Name: Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Öğrenin, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu kullanarak HDL'den küçük RNA izolasyonu ve kantifikasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyometabolik hastalıklarda biyobelirteç olarak lipoprotein küçük RNA imzalarını tanımlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'nden K.C.V. HL128996, HL113039 ve HL116263'a verilen ödüllerle desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Amerikan Kalp Derneği'nden K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 ve R.M.A. POST25710170'a verilen ödüllerle de desteklendi.

1. HDL saflaştırma (~ 5.5 gün) <ol><li> Yoğunluk-Gradient Ultrasantrifügasyon (DGUC, ~ 5 gün) <ol><li> Taze toplardamar kanından izole plazma 9 ml 100x, anti-oksidanlar, 90 uL ekleyin. </li><li> Aşama 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plazma) plazma 9 mL 0.251 gr KBr eklenerek 1.025 g / mL, 1.006 g / ml arasında KBr plazma yoğunluğunu ayarlar. tüm tuz, oda sıcaklığında çözülür ve tüpler ultrasantrifüjdeki ve tüm kabarcıklar üste çıkar sağlamak transfer edilene kadar plazma sallayın. </li><li> Bend ucundan 90 ° 1 cm 18 G iğne ucu, konik tarafı yukarı bakacak. Bir şırınga ve 18-gauge iğne kullanılarak, dikkatli bir plazma (Tablo 1) üzerinde bindirme çözüm # 1 3 mL yerleştirin. NOT: bükük iğne tüm VLDL / IDL, LDL sağlar ve HDL kalıbı ile karışmadan kaldırılır. </li><li> tüp ve dikkatli bir şekild üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakarak üstünde kabarcıklar çoğunluğu, kaldırLly SW-40Ti kova tüpleri yerleştirin. </li><li> dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam tersi kova (kova + kapak) ile denge: # 5 ve # 3 # 6 # 4, # 2 # 1. NOT: Bu kovalar dengeli ve her zaman uyumlu olması gerekir. </li><li> (Malzeme Listesi) ultrasantrifüjdeki rotor yerleştirin. bir # 4, ara fren 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın. Bu 4 ° C&#39;de saklanabilir VLDL / IDL kısmını oluşturmaktadır ° C veya -80 ° C. </li><li> VLDL / IDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan 7 mL toplamak ve bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Bindirme çözüm # 2 (Tablo 1) ile 9 mL numune hacmi getirin. </li><li> 1.080 g 1.025 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr ile ml kullanarak9 ml numune ya da 0,0828 g yaklaşık 0.746 gr KBr / numunenin ml KBr. Tüm KBr (yaklaşık 20 dakika) içinde çözülür ve sağlanması kabarcıklar üstüne yükselir ise tüp ultrasantrifüjdeki aktarmak kadar yavaşça örnek sallayın. </li><li> Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 3. 3 mL yerleştirin. tüpün üstüne menisküs 3 mm boşluk - 2 bırakın. </li><li> tüpün üst kısmında kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. </li><li> dengesine (kapakları) her kova tartılır ve tam 1.1.5 gibi, karşıt kova + kapaklı denge. </li><li> ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). bir # 4, ara fren 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatle bir şırınga kullanarak bindirmenin üst tabakadan 2 mL çıkarın ve olmaknt iğne. Bu 4 ° C&#39;de saklanabilir LDL fraksiyonu olacaktır ° C veya -80 ° C. </li><li> LDL fraksiyonu çıkardıktan sonra, numune (plazma) kalan yaklaşık 7 ml toplamak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine yerleştirin. 1.080 g / ml solüsyon # 4 (Tablo 1) 9 mL kadar örneği (plazma) hacminin getirin. </li><li> 1.30 g 1,080 g / ml örnek yoğunluğunu ayarlayın / KBr örneğin her mL için KBr 9 mL örnek (plazma) içinde 3.33 g KBr kullanarak ya da 0.37 g ml. Kaya veya hafifçe tüm KBr (tuz) eriyene kadar numuneyi ajitasyon ve tüp ultrasantrifüjdeki aktarın. </li><li> Şırınga ve iğne ile, dikkatli bir şekilde örnek (Tablo 1) bindirme çözeltisi 5. 3 mL yerleştirin. </li><li> tüpün üstüne menisküs 2- 3 mm boşluk bırakarak, tüpün üstünde kalan kabarcıkların çoğunluğu kaldırmak ve dikkatle SW-40Ti kova dolu ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. </li><li> (Her kova tartılırdenge üzerine kapaklar), ve tam ile 1.1.5 gibi karşıt kova + kapaklı denge. </li><li> ultrasantrifüjdeki Rotoru yerleştirin (Malzeme listesi bakınız). Bir 4. fren 4 ° C &#39;de 48 saat boyunca 274.400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle kovalar rotor kova ve tüpler kaldırın. </li><li> Dikkatli bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanılarak bindirme üst tabakasının yaklaşık 2 mL çıkarın. Bu, 4 ° C ya da -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir HDL fraksiyonu vardır. NOT: DGUC HDL ardından yüksek tuz çözüm kaldırmak için diyalize edilebilir. </li><li> kapalı bir diyaliz kovanı (10.000 mw cut-off) toplanan HDL fraksiyonu koyun ve 1 L 1x PBS gecede dialyze, diyaliz. Değişim diyaliz tamponu (1x PBS) 24 saat boyunca 3 kez. Manyetik bir karıştırma-bar ile PBS nazik pertürbasyon diyaliz artıracaktır. </li><li> Bir BCA yöntemi 8 kullanarak DGUC-HDL protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol></li><li> Hızlı protein sıvı chromatography (FPLC) ya da boyut-dışlama kromatografisi (~ 6 saat) <ol><li> 0.22 mikron mikro santrifüj filtre ile 500 mcL DGUC-HDL (toplam protein) 1.2 mg Filtre enjeksiyondan hemen önce, (Malzeme listesi bakınız). Not: 0.22 um&#39;lik bir filtreden önce 0.45 um mikro santrifüj filtre ile DGUC HDL numunenin ilave filtreleme Bazı örnekler için gerekli olabilir. </li><li> , Süzülmüş DGUC-HDL örnek toplamak FPLC (dolgu) enjeksiyon şırınga yükleyin ve şırınga hiçbir kabarcıklar FPLC içine enjekte önce olmamasına dikkat edin. </li><li> 2.6 MPa bir basınç sınırı 0.3 mL / dak FPLC akış hızını ayarlayın. enjeksiyon örnek önce tampon 0.2 kolon hacmi (yaklaşık 15 mL) ile sütun dengelenmesi. FPLC (enjeksiyon döngü mü?) Aracı haline tampon 3 mL numune enjekte edilir ve çalışma başlatmak. 72 fraksiyonların toplam 1.5 ml&#39;lik kesirleri toplayın. </li></ol></li></ol> 2. Yüksek verim Küçük RNAArdışık (sRNAseq, ~ 9 gün) <ol><li> RNA İzolasyon (~ 1 gün) <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak kolorimetrik bir kit kullanılarak total kolesterol seviyelerinin belirlenmesiyle DGUC HDL tekabül FPLC fraksiyonlar tanımlar. DGUC-HDL içeren 7 FPLC kesirler - Bu FPLC set-up kullanarak, 6 bulmak için bekliyoruz. </li><li> DGUC HDL FPLC fraksiyonlardan tüm hacmi (yaklaşık 8 -1 0 ml Havuz 1.45 mL fraksiyonunun hacim) toplayın ve kullanılarak konsantre 10 kDa mw kesim santrifüj filtre üniteleri, 1 saat boyunca 4000 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de veya HDL konsantre kadar yaklaşık 100 ml. </li><li> HDL konsantre toplayın ve BCA yöntemi 8 kullanarak HDL total protein konsantrasyonu ölçmek. </li><li> kümesindeki her örnekten aliquoted edilebilir en fazla 1 mg HDL toplam proteinin en yüksek konsantrasyon, belirleyin. Örneğin, her bir örnek için, HDL toplam proteinin aynı miktarda RNA izole eder. </li><li> kullanarak RNA izolasyonu gerçekleştirmekdeğiştirilmiş bir protokol (Malzeme listesi bakınız). <ol><li> 1 dakika boyunca fenol parçalama reaktifi (Malzeme listesi bakınız) örnek ve vorteks 10x hacim ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> kloroform (adım 2.1.5.1 kullanılan fenol liziz reaktifi hacminin% 20) ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır. </li><li> 3 dakika - 2, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> soğutulmuş bir santrifüj içinde 4 ° C&#39;de 12,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj. </li><li> interfaz kaçınarak yeni bir tüpe, üst sulu faz transfer. </li><li> 1 dakika için sulu faz ve vorteks% 100 etanol 1.5x hacim. </li><li> en az 1 saat ya da gece boyunca -80 ° C&#39;de saklayın örnekleri. </li><li> sağlanan küçük sütunlar kullanılarak RNA izolasyon protokolü ile devam edin. </li><li> 30 mL RNaz içermeyen H2O ile elüte İlk 2 dakika süreyle düşük hızda (2000 xg) frit, spin doğrudan 15 uL H 2 O ekleyin veDaha sonra 1 dakika boyunca yüksek hızda (max) dönerler. H 2 O ek 15 ul ile bu adımı tekrarlayın </li></ol></li><li> Hemen -80 ° C&#39;de Srna kütüphane nesil ya da mağazaya geçin. </li></ol></li><li> Kütüphane Oluşturma (~ 6 saat) <ol><li> Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için bir değişiklik ile, üretici talimatlarına uygun olarak, Srna Kütüphane oluşturma kiti protokolü kullanılarak Srna cDNA kütüphaneleri hazırlayın. <ol><li> 0.5 mL DNaz / RNaz ücretsiz H 2 O içeren buz üzerinde PCR MasterMix hazırlayın, 15 uL PCR Mix (PML) ve 1 uL RNA PCR Primer (RP1) numune başına (hata pipetle için ek bir% 10 dahil). </li><li> PCR 16.5 uL her (cDNA) örnek karıştırın ekleyin. </li><li> çoğullama için her bir örnek için bir dizin / barkod numarası atamak ve örnek (ilgili numaraya) 1 uL PCR Primer Endeksi ekleyin. </li><li> mikrofuge&#39;de kullanarak hızlı bir spin gerçekleştirin. NOT: Toplam hacim gerekirŞimdi örnek başına 30 uL olacak. </li><li> Tablo 2 ve 3&#39;te açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu için döngü şartları yerine. </li></ol></li></ol></li><li> Boyut Srna Kütüphane Adaptörü çıkarmak için seçin: Adaptörler (~ 1.5 saat) <ol><li> Hedef: aşağıdaki boyut parametreleri ile üreticinin talimatlarına göre otomatik DNA boyutu seçici kullanarak kütüphane boyut seçimi gerçekleştirmek 156 bp Başlangıç: 135 bp, End: 177 bp, Menzil Flag: Geniş. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0.5 saat) <ol><li> temizlemek boyut seçimine, üreticinin talimatlarına uygun olarak Srna cDNA. </li><li> Temiz Zehir ve 2 x 7 uL DNaz / RNaz ücretsiz H2O ile Srna cDNA konsantre </li></ol></li><li> Ölçmek ve değerlendirmek Srna cDNA Library Verim ve Kalite (~ 1 saat) <ol><li> İmalat başına (Malzeme Listesi) bir Bioanalyzer üzerinde yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan Srna cDNA kütüphanesi kalitesini ve boyutunu değerlendirmekÜrer talimatları. </li><li> üreticinin talimatlarına göre, yüksek hassasiyetli DNA tahlili (Malzeme Listesi) kullanarak bireysel Srna cDNA kütüphanesi konsantrasyonlarını ölçmek. NOT: Bu akış hücresi mümkünse aynı kulvarda çalıştırılacak farklı endeksleri tüm örnekleri olması tavsiye edilir. Birden fazla şeritli gerekli ise, uygun bir durumda, kontrol numuneleri karıştırın. </li></ol></li><li> Yüksek verimli Srna Dizi (~ 7 gün) <ol><li> Havuz bireysel denk molar konsantrasyonlarda dayalı Srna kütüphaneleri endeksli. </li><li> 2.5.2 - Ekran Bioanalyzer yüksek hassasiyetli DNA çip kullanan ve 2.5.1 gibi kütüphane DNA konsantrasyonunu belirlemek kalite Srna kütüphaneleri toplanmış. </li><li> üreticinin talimatlarına (Malzeme listesi) göre dizi kütüphanesi qPCR Niceleme Kiti kullanılarak uygun sıralama derinliğini sağlamak için bağdaştırıcı içeriği kantitatif PCR (qPCR) uygulayın. </li><li> Tek bir okuma kullanarak sıralamayı gerçekleştirmek, 50 b25 M üreticinin talimatlarına göre, / örnek okur - p protokolü yaklaşık 20 derinliğe ulaşmak için. </li></ol></li></ol> 3. Veri Analizi (~ 1 gün) <ol><li> çoklaması örneklerin önişlem ham fastq dosyaları (Malzeme listesi) kullanım kılavuzu talimatlarına göre, bcl2fastq2 kullanın. </li><li> Adaptörleri 9 Döşeme ve kaldırmak için Cutadapt kullanın &lt;okur kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre uzunluğu 16 nükleotid (NTS). </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, NGSPERL çerçevesinde removeSequenceInFastq işlevini kullanarak ve adaptör carry-over (CTACAGTCCGACGATC): stop çözüm dizisi de dahil olmak üzere Srna kütüphaneler, mevcut kirlilik dizileri (CCACGTTCCCGTGG STP) sökün. </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, FastQC Sayısal Bilimler Merkezi (CQS) araçlarını kullanarak kalite kontrol ölçümleri gerçekleştirin. </li><li> &quot;Özdeş&quot; olmayan gereksiz liste oluşturmak (çökme redunda okurnt okur) ve kayıt kopya sayıları kullanım kılavuzunun talimatları Malzeme (Liste) uyarınca, CQSTools kullanarak. </li><li> Kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) uyarınca, (-a -m 100 --best --strata -v 1 seçenekleri) hizalayın Bowtie1.1.2 1 uyumsuzluğu izin kullanarak insan genomuna okur. </li><li> hizalama, sayma okuma gerçekleştirmek ve kullanım kılavuzu talimatına göre, NGSPERL kullanarak özetleme görevleri sonuçlanır. </li><li> Bir tablo dosyasına ihraç sayım tabloya dönüştür. </li><li> Başına Haritalı miRNA (RPMM) okur olarak o sınıfın (örn miRNA&#39;lar sayısı okur) ve rapor sinyalleri için okur Normale toplam sayısı belirli bir sınıfın (örn miRNA&#39;ların) okur. (Örneğin, RPMM = (miR-X / miRNA toplam # * 1000000) okur). </li><li> düşük seviye ve üst düzey diferansiyeli için yazılımı içine jenerik tek renk teknolojisi olarak girdi normalize sayım tablosu kullanım kılavuzu talimatlarına (Malzeme Listesi) göre analiz eder. NOT: Şu anda, hiçbir iyi karakterize temizlik genler vardır / SRNHDL-Srna gelince. Bir başak-kontrol kullanılabilir, ancak sorunlu olabilir. toplam protein giriş veya hacim HDL normalize tavsiye edilir. En önemlisi, gerçek zamanlı PCR veya kantitatif PCR kullanılarak miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek için çeşitli stratejiler biri tarafından sıralama sonuçlarını doğrulamak için tavsiye edilir. </li></ol>

<ol><li>Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mining+diverse+small+RNA+species+in+the+deep+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome.</a> Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)"> MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tRNA-derived+small+RNAs+in+the+global+regulation+of+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing.</a> RNA. 16, 673-695 (2010).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+terminal+and+asymmetric+processing+of+small+RNAs+from+rRNAs%2C+snoRNAs%2C+snRNAs%2C+and+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).</li>
<li>Maute, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-derived+microRNA+modulates+proliferation+and+the+DNA+damage+response+and+is+down-regulated+in+B+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).</li>
<li>Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+are+transported+in+plasma+and+delivered+to+recipient+cells+by+high-density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins.</a> Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+pre-processing+Illumina+next-generation+sequencing+short+read+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences.</a> Source Code Biol Med. 9, 8(2014).</li>
<li>Vickers, K. C., Remaley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+carriers+of+microRNAs+and+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication.</a> Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).</li>
<li>Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+exosome+isolation+and+characterization%3A+evaluation+of+ultracentrifugation%2C+density-gradient+separation%2C+and+immunoaffinity+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods.</a> Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).</li>
<li>Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cell+movement+through+tissues+is+controlled+by+exosome+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion.</a> Nat Commun. 6, 7164(2015).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+RT-PCR+inhibition+observed+in+heparinized+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens.</a> Biotechniques. 23, (1997).</li>
<li>Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparinase+treatment+of+RNA+before+quantitative+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR.</a> Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).</li>
<li>Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulants+interfere+with+PCR+used+to+diagnose+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis.</a> J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).</li>
<li>Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heparin+on+polymerase+chain+reaction+for+blood+white+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells.</a> J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+value+of+quantitative+PCR-based+viral+burden+analysis+for+eight+human+herpesviruses+in+pediatric+solid+organ+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients.</a> J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).</li>
<li>McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+the+effects+of+EDTA+and+citrate+anticoagulants+on+platelet+count+and+mean+platelet+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume.</a> Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).</li>
<li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circ Res. 107, 677-684 (2010).</li>
<li>Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling%3A+approaches+and+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling: approaches and considerations.</a> Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).</li>
<li>Kirschner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haemolysis+during+sample+preparation+alters+microRNA+content+of+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma.</a> PLoS One. 6, e24145(2011).</li>
<li>Kannan, M., Atreya, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+profiling+of+human+red+blood+cells+during+storage+for+52+selected+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs.</a> Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+erythrocyte+microRNA+expression+in+sickle+cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases.</a> PLoS One. 3, e2360(2008).</li>
<li>Balzano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+Stability+in+Frozen+Plasma+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">miRNA Stability in Frozen Plasma Samples.</a> Molecules. 20, 19030-19040 (2015).</li>
<li>Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+plasma+lipoproteins+by+density-gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation.</a> Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).</li>
<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, yüksek derecede saf HDL, yüksek verimli sekanslama ya da gerçek-zamanlı PCR ile miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek için tasarlanmıştır. Herhangi bir yaklaşımla olduğu gibi, özel durumlar arındırıcı HDL ve RNA sürecinde her adımda verilen ve daha sonra sRNAs ölçülmesi gerekir. Bu protokol, plazma ≥ 2 mL başlayarak projeler için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yüksek kalitede RNA analizleri başarılı afinite kromatografisi kullanılarak, insan ya da fare plazması az 80, uL saflaştırılmış HDL ile tamamlanabilir; An...

Ekstrasellüler kodlamayan küçük RNA&#39;lar (sRNAs) hastalığı biyomarkerlerin ve potansiyel terapötik hedeflerin yeni bir sınıfını temsil ve muhtemel hücre-hücre iletişimi 1 kolaylaştırır. Srna en çok çalışılan tip uzunluğu yaklaşık 22 NTS ve daha uzun habercisi formları ve primer transkript 2 işlenir mikroRNAlar (miRNA) &#39;dir. miRNA&#39;lar transkripsiyonel-sonrası protein çevirisinin ve mRNA degradasyon 2 indüksiyonu bastırılması vasıtasıyla gen ekspresyonunu düzenlemek için gösterilmiştir. Bununla birlikte, miRNA&#39;ların sRNAs birçok türleri sadece biri; sRNAs üst tRNA&#39;ların (tRNA türetilmiş sRNAs TDR), küçük nükleer RNA (Srna türetilmiş sRNAs, sndRNA), küçük çekirdekçik RNA&#39;lar (snoRNA türetilmiş sRNAs, snRNA), ribozomal RNA klivaj edilebilir (sRNAs RDR rRNA türetilmiş ) Y RNA&#39;lar (yDR) ve diğer çeşitli RNA&#39;lar 1. Bu yeni sRNAs birkaç örnek miRNA&#39;ların benzer işlev bildirilmiştir; Ancak, biyolojik fugen düzenlemesi roller 3-6 olasılığı olmasına rağmen, bu sRNAs birçok nctions tespit edilmesi gerekmektedir. İlginç olan, miRNA&#39;ların ve diğer sRNAs tükürük, plazma, idrar, safra içeren hücre dışı akışkanlar içinde stabil bir şekilde yer almaktadır. Ekstrasellüler sRNAs olasılıkla ekstrasellüler veziküllerin (EV), lipoproteinler ve / veya hücre dışı Ribonükleoprotein kompleksleri ile dernek aracılığıyla RNases korunur. Daha önce, bu lipoproteinlerin, yani, yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) plazma 7 taşıma miRNA&#39;lar bildirilmiştir. Bu çalışmada, HDL ardışık yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme yöntemi (DGUC), hızlı protein sıvı kromatografi (boyut dışlama kromatografisi, jel filtrasyon, FPLC) ve afinite kromatografisi (anti-apolipoprotein Al (apoA-l) imüno kullanılarak izole edildi ) 7. Gerçek zamanlı PCR bazlı, düşük yoğunluklu diziler ve bireysel MiRNA analizlerine kullanarak MiRNA düzeylerde HDL üzerindeki sayısal iyileşmesi izole edildisenin ve hiperkolesterolemik konular 7. Bu yaklaşımı kullanarak, biz miRNA&#39;lar profil ve oldukça saf HDL hazırlıkları belirli miRNA&#39;lar ölçmek için başardık. 2011 yılından bu yana afinite kromatografisi HDL saflığı artırır, ancak antikor doygunluk büyük ölçüde verim sınırlar ve maliyet açısından çok pahalı olabilir belirledik. Şu anda, bizim protokol aynı zamanda aşağı akım RNA izolasyonu ve Srna ölçümü için yüksek kaliteli, HDL örnekleri üreten FPLC, ardından DGUC bir iki adımlı sıralı tandem yöntemi önerir. Nedeniyle yüksek verimli örneğin sRNAs (sRNAseq), miRNA&#39;lar sıralanması, ve diğer non-miRNA Srna sınıfların artan farkındalık son gelişmeler için, sRNAseq cari state-of-the-art miRNA ve Srna profilleme. Bu nedenle, bizim protokol miktarının miRNA&#39;lar ve sRNAseq kullanarak HDL örneklerinde diğer sRNAs önerir. Bununla birlikte, HDL izole edilmiş toplam RNA da tek tek miRNA&#39;lar ve sRNAs ölçmek veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak sRNAseq Sonuçları doğrulamak için kullanılabiliryaklaşırsa. Burada toplama, arıtma, ölçümü, veri analizi ve oldukça saf HDL-sRNAs doğrulanması için detaylı bir protokol açıklar. Bu yazıda genel amacı, insan plazmasından izole son derece saf HDL Srna ölçümü fizibilite ve süreci göstermektir.

<table><tbody><tr><td>Ultrasantrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Saf FPLC Sistemi</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Sıralı Sütunları Artırın</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (USA Scientific aracılığıyla satın alındı)</td></tr> <tr><td>Mikrofüj ve nbsp;</td><td>ABD Bilimsel</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Adaçayı Bilim</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli DNA Testi</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Kitaplığı qPCR Miktar Belirleme Kiti</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr>QuantStudio <td>4484073</td><td></td><td>ProFlex Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td></tr> 4471134 <tr><td></td><td></td>EpMotion Robot Eppendorf<td>12k Flex</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td></tr><tr><td></td><td></td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Ultra şeffaf santrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Bromür</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj filtreler 0.45 ve mikro; m</td><td>Millipore UFC30HV00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj filtreler 0.22 & m</td><td>Millipore UFC30GV00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Toplam RNA İzolasyon Kitleri</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Total Kolesterol kolometrik kiti</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>10.000 mw kesme santrifüj filtresi</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td> aracılığıyla satın alındı <td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>Fisher aracılığıyla satın alındı</td></tr><tr><td>microRNA RT kiti</td><td>Yaşam</td><td>Teknolojileri 4366597</td><td>1000 reaksiyon için</td></tr><tr><td>PCR ana karışımı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4440041</td><td>50 mL şişe</td></tr><tr><td>Pierce BCA kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Temiz ve Yoğunlaştırıcı Kiti</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>Spectrum Labs</td><td>132118</td><td>Fisher aracılığıyla satın alındı</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Yazılımı</td></tr></tbody></table>

küçük rna miktarının belirlenmesi sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar çeşitliliği (Srna) hızla genişlemektedir ve gen regülasyonu dahil olmak üzere biyolojik süreçlerde, rolleri, ortaya çıkmaktadır. İlginç olan, sRNAs ayrıca hücrelerin dışında bulunan ve sabit bir şekilde tüm biyolojik sıvılar içinde mevcut bulunmaktadır. Bu nedenle, hücre dışı sRNAs hastalığı biyomarkerler yeni bir sınıfını temsil eder ve büyük olasılıkla hücre sinyal iletimi ve hücreler arası iletişim ağları dahil olmaktadır. biyolojik olarak potansiyellerini değerlendirmek için, sRNAs plazma, idrar ve diğer sıvıları belirlenebilir. Bununla birlikte, tam endokrin sinyaller olarak hücre dışı sRNAs etkisini anlamak için, taşıyıcıları taşınması ve hücre ve dokular dışı Srna havuzları katkıda biyolojik sıvılarda (örneğin, plazma), onları korumak ve hücreler ve yetenekli dokular olduğunu belirlemek önemlidir kabul ediyor ve hücre dışı Srna kullanan. Bu hedeflere ulaşmak için, hücre-dışı taşıyıcıların yüksek derecede saf popülasyonlarının izole edilmesi için önemlidirSrna profil ve ölçümü için. Daha önce lipoproteinler, özellikle yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL), hücre ve HDL-miRNA&#39;ların arasında işlevsel microRNA (MiRNA) önemli ölçüde hastalık değişmiş taşıma olduğunu göstermiştir. Burada, detay yoğunluk-gradyan Ultrasantrifügasyon (DGUC) ve hızlı protein-sıvı kromatografisi (FPLC) ile tandem HDL izolasyonunu kullanan yeni bir protokol yüksek ikisini de kullanarak, aşağı profilleme ve miRNA&#39;ların dahil olmak üzere tüm sRNAs, ölçümü için son derece saf HDL elde etmek için -throughput sekanslama ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlar. Bu protokol HDL üzerinde sRNAs araştırılması için değerli bir kaynak olacaktır.

Bu protokol, yüksek verimli sekanslama veya gerçek zamanlı PCR (Şekil 1), son derece saf HDL sRNAs ölçümü sağlamak için birbirine bağlanmış edilmiş yöntemlerden dizisidir. fizibilite ve bu protokol etkisini göstermek için, HDL ikili DGUC ve FPLC yöntemi ile insan plazmasından saflaştırılmıştır. HDL (kolesterol dağılımı) karşılık gelen toplanan FPLC fraksiyonlar konsantre edildi ve toplam RNA HDL (toplam protein), 1 mg izole edilmiştir. Srna kütüphaneleri n = 4 sağlıklı i...

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Bu protokolün genel amacı, saflaştırılmış lipoproteinler üzerindeki küçük kodlamayan RNA'ları niceliksel olarak belirlemektir. Bu protokol, sağlıklı ve hastalıklı durumlarda lipoprotein küçük RNA imzalarının tanımlanmasının yanı sıra, lipoprotein küçük RNA'ların hastalık biyobelirteçleri veya hücreden hücreye iletiler olarak geliştirilmesi gibi lipoprotein alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hastalık veya deneysel koşullardaki küçük RNA değişiklikleri için yüksek saflıkta lipoproteinlerin analiz edilebilmesidir.Bu tekniğin etkileri, hücre dışı RNA'lar yeni bir hastalık biyobelirteçleri sınıfı olduğu ve lipoprotein küçük RNA'lar gelecek çalışmalarda ilaç hedefleri olarak heyecan verici bir potansiyel taşıdığı için kardiyometabolik hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem HDL küçük RNA'lar için tasarlanmış olsa da, çok düşük yoğunluklu ve düşük yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'lar için de uyarlanabilir. Genel olarak, uygun ekipman eksikliği ve yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüj için numune hazırlama konusundaki uzmanlık yetersizliği nedeniyle, bu yönteme yeni başlayan bireyler zorluk yaşayabilir.Bu protokol, yüksek kapasiteli sekanslama veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak yüksek saflıktaki HDL'ler üzerindeki küçük RNA'ların miktarının belirlenmesi için birbirine bağlanmış yerleşik yöntemlerden oluşmaktadır. Bu video, HDL'nin saflaştırılması ile ilgilidir. Bu protokol, asistanım Evan Shadari tarafından gösterilecektir.Başlamak için, dokuz mililitre plazmaya 90 µL 100x antioksidan ekleyin. Ardından, her dokuz mililitre plazmaya 0,251 g potasyum bromür ekleyerek plazmanın yoğunluğunu 1,025 g/mL değerine ayarlayın. Tüm tuz çözünene kadar plazmayı oda sıcaklığında sallayın.Ardından plazmayı ultra-santrifüj tüplerine aktarın ve üst kısımda bir kabarcık tabakası olduğundan emin olun. Plazmanın altında hapsolmuş hava olmamalıdır. Sonrasında, 18 gauge iğnenin ucundan bir santimetre uzağına 90 derecelik bir büküm yaparak, eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde iğneyi hazırlayın.Ardından, bir şırınga ve eğik iğne kullanarak, plazmanın üzerine dikkatlice üç mililitre birinci örtü solüsyonu yerleştirin. Yüzeydeki kabarcıkların çoğunu uzaklaştırın ve menisküs ile tüp kenarı arasında iki ila üç milimetre boşluk bırakın. Daha sonra, tüpleri dikkatlice SW 40 Ti kovalara yerleştirin.Kapaklarıyla birlikte her bir kovayı tartın ve santrifüjde karşıt konumlarda yer alacak kovaları birbirine tam olarak eşitleyin. Ardından, rotoru ultra santrifüje yerleştirin ve freni orta seviyede olan 4 değerine ayarlayarak, dört derece santigrat sıcaklıkta, 274.400 x g hızında 24 saat boyunca çalıştırın. Ertesi gün, kovaları rotordan dikkatlice çıkarın ve tüpleri kovalardan kaldırın.Ardından, bir şırınga ve eğri uçlu iğne kullanarak üst katmandan yavaşça iki mililitre alın. Bu, VLDL IDL fraksiyonudur. Daha sonra, geri kalan yedi mililitre plazmayı toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Üzerine ekleme çözeltisi numara iki ekleyerek plazma hacmini dokuz mililitreye tamamlayın. Ardından, 0,746 gram potasyum bromür ekleyerek yoğunluğu 1,080 gram/ml düzeyine ayarlayın. Son olarak, tuzun çözünmesi için numuneyi nazikçe sallayın; bu işlem yaklaşık 20 dakika sürecektir.Ardından, hava hapsolmamasına dikkat ederek örneği bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. Üst kısımda bir kabarcık tabakası oluştuğundan emin olun. Eğri iğneyi kullanarak, üzerine dikkatlice üç mililitre üç numaralı örtü çözeltisi ekleyin.Ardından, kabarcıkların çoğunu uzaklaştırın ve tüpleri dikkatlice SW 40 Ti kovasına yerleştirin. Tüpleri dengeleyin ve daha önce açıklandığı üzere 24 saat boyunca santrifüjleyin. Ertesi gün, eğri iğneyi kullanarak üst katmandaki örtü tabakasından iki mililitreyi dikkatlice alın.Bu, LDL fraksiyonudur. Ardından, kalan örneği yeni bir 15 mililitre konik tüpe aktarın ve hacmi dört numaralı çözelti ile dokuz mililitreye tamamlayın. Şimdi, yaklaşık 3,33 gram potasyum bromür ekleyip tuz çözünene kadar örneği sallayarak yoğunluğu 1,30 gram/mililitre olarak ayarlayın.Ardından, numuneyi bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ve üzerine dikkatlice üç mililitre beş numaralı çözeltiden ekleyin. Şimdi, numuneyi daha önce olduğu gibi, ancak 48 saat boyunca ultra-santrifüjleyin. İki gün sonra, üstteki iki mililitrelik süpernatantı bir şırınga ve eğik iğne kullanarak toplayın.Bu, HDL fraksiyonunu oluşturur. Yüksek tuzlu çözeltileri uzaklaştırmak için HDL fraksiyonunu, 10.000 moleküler ağırlık kesim noktasının olduğu ıslak bir diyaliz kılıfına aktarın. Ardından, dört santigrat derecede hafifçe karıştırarak, bir litre 1X PBS içerisinde 24 saat boyunca diyalize edin.24 saatlik süre boyunca PBS çözeltisini üç kez değiştirin. Daha sonra, HDL fraksiyonunun protein konsantrasyonunu BCA yöntemiyle belirleyin. Hücre dışı veziküller veya ekzosomlar, küçük HDL'ler ile benzer yoğunluğa sahiptir ve bu nedenle HDL ile aynı yoğunluk fraksiyonunda bulunabilirler.Bu nedenle, HDL fraksiyonunun FPLC ile daha fazla saflaştırılması gerekir. FPLC'yi kullanmadan hemen önce, 500 mikrolitre çözeltideki 1,2 miligram DGUC HDL fraksiyonunu 0,22 mikronluk bir santrifüj filtresinden geçirin. Filtrelenmiş örneği, hava kabarcığı kalmadığından emin olarak bir FPLC enjeksiyon şırıngasına toplayın.Ardından, FPLC akış hızını 0.3 milliliters per minute olarak ayarlayın ve basınç sınırını 2.6 megapascals'a belirleyin. Sonra, kolonları 0.2 kolon hacmi tamponla dengeleyin. Şimdi, numuneyi üç milliliters tamponla birlikte FPLC cihazına enjekte edin ve çalışmayı başlatın.Toplam 72 fraksiyon olacak şekilde 1,5 mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Üretici talimatlarına uygun olarak bir kolorimetrik kit kullanarak toplam kolesterol seviyelerini belirleyip, DGUC HDL'ye karşılık gelen FPLC fraksiyonlarını tanımlayın. DGUC HDL içeren altı ila yedi FPLC fraksiyonu bulmayı bekleyin.HDL içeren tüm fraksiyonları birleştirin ve 10 kilodalton kesim noktalı bir santrifüj filtresi kullanarak 4 °C'de, bir saat boyunca 4,000 ×g hızında veya HDL konsantresi yaklaşık 100 µL olana kadar konsantre edin. Ardından, HDL konsantresini toplayın ve BCA yöntemiyle protein miktarını belirleyin. Daha sonra, RNA izole etmek için aynı miktarda toplam HDL proteini kullanın.İnsan plazması, yoğunluk gradyanlı ayırma kullanılmadan FPLC ile fraksiyone edilmiştir. Altı fraksiyon HDL'ye ve altı fraksiyon çok düşük yoğunluklu lipoproteinlere karşılık gelmiştir. Lipitler siyah, kolesterol kırmızı ve proteinler mavi ile tümü kolorimetrik kitler kullanılarak ölçülmüştür.Kıyaslama olarak, FPLC öncesinde yoğunluk gradyanlı ultra-santrifüj kullanımı, lipid protein ve kolesterolün neredeyse tamamen HDL fraksiyonlarında bulunmasıyla sonuçlanmıştır. Dört sağlıklı plazma donöründen alınan HDL'den toplam RNA izole edilmiş ve tek okumalı 50 baz çifti protokolü kullanılarak dizilenmiştir. Normalize edilmiş okumaların dağılımı, 21 ve 34 nükleotid civarındaki küçük RNA'ların zenginleşmesini göstermektedir.Kütüphane analizi, okumaların yüzde 38'inin mikro RNA'lar, yüzde 37'sinin ise tRNA'lardan türetildiğini göstermiştir. Ayrıca çeşitli RNA'lar, ribozomal RNA'lar, küçük RNA'lar, küçük nükleoler RNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar da tespit edilmiştir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde uygulandığı takdirde on gün içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, yüksek verimli sekanslama ile gözlemlenen HDL küçük RNA değişimlerini PCR veya northern blotting gibi başka bir yöntemle doğrulamanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürü takiben, HDL küçük RNA değişimleri ile HDL fonksiyonu arasındaki korelasyonun belirlenmesi gibi ek soruları yanıtlamak için, RNA izolasyon basamakları ve sekanslama hazırlık basamakları sırasında HDL kolesterol e-flux kabul kapasitesi ve HDL anti-inflamatuar SA'lar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik; lipidler ve lipoproteinler alanındaki araştırmacıların, kolesterol dışı kargoları, özellikle de nükleik asitleri ve örneğin hiperkolesterolemi veya diyabet gibi metabolik hastalıkları incelemesine yol açmıştır.Ve unutmayın, insan plazması ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir; bu nedenle kan yoluyla bulaşan patojenler konusunda uygun eğitim alınmalı ve bu teknik uygulanırken uygun kişisel koruyucu donanım kullanılmalıdır.

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu kağıt, izolasyon, saflaştırma ve exosomes tespiti, moleküler içerik analizi teknikleri gibi yöntemleri gösteriyor. Bu yöntemler, hücre kültürü medya ve biyolojik sıvılarda exosome izolasyonu için uyarlanabilir ve moleküler içerik analizi ötesinde işlevsel çalışmalarda da yararlı olabilir.

RNA İçeren Exosomes İzolasyonu ve Karakterizasyonu

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu protokol, insan serumundan küçük RNA'ların ekstre edilmesi için bir yöntem tarif eder. Biz DNA dizileri kullanmak için kanser serumdan microRNA izole ve aynı zamanda singleplex kantitatif PCR için bu yöntemi kullandık. Protokol yüksek kalitede RNA elde edildi modifikasyonlarla fenol ve guanidinyum tiosiyanat reaktifler kullanır.

Insan serumundan küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar izolasyonu

MicroRNA'lar (miRNA'lar), yaygın olarak korunan bir düzenleyici molekül sınıfıdır. Burada, iki güçlü ligasyon adımına ve ardından yüksek verimli dizilemeye dayanan bir miRNA klonlama yöntemini açıklıyoruz. Yöntemimiz, miRNA'ların genom çapında doğru bir şekilde kantitasyonuna izin verir.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Belirli bir doku hücrelerinin bir alt kümesi gen ifade analizi büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bu makalede, lazer yakalama mikrodiseksiyon ile hızlı bir immün yöntemi birleştirerek belirli bir hücre popülasyonu yüksek kaliteli toplam RNA izole açıklamaktadır.

Hücre belirli alt gruplar RNA izolasyonu Hızlı immünoyaftalama ile birlikte Lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanma

MikroRNA'lar önemli bir düzenleyici rol oynar ve çeşitli insan hastalıkları için yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmaktadır. MiRNA'ların yüksek yoğunluklu lipoprotein taşınmaktadır gösterilmiştir. Hızla insan plazmasından MiRNA analizi için uygun, saflaştırılmış HDL izole edilmesi için basit bir yöntem geliştirdik.

Yüksek Saf Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein gelen miRNA Yüksek koymak Through-İzolasyon için hızlı ve basitleştirilmiş Yöntemi

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Lipid damlacıkları Hepatit C virüsü (HCV), dahil olmak üzere çeşitli patojenlere replikasyonu için önemli organellerdir. Bu ilişkili proteinler kantitatif kütle spektrometresi için lipid damlacıkları izole edilmesi için bir yöntem tarif; bu tür virüs enfeksiyonu, çevresel stres veya ilaç tedavisi gibi koşullar, çeşitli altında kullanılabilir.

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Burada, lipoprotein parçacıklarının yerel Micro-RNA içeriğinin (mutlak/göreceli) belirlenmesi için nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyon tabanlı protokol sunulur. Buna ek olarak, Mikro-RNA seviyesini artırmak için bir yöntem, hem de lipoprotein parçacıkları hücresel alımını oranını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir.

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Öğrenin, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonu kullanarak HDL'den küçük RNA izolasyonu ve kantifikasyonu yöntemini. Bu teknik, kardiyometabolik hastalıklarda biyobelirteç olarak lipoprotein küçük RNA imzalarını tanımlamaya yardımcı olur.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Daha fazla video keşfet