Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Bu protokolün genel amacı, saflaştırılmış lipoproteinler üzerindeki küçük kodlamayan RNA'ları ölçmektir. Bu protokol, sağlık ve hastalıkta lipoprotein küçük RNA imzalarının tanımlanmasının yanı sıra lipoprotein küçük RNA'ların hastalık biyobelirteçleri veya hücreden hücreye mesajlar olarak ilerletilmesi gibi lipoprotein alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hastalık veya deneysel koşullardaki küçük RNA değişiklikleri için yüksek derecede saf lipoproteinlerin analiz edilebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri kardiyometabolik hastalıkların tedavisi için uzanır, çünkü hücre dışı RNA'lar yeni bir hastalık biyobelirteç sınıfıdır ve lipoprotein küçük RNA'lar gelecekteki çalışmalarda ilaç hedefleri olarak heyecan verici bir potansiyele sahiptir. Bu yöntem HDL küçük RNA'lar için tasarlanmış olsa da, çok düşük yoğunluklu ve düşük yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'lar için de uyarlanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme için numune hazırlamada uygun ekipman ve uzmanlık eksikliği nedeniyle mücadele edebilir.

Bu protokol, yüksek verimli dizileme veya gerçek zamanlı PCR kullanılarak yüksek saflıkta HDL üzerinde küçük RNA'ların miktar tayini için birbirine bağlı yerleşik yöntemlerden oluşur. Bu video, HDL'nin saflaştırılması ile ilgilidir. Bu protokol asistanım Evan Shadari tarafından gösterilecek.

Başlamak için, dokuz mililitre plazmaya 90 mikrolitre 100x antioksidan ekleyin. Ardından, her dokuz mililitre plazmaya 0.251 gram potasyum bromür ekleyerek plazmanın yoğunluğunu mililitre başına 1.025 grama ayarlayın. Plazmayı oda sıcaklığında, tüm tuz eriyene kadar sallayın.

Ardından, plazmayı ultra santrifüj tüplerine aktarın ve üstte bir kabarcık tabakası olduğundan emin olun. Plazmanın altında hava hapsetmemelidir. Ardından, eğimli tarafı yukarı bakacak şekilde uçtan bir santimetre 90 derecelik bir bükülme ekleyerek 18 gauge bir iğne hazırlayın.

Daha sonra, bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak, plazmanın üzerine üç mililitre kaplama çözeltisi bir numaralı kaplamayı dikkatlice yerleştirin. Yüzeydeki kabarcıkların çoğunu çıkarın ve menisküs ile tüpün kenarı arasında iki ila üç milimetre bırakın. Ardından, tüpleri dikkatlice SW 40 Ti kovalara yerleştirin.

Her bir kovayı kapaklarla tartın ve santrifüjde zıt pozisyonları işgal edecek kovaları tam olarak dengeleyin. Daha sonra, rotoru ultra santrifüje yerleştirin ve 24 saat boyunca dört santigrat derecede 274, 400 kez G'de çalıştırın ve kırılma ara olarak dört değerine ayarlayın. Ertesi gün, kovaları rotordan dikkatlice çıkarın ve tüpleri kovalardan kaldırın.

Ardından, bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak kaplamanın üst katmanından iki mililitreyi yavaşça çıkarın. Bu, VLDL IDL fraksiyonudur. Daha sonra kalan yedi mililitre plazmayı toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

İki numaralı kaplama solüsyonunu ekleyerek plazmanın hacmini dokuz mililitreye getirin. Ardından, 0.746 gram potasyum bromür ekleyerek yoğunluğu mililitre başına 1.080 grama ayarlayın. Ardından, yaklaşık 20 dakika sürecek olan tuzu çözmek için numuneyi hafifçe sallayın.

Ardından, numuneyi herhangi bir hava hapsetmeden bir ultra santrifüj tüpüne aktarın. Üstte bir baloncuk tabakası yapıldığından emin olun. Bükülmüş iğneyi kullanarak, üç mililitre üç numaralı kaplama solüsyonunu dikkatlice kaplayın.

Ardından, baloncukların çoğunu çıkarın ve tüpleri dikkatlice SW 40 Ti kovaya yükleyin. Onları dengeleyin ve daha önce açıklandığı gibi 24 saat boyunca döndürün. Ertesi gün, bükülmüş iğneyi kullanarak kaplamanın üst katmanından iki mililitreyi dikkatlice çıkarın.

Bu LDL fraksiyonudur. Ardından, kalan numuneyi 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın ve dört numaralı çözelti ile hacmi dokuz mililitreye getirin. Şimdi yaklaşık 3,33 gram potasyum bromür ekleyerek ve tuzu çözünene kadar sallayarak yoğunluğu mililitre başına 1,30 grama ayarlayın.

Ardından, numuneyi bir ultra santrifüj tüpüne aktarın ve dikkatlice üç mililitre beş numaralı çözeltiye aktarın. Şimdi, numuneyi daha önce olduğu gibi, ancak 48 saat boyunca ultra santrifüj edin. İki gün sonra, bir şırınga ve bükülmüş iğne kullanarak kaplamanın üst iki mililitresini toplayın.

Bu HDL fraksiyonunu oluşturur. Yüksek tuz çözeltilerini çıkarmak için, HDL fraksiyonunu 10.000 moleküler ağırlık kesimi olan ıslak bir diyaliz manşonuna aktarın. Ardından, dört santigrat derecede hafifçe karıştırarak bir XPBS'nin litresinde 24 saat boyunca diyalize edin.

PBS çözümünü 24 saatlik süre içinde üç kez değiştirin. Daha sonra, bir BCA yöntemi kullanarak HDL fraksiyonunun protein konsantrasyonunu belirleyin. Hücre dışı veziküller veya eksozomlar, küçük HDL'ye benzer bir yoğunluğa sahiptir ve bu nedenle HDL ile aynı yoğunluk fraksiyonunda bulunabilir.

Bu nedenle, HDL fraksiyonu, FPLC ile daha fazla saflaştırma gerektirir. FPLC'yi kullanmadan hemen önce, 0,22 mikronluk bir santrifüj filtreden 500 mikrolitre çözelti içinde 1,2 miligram DGUC HDL fraksiyonu çalıştırın. Filtrelenmiş numuneyi bir FDLC enjeksiyon şırıngasına toplayın ve hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olun.

Ardından, FPLC akış hızını 2,6 megapaskal basınç limiti ile dakikada 0,3 mililitreye ayarlayın. Ardından, sütunları 0,2 sütun hacimlerinde arabellekle dengeleyin. Şimdi numuneyi üç mililitre tamponla FPLC cihazına enjekte edin ve çalıştırmayı başlatın.

Toplam 72 kesir için 1,5 mililitrelik kesirler toplayın. Üreticinin talimatlarına göre bir kolorimetrik kit kullanarak toplam kolesterol seviyelerini belirleyerek DGUC HDL'ye karşılık gelen FPLC fraksiyonlarını tanımlayın. DGUC HDL içeren altı ila yedi FPLC fraksiyonu bulmayı bekleyin.

HDL içeren tüm fraksiyonları bir araya getirin ve bunları dört santigrat derecede bir saat boyunca veya HDL konsantresi yaklaşık 100 mikrolitre olana kadar 4.000 kez G'de 10 kilodaltonluk bir kesme santrifüj filtre kullanarak konsantre edin. Daha sonra, HDL konsantresini toplayın ve BCA yöntemini kullanarak proteini ölçün. Daha sonra, RNA'yı izole etmek için aynı miktarda HDL toplam proteini kullanın.

İnsan plazması, yoğunluk-gradyan ayrımı kullanılmadan FPLC ile fraksiyone edildi. Altı fraksiyon HDL'ye ve altı ila çok düşük yoğunluklu lipoproteine karşılık geldi. Siyahtaki lipitler, kırmızıdaki kolesterol ve mavideki proteinlerin tümü kolorimetrik kitlerle ölçüldü.

Karşılaştırıldığında, FPLC'den önce yoğunluk gradyanlı ultra santrifüjlemenin kullanılması, neredeyse sadece HDL fraksiyonlarında lipid proteini ve kolesterol bulunmasına neden oldu. Dört sağlıklı plazma donöründen alınan HDL'den, toplam RNA izole edildi ve tek bir okuma 50 baz çifti protokolü kullanılarak dizilendi. Normalleştirilmiş okumaların dağılımı, 21 ve 34 nükleotid etrafındaki küçük RNA'ların zenginleşmesini ve zenginleşmesini gösterir.

Kütüphanenin analizi, okumaların yüzde 38'inin mikro RNA'lar olduğunu ve yüzde 37'sinin TRNA'lardan türetildiğini gösterdi. Çeşitli RNA'lar, ribozomal RNA'lar, küçük RNA'lar, küçük nükleolar RNA'lar ve uzun kodlamayan RNA'lar da mevcuttu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapıldığında on gün içinde gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürü denerken, yüksek verimli dizileme ile gözlemlenen HDL küçük RNA değişikliklerini PCR veya kuzey lekeleme gibi başka bir yöntemle doğrulamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, HDL kolesterol e-flux kabul kapasitesi ve HDL anti-inflamatuar SA'lar gibi diğer yöntemler, HDL küçük RNA değişiklikleri ile HDL fonksiyonu arasındaki korelasyonu belirlemek gibi ek soruları yanıtlamak için RNA izolasyon adımları ve sıralama hazırlık adımları sırasında gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, lipitler ve lipoproteinler alanlarındaki araştırmacıların, kolesterol olmayan kargoları, özellikle nükleik asitleri ve hiperkolesterolemi veya diyabet gibi metabolik hastalıkları incelemelerinin yolunu açtı.

Ve unutmayın, insan plazması ile çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve kan yoluyla bulaşan patojenler konusunda uygun eğitim alınmalı ve bu tekniği uygularken uygun kişisel koruyucu ekipman giyilmelidir.