uygun olan 384 Plaka Tipini seçin. Sol menüden Read seçeneğini belirleyin. Tespit Yöntemi için Absorbance seçeneğini seçin.Okuma Tipi için Uç Nokta'yı (Endpoint) seçin. Dalga Boyu penceresine 340 nanometre yazın. Tüm Plaka'yı (Full Plate) seçin ve ölçülecek kuyucukları belirleyin.Ardından, Okuma penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Sol menüden Kinetik Başlat'ı seçin. Çalışma Süresini 10 dakika olarak ayarlayın.Minimum Aralıklar seçeneğini seçin. Ardından, Kinetik penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Okuma Hattını Kinetik Ölçümün içine sürükleyin.Doğrula (Validate) düğmesini, ardından Tamam (OK) düğmesini seçin. Deneyi kaydedin. Oynat (Play) düğmesini seçin.Bir iletişim kutusu görünecektir, ancak kinetik ölçüme başlamaya hazır olana kadar Tamam düğmesini seçmeyin. Plaka okuyucu kurulduktan sonraki adım, kimyasal dönüştürücü ve PDGF varlığında GST aktivitesini ölçmek için örnekleri hazırlamaktır. Dört farklı PDGF konsantrasyonunu üç paralel ölçümle test etmek için, her biri 3,25 µL kimyasal dönüştürücü ve 3,25 µL GST M-1 içeren dört örnek hazırlayın.Her bir örneğe sırasıyla 0, 1,2, 2,4 veya 4,9 µL PDGF ekleyin. Ardından, toplam hacmi 130 µL'ye tamamlamak için her bir örneğe uygun hacimde assay tamponu ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.10 dakika sonra, her örnekten 40 µL'yi 384 kuyucuklu şeffaf bir plakadaki kuyucuklara aktarın. Dört örneğin her birini, aynı satırdaki yalnızca tek veya çift numaralı kuyucuklara aktarın. Bu işlem, substrat eklemesi için çok kanallı pipet kullanımına olanak tanır.Ardından, daha önce 96 kuyucuklu plakta hazırlanmış olan her bir substrattan 10 µL'yi her örneğe hızlıca eklemek için 12 kanallı çoklu pipet kullanın. Kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı ancak nazikçe karıştırın. Plağı hemen plaka okuyucuya yerleştirin ve diyalog kutusundaki OK düğmesini seçerek kinetik ölçümü başlatın.Kimyasal dönüştürücü tarafından aracılık edilen GST aktivasyon inhibisyon döngülerini incelemek için, her biri 84,5 µL analiz tamponu, 3,25 µL kimyasal dönüştürücü ve 3,25 µL GST M1-1 içeren beş örnek hazırlayın. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin.Birinci örneğe 3,65 µL analiz tamponu, ikinci, üçüncü, dördüncü ve beşinci örneklere ise 3,65 µL PDGF ekleyin. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin. Birinci ve ikinci örneklere 3,12 µL analiz tamponu, üçüncü, dördüncü ve beşinci örneklere ise 3,12 µL PDGF aptameri ekleyin.Oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin. Bir, iki ve üç numaralı örneklere 24.4 µL assay tamponu ekleyin. Dört ve beş numaralı örneklere ise 24.4 µL PDGF ekleyin.Oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin. Bir ile dört arası örneklere 7.8 µL assay tamponu, beşinci örneğe ise 7.8 µL PDGF aptameri ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Numuneleri 384 kuyucuklu şeffaf bir plakaya aktarın. Deneyi üç tekrarlı (triplicate) olarak gerçekleştirmek için substratı numunelere hızlıca ekleyin. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.Bu analize başlamak için, protokol metninde açıklandığı şekilde, kinetik ölçüm için plaka okuyucuda bir deney prosedürü ayarlayın. 384 şeffaf kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğunda iki örnek hazırlayın. Her bir kuyucuk için, 38 µL analiz tamponu içerisinde bir µL GST M1-1 ve bir µL kimyasal dönüştürücüyü karıştırın.İki kuyucuk arasında bir boş kuyucuk bırakın. 12 kanallı çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğa hızla 10 µL substrat ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için nazikçe ve hızlıca karıştırın.Plakayı hemen okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın. Plaka okuyucu 3,5 dakika sonra açıldığında, kuyucuklardan birine hızlıca 1,125 µL PDGF ekleyin, nazikçe karıştırın ve plağın kalan kinetik ölçümler için okuyucuya yeniden girmesini sağlayın. Bu deney için numuneleri hazırlamadan önce, plaka okuyucuda protokol metninde açıklandığı şekilde kinetik ölçüm için bir deney prosedürü oluşturun.Nitrik oksit üretimini ölçmek için bir nitrit/nitrat kolorimetrik kiti kullanılacaktır. 96 kuyucuklu bir plakada, ilk sıradaki her kuyucuğa 50 µL assay tamponu ekleyin. İkinci sıradaki her kuyucuğa 70 µL Griess One Reagent ekleyin.Ardından, üçüncü sıradaki her kuyucuğa 70 µL Griess Two Reagent ekleyin. Her biri 4,8 µL kimyasal dönüştürücü içeren dört örnek hazırlayın. Birinci örneğe 155,2 µL analiz tamponu ekleyin.İkinci numuneye 3.2 µL GST M1-1 ve 152 µL analiz tamponu ekleyin. Üçüncü numuneye 9.6 µL PDGF ve 145.6 µL analiz tamponu ekleyin. Dördüncü numuneye ise 3.2 µL GST M1-1, 9.6 µL PDGF ve 142.4 µL analiz tamponu ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Deneyi üç tekrarlı olarak gerçekleştirmek için 384 kuyucuklu şeffaf bir plakadaki her kuyucuğa 50 µL numune ekleyin. Substrat eklemesi sırasında çok kanallı pipet kullanımına olanak sağlamak için numuneleri aynı satırdaki yalnızca tek veya çift sayılı kuyucuklara ekleyin.Her örneğe 0,54 microliter JS-K ön ilaç ekleyin. Her örneğe hızla 10 microliter glutatyon çözeltisi ekleyin ve kabarcık oluşumunu önlemek için nazikçe ve hızlıca karıştırın. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.Kinetik ölçümün hemen ardından, her örnekten 50 µL'yi, analiz tamponu içeren 96 kuyucuklu plakanın ilk sırasındaki her bir kuyucuğa aktarın. Ardından, plakanın ikinci sırasındaki her bir kuyucuktan 50 µL'yi plakanın ilk sırasındaki kuyucuklara aktarın. Son olarak, plakanın üçüncü sırasındaki her bir kuyucuktan 50 µL'yi plakanın ilk sırasındaki kuyucuklara aktarın.Oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak 10 dakika boyunca inkübe edin. 550 nanometrede absorbansı ölçmeden önce. GST aktivitesinin kimyasal dönüştürücü olmadan ve kimyasal dönüştürücü ile ölçülmesi, kimyasal dönüştürücünün GST aktivitesini inhibe ettiğini göstermiştir.GST, GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine artan konsantrasyonlarda PDGF eklenmesiyle yeniden aktive edilir. PDGF'nin ve modifiye edilmemiş bir PDGF aptamerinin GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine ardışık olarak eklenmesi, PDGF ile GST arasındaki iletişimin geri dönüşümlü olduğunu ortaya koymuştur. PDGF'nin GST-dönüştürücü kompleksine eklenmesi, substratların eklenmesinden 3,5 dakika sonra GST aktivitesinde hızlı bir artışla sonuçlanmıştır.GST, PDGF ve kimyasal dönüştürücü karışımına bir PDGF aptamerinin eklenmesi, GST aktivitesinde bir azalmaya yol açmıştır. Bu sonuçlar, sistemin çevresindeki değişikliklere gerçek zamanlı olarak yanıt verdiğini göstermektedir. Ardından, bu sistemin prodrug aktivasyonunu kontrol etme yeteneği, GST tarafından toksik nitrik oksit salmak için aktive edilen bir anti-kanser prodrug olan JS-K kullanılarak araştırılmıştır.Kimyasal dönüştürücüye JS-K ile GST ve PDGF'nin farklı kombinasyonlarının eklenmesi üzerine salınan nitrik oksit miktarlarının ölçümleri, JS-K'yı yalnızca GST ve PDGF'nin her ikisinin birden varlığının aktive ettiğini doğrulamıştır. Tüm bunlar, sentetik bir ajanın, doğal enzim partneri olmayan Glutatyon S-Transferaz'ın katalitik aktivitesini tetiklemek için bir büyüme faktörüne nasıl imkan sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu sınıftaki gelecek biyomimetikler, hücrelerin çevresel sinyallere verdiği yanıtı değiştirmek veya onlara yeni özellikler kazandırmak için kullanılabilir.

mimicking-function-signaling-proteins-toward-artificial-signal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Bu protokol, hücre farklılaşması ve Xenopus embriyonik gelişimi sırasında mitojenle aktive protein kinaz (MAPK) aktivitesini modüle etmek için bir optogenetik strateji tanımlamaktadır. Bu yöntem, yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip Xenopus embriyoları gibi memeli hücre kültüründe ve çok hücreli canlı organizmalarda MAPK sinyal yolağının geri dönüşümlü aktivasyonuna izin verir.

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA'ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Guanozin trifosfat (GTP) bağlanması, G-Protein-Çiftleşmiş Reseptör (GPCR) aktivasyonundaki en erken olaylardan biridir. Bu protokol, radyo-etiketli GTP analoğu, [35S] guanozin-5'-O- (3-tio) trifosfatın ([35S] GTPyS) bağlanmasını izleyerek spesifik GPCR-ligand etkileşimlerinin farmakolojik olarak nasıl karakterize edildiğini açıklamaktadır. Ilginin bir ligandına cevap.

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

Rhipicephalus microplus bağırsak dokusundan epitel hücrelerini izole etmek için modifiye bir yoğunluk santrifüj gradyan tabanlı metodoloji kullanıldı. Yüzeye bağlı proteinler, biyotinlenmiş ve streptavidin manyetik boncuklarla arıtılmış uygulamalarda kullanılmak üzere saflaştırılmıştır.

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

Bu yöntem klonlama, ifade ve yapısal tayini için rekombinant Nsa1 arınma x-ışını kristalografisi ve küçük açı X-ray saçılma (SAXS) tarafından açıklar ve diğer proteinlerin hibrid yapısal analiz için geçerlidir her ikisi de içeren düzenli ve düzensiz etki alanları.

X-ışını kristalografisi Nsa1 S. Cerevisiae üzerinden yapılandırılmamış bölgelerinde modellemek için küçük açı X-Ray saçılma ile birleştirerek

Keşfedin sentetik kimyasal dönüştürücülerle proteinler arası yapay sinyal iletimini. Bu yöntem, PDGF aptameri ve GST inhibitörü kullanarak yeni tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru

Daha fazla video keşfet