Sinyal Proteinlerin Fonksiyonu taklit: Yapay Sinyal İletimi Tedavisi Doğru
29 Eylül 2016
Doğal olarak ilgisiz proteinler arasındaki iletişimi indükleyebilecek sentetik 'kimyasal dönüştürücüler' geliştirmek için kılavuzlar sunuyoruz. Ek olarak, bir büyüme faktörünün detoksifiye edici bir enzimi aktive etmesini ve sonuç olarak bir antikanser prodoksifiye edici ilacın bölünmesini düzenlemesini sağlayan spesifik bir 'dönüştürücünün' sentezlenmesi ve test edilmesi için ayrıntılı protokoller sunulmaktadır.
Bu deneyin genel amacı, sentetik bir kimyasal dönüştürücü tarafından indüklenen iki protein arasındaki doğal olmayan iletişimi spektroskopik olarak takip etmektir. Doğada bulunmayan sinyal iletim yollarını gerçekleştirebilecek sinyal proteinlerinin sentetik analoglarının geliştirilmesi olasılığını gösterecektir. Ortak spektrofotometre ile doğal olmayan proteinden proteine iletişimi takip etme yeteneği, yapay kimyasal dönüştürücülerin işlevini geliştirmeye ve iyileştirmeye yardımcı olabilir ve bizi yapay sinyal iletim terapisine ulaşmaya daha da yaklaştırabilir.
Kimyasal dönüştürücü, trombositten türetilmiş bir büyüme faktörü veya PDGF aptamerinden oluşur. İki değerlikli bir etakrinik amid GST inhibitörü, bir florofor ve bir söndürücü. Kimyasal dönüştürücünün sentezi bu videoda gösterilmeyecektir.
Ancak metin protokolünde açıklanmıştır. Kimyasal dönüştürücünün çalışma prensipleri burada gösterilmiştir. Kimyasal dönüştürücü, iki EA grubu enzimlerin aktif bölgelerini bağladığında GST'nin enzimatik aktivitesini inhibe eder.
PDGF'nin eklenmesi, PDGF kimyasal dönüştürücü kompleksinin oluşumuna yol açar. Bu, dönüştürücü-GST etkileşimini bozar, bu nedenle GST enzimatik aktivitesini geri yükler. Değiştirilmemiş bir PDGF aptamerinin aşağıdaki ilavesi, kimyasal dönüştürücüyü serbest bırakır ve enzimi yeniden inhibe etmesine izin verir.
PDGF ile GST aktivitesinin kontrolünü incelemek için deneylere başlamadan önce, kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun. Standart bir protokol olarak yeni bir deney oluşturun. Prosedür Ayarları penceresini açmak için Prosedür'ü seçin.
Pencerenin üst tarafındaki açılır listede, plaka üreticisine göre 384 Plaka Tipini seçin. Soldaki menüden Oku'yu seçin. Algılama yöntemi için absorbans'ı seçin.
ve okuma türü için uç nokta. Dalga Boyu penceresinde 340 nanometre yazın. Tam Plaka'yı seçin ve ölçülecek kuyuları seçin.
Ardından Oku penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Soldaki menüde Kinetiği Başlat'ı seçin. Çalışma Süresi'ni 10 dakika olarak ayarlayın.
Minimum Aralıklar seçeneğini seçin. Ardından Kinetik penceresini kapatmak için Tamam'a tıklayın. Okuma Satırı'nı Kinetik Ölçüm'e sürükleyin.
Doğrula düğmesini ve ardından Tamam düğmesini seçin. Denemeyi kaydedin. Oynat düğmesini seçin.
Bir iletişim kutusu görünecektir, ancak kinetik ölçümü başlatmaya hazır olana kadar Tamam düğmesini seçmeyin. Plaka okuyucu kurulduktan sonra, bir sonraki adım, kimyasal dönüştürücü ve PDGF varlığında GST aktivitesini ölçmek için numuneleri hazırlamaktır. Dört PDGF konsantrasyonunu üç kopya halinde test etmek için, her biri 3.25 mikrolitre kimyasal dönüştürücü ve 3.25 mikrolitre GST M-1 içeren dört numune hazırlayın.
Her numuneye sırasıyla sıfır, 1.2, 2.4 veya 4.9 mikrolitre PDGF ekleyin. Ardından, toplam hacmi 130 mikrolitreye çıkarmak için her numuneye uygun hacimde tahlil tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
10 dakika sonra, her numuneden 40 mikrolitreyi 384 şeffaf kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Dört numunenin her birini yalnızca aynı sıradaki tek veya çift kuyucuklara aktarın. Alt tabaka ilavesi için çoklu pipetleyici kullanımına izin vermek için.
Daha sonra, daha önce 96 oyuklu bir plakada hazırlanmış olan her bir alt tabakadan 10 mikrolitreyi her numuneye hızlı bir şekilde eklemek için 12 kanallı bir çoklu pipetleyici kullanın. Kabarcıkları önlemek için hızlı ama nazikçe karıştırın. Plakayı hemen plaka okuyucuya yerleştirin ve iletişim kutusundaki OK düğmesini seçerek kinetik ölçümü başlatın.
Kimyasal dönüştürücünün aracılık ettiği GST aktivasyon inhibisyon döngülerini incelemek için, her biri 84.5 mikrolitre tahlil tamponu içeren beş numune hazırlayın. 3.25 mikrolitre kimyasal dönüştürücü ve 3.25 mikrolitre GST M1-1. Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin.
Birinci numuneye 3.65 mikrolitre tahlil tamponu ve iki, üç, dört ve beş numuneye 3.65 mikrolitre PDGF ekleyin. Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir ve ikinci numunelere 3.12 mikrolitre tahlil tamponu ve üç, dört ve beşinci numunelere 3.12 mikrolitre PDGF aptamer ekleyin.
Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir, iki ve üç numunelere 24.4 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ve dördüncü ve beşinci numuneler için 24.4 mikrolitre PDGF.
Oda sıcaklığında üç dakika inkübe edin. Bir ila dört numuneye 7.8 mikrolitre tahlil tamponu ve beşinci numuneye 7.8 mikrolitre PDGF aptamer ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.
Numuneleri 384 şeffaf kuyucuklu bir plakaya aktarın. Deneyi üç nüsha halinde gerçekleştirmek ve alt tabakayı numunelere hızlı bir şekilde eklemek için. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.
Bu tahlillere başlamak için, protokol metninde açıklandığı gibi kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun. 384 şeffaf kuyucuklu bir plakanın iki oyuğunda iki numune hazırlayın. Her kuyucuk için, bir mikrolitre GST M1-1 ve bir mikrolitre kimyasal dönüştürücüyü 38 mikrolitre tahlil tamponunda karıştırın.
İki kuyu arasında boş bir kuyu bırakın. 12 kanallı bir çoklu pipetleyici kullanarak, her bir oyuğa hızlı bir şekilde 10 mikrolitre alt tabaka ekleyin. Kabarcıkları önlemek için nazikçe ve hızlı bir şekilde karıştırın.
Plakayı hemen okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın. Plaka okuyucu 3,5 dakika sonra açıldığında, kuyucuklardan birine hızlı bir şekilde 1,125 mikrolitre PDGF ekleyin, hafifçe karıştırın ve kalan kinetik ölçümler için plakanın okuyucuya tekrar girmesine izin verin. Bu deney için numuneleri hazırlamadan önce, protokol metninde açıklandığı gibi kinetik ölçüm için plaka okuyucuda deneysel bir prosedür oluşturun.
Nitrik oksit üretimini ölçmek için bir nitrit/nitrat kolorimetrik kiti kullanılacaktır. 96 oyuklu bir plakada, ilk sıraya oyuk başına 50 mikrolitre tahlil tamponu dağıtın. İkinci sıraya oyuk başına 70 mikrolitre Griess Bir Reaktif.
Ve üçüncü sıraya oyuk başına 70 mikrolitre Griess İki Reaktif. Her biri 4.8 mikrolitre kimyasal dönüştürücü içeren dört numune hazırlayın. Birini örneklemek için 155.2 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.
İkinci örneğe göre 3,2 mikrolitre GST M1-1 ve 152 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Üçünü örneklemek için 9.6 mikrolitre PDGF ve 145.6 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ve dördü örneklemek için 3.2 mikrolitre GST M1-1, 9.6 mikrolitre PDGF ve 142.4 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin.
Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Deneyi üç kopya halinde gerçekleştirmek için 384 şeffaf kuyucuklu bir plakada oyuk başına 50 mikrolitre numune dağıtın. Alt tabaka ilavesi için çoklu pipetleyicinin kullanılmasına izin vermek için numuneleri yalnızca aynı hattaki tek veya çift kuyucuklara dağıtın.
Her numuneye 0.54 mikrolitre JS-K ön ilaç ekleyin. Her numuneye hızlı bir şekilde 10 mikrolitre glutatyon çözeltisi ekleyin ve kabarcıkları önlemek için nazikçe ve hızlı bir şekilde karıştırın. Plakayı okuyucuya yerleştirin ve kinetik ölçümü başlatın.
Kinetik ölçümden hemen sonra, her numuneden 50 mikrolitreyi, tahlil tamponu ile 96 kuyulu plakanın ilk sırasının her bir oyuğuna aktarın. Daha sonra, plakanın ikinci sırasının her bir oyuğundan 50 mikrolitreyi plakanın ilk sırasının kuyularına aktarın. Ve plakanın üçüncü sırasından plakanın ilk sırasının kuyularına kuyu başına 50 mikrolitre.
Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ışıktan koruyarak inkübe edin. Absorbansı 550 nanometrede ölçmeden önce. Kimyasal dönüştürücü olmadan ve kimyasal dönüştürücü ile GST aktivitesinin ölçülmesi, kimyasal dönüştürücünün GST aktivitesini inhibe ettiğini gösterdi.
GST, GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine artan PDGF konsantrasyonlarının eklenmesiyle yeniden etkinleştirilir. PDGF'nin ardışık eklemeleri ve GST-kimyasal dönüştürücü kompleksine değiştirilmemiş bir PDGF aptameri, PDGF ve GST arasındaki iletişimin geri dönüşümlü olduğunu ortaya koydu. PDGF'nin GST dönüştürücü kompleksine eklenmesi, substratların eklenmesinden 3,5 dakika sonra GST aktivitesinde hızlı bir artışa neden oldu.
GST, PDGF ve kimyasal dönüştürücü karışımına bir PDGF aptamer eklenmesi, GST aktivitesinde bir azalmaya neden olurken. Bu sonuçlar, sistemin ortamındaki değişikliklere gerçek zamanlı olarak yanıt verdiğini göstermektedir. Daha sonra, bu sistemin ön ilaç aktivasyonunu kontrol etme yeteneği, toksik nitrik oksit salmak için GST tarafından aktive edilen bir anti-kanser ön ilacı olan JS-K kullanılarak araştırıldı.
Kimyasal dönüştürücüye JS-K eklenmesi ve GST ve PDGF'nin farklı kombinasyonları üzerine salınan nitrik oksit miktarlarının ölçümleri, yalnızca hem GST hem de PDGF'nin varlığının JS-K'yi aktive ettiğini doğruladı. Tüm bunlar, sentetik bir ajanın, doğal enzim ortağı olmayan Glutatyon S-Transferazın katalitik aktivitesini tetiklemek için bir büyüme faktörünü nasıl sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu sınıfın gelecekteki biyomimetikleri, hücrelerin çevresel sinyallere tepkisini değiştirmek veya onlara yeni özellikler kazandırmak için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, birbiriyle ilişkisiz proteinler arasındaki iletişimi kolaylaştıran sentetik 'kimyasal transdüserlerin' geliştirilmesine yönelik kılavuzlar sunmaktadır. Çalışmada, bir büyüme faktörü aracılığıyla detoksifiye eden bir enzimi aktive eden spesifik bir transdüserin sentezlenmesi ve test edilmesine yönelik protokoller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein Mühendisliği
- Sinyal İletimi
Arka Plan
- Proteinler arasında doğal olmayan iletişim, sentetik transdüserler aracılığıyla indüklenebilir.
- Sinyal proteinlerinin sentetik analoglarının geliştirilmesi, yeni terapötik stratejiler için büyük önem taşımaktadır.
- Doğada bulunmayan sinyal iletim yolakları bu yaklaşım sayesinde araştırılabilir.
- Bu etkileşimleri takip etmek için yaygın spektrofotometreler kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Protein iletişiminde sentetik kimyasal dönüştürücülerin uygulanabilirliğini göstermek.
- Yapay kimyasal dönüştürücülerin işlevini geliştirmek.
- Yapay sinyal iletim terapisini ilerletmek.
Kullanılan Yöntemler
- Bir PDGF aptamerinden oluşan kimyasal bir transduserin sentezi.
- Bivalent bir etakrinik amit GST inhibitörünün kullanımı.
- Spektroskopik analiz için bir florofor ve bir sönümleyicinin dahil edilmesi.
- Protein etkileşimlerini spektroskopik olarak takip etmek için deneysel kurulum.
Ana Sonuçlar
- Doğal olmayan protein iletişiminin başarılı bir şekilde gösterilmesi.
- Sentetik dönüştürücüler kullanarak yeni terapötik stratejiler geliştirme potansiyeli.
- Sinyal iletim yolaklarının mekanizmalarına dair içgörüler.
- Bu alandaki gelecek araştırmalar için protokollerin oluşturulması.
Sonuçlar
- Sentetik kimyasal transduserler, protein etkileşimlerini etkili bir şekilde yönetebilir.
- Bu araştırma, sinyal iletim tedavisinde yenilikçi yaklaşımların önünü açmaktadır.
- Bu sentetik sistemleri optimize etmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Bu çalışma, sentetik kimyasal dönüştürücülerin doğal olmayan protein-protein iletişimini nasıl aracılık edebileceğini göstererek, yapay sinyal iletim terapisi için bir temel oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, yerli düzenleyici mekanizmaları baypas eden ortogonal sinyal yolları oluşturarak, hedef doğrulamanın mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Bu tür sistemler, onkoloji ve diğer hastalık alanlarındaki ön ilaç aktivasyon stratejileri için kullanılabilecek enzim aktivitesinin hassas zamansal kontrolüne izin vererek, preklinik modellerde öngörücü değer sunar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Doğal olmayan partnerler arasında indüklenebilir ve geri döndürülebilir protein iletişimi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Genetik manipülasyona gerek kalmadan hedef etkileşimini ve yolak modülasyonunu değerlendirmek için ayarlanabilir bir sistem sunar.
- Tahminleyici Değer: Terapötik ligandlara yanıt olarak enzim aktivitesinin doza bağlı geri kazanımını nicelleştirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Standart spektrofotometrik tespit kullanarak protein etkileşim dinamiklerinin kantitatif, gerçek zamanlı okumalarını oluşturur.
- Operasyonel Değer: Kinetik analizler için yüksek yoğunluklu plaka okuyucularla uyumlu, tekrarlanabilir bir deney formatı oluşturur.
- Ölçeklenebilirlik: Tanımlanmış reaktif titrasyonu ve ardışık ekleme protokolleri aracılığıyla çoklu koşul testlerini kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Transduser aracılı GST aktivitesinin sitotoksik yük salınımını kontrol ettiği ön ilaç aktivasyonuna yönelik doğrudan uygulanabilirliği gösterir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Sinyal çıktısının hem transdusere hem de ilgili liganda bağlı olduğunu doğrulayarak yanlış pozitif aktivasyon risklerini azaltır.
- Preklinik Model Uygunluğu: İn vivo doğrulamadan önce, hastalıkla ilgili sistemlerde yapay sinyal devrelerinin değerlendirilmesini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef bağlanmasını fonksiyonel okumalarla ilişkilendiren kimyasal olarak indüklenebilir bir anahtar sağlayarak erken keşif iş akışlarına entegre olur ve hit doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna geçişi mümkün kılar.
- Keşif Biyolojisi: Ligand kaynaklı transduser konformasyonel değişikliği yoluyla enzim aktivitesinin harici kontrolüne olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Gerçek zamanlı protein iletişim olaylarını yansıtan standartlaştırılmış kinetik ölçümler aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Farklı deneysel koşullar genelinde sinyalizasyon dinamiklerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan zaman çözünürlüklü aktivite verileri üretir.
- Translasyonel Araştırma: Ön ilaç aktivasyonu yoluyla hedef etkileşimini fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek, sinyal sadakatine dayalı karar verme süreçlerini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: PDGF-GST dışındaki çeşitli protein çiftlerine uygulanabilen, platformdan bağımsız bir transduser tasarım çerçevesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sinyal ilelemini endojen yolak gürültüsünden ayırarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış reaktif oranları, inkübasyon süreleri ve deteksiyon parametreleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Karmaşık terapötik formatlara yatırım yapmadan önce mekanistik fizibiliteyle ilgili erken değerlendirme imkanı sağlayarak sermaye verimliliğini geliştirir.
- Portföy Etkisi: İndüklenen sinyalizasyon olaylarının özgünlüğünü ve tersine çevrilebilirliğini nicelleştirerek riskten arındırılmış geliştirme süreçlerine veri sağlar.
Uygulama Hususları
- Transduser bileşenlerini optimize etmek için protein mühendisliği, aptamer tasarımı ve enzim kinetiği konularında uzmanlık gerektirir.
- 340 nm ve 550 nm dalga boylarında kinetik absorbans ölçümleri yapabilen plaka okuyuculara erişime bağlıdır.
- Verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için reaktif hazırlama ve inkübasyon protokollerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Transduser tasarımının, farklı bağlanma kinetikleri veya sterik kısıtlamaları olan yeni protein çiftlerine uygulanmasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Transduser stabilitesi, potansiyel hedef dışı etkileşimler ve sinyal doygunluğunu önlemek için dikkatli titrasyon gerekliliği gibi pratik sınırlamaları kapsar.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Synthesis and Operating Principles of the 'Chemical Transducer'
1:51
Setting Up the Plate Reader for Kinetic Measurement
3:26
Measuring GST Activity in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
4:59
Evaluating GST Activation/Inhibition Cycles Mediated by the 'Chemical Transducer'
6:37
Evaluating the Real-time Effect of PDGF Addition
7:42
Measuring JS-K Prodrug Activation by GST in the Presence of the 'Chemical Transducer' and PDGF
10:16
Results: 'Chemical Transducer' Induces Artificial Communication Between PDFG and GST
11:53
Conclusion
