Name: Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, vakum stabilize görüntüleme penceresi kullanarak akciğerde uzun vadeli yüksek çözünürlüklü tek hücreli canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik metastaz sırasında stroma ve tümör hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, JWP ve Entegre Görüntüleme Programı R01CA172451 olan NIH-CA100324, Einstein Ulusal Kanser Enstitüsü'nün kanser merkezi destek hibesi P30CA013330 tarafından desteklenmiştir. Bu teknoloji, Gruss-Lipper Biyofotonik Merkezi'nde ve Albert Einstein Tıp Fakültesi'ndeki Entegre Görüntüleme Programında geliştirilmiştir. Bu Merkezlerin bu çalışmadaki desteğini kabul ediyoruz. Yazarlar, Einstein makine atölyesinden Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon ve Anthony Leggiadro'ya yetenekli ve zamanında işçilikleri için, Matthew Krummel'in laboratuvarına pencere tasarım çizimlerini cömertçe paylaştıkları için, Kevin Elicieri ve Jeremy Bredfeldt'e mikroskopi konusundaki uzmanlıkları ve amplifikatör önerileri için ve Allison Harney ve Bojana Gligorijevic'e bilgilendirici tartışmalar için teşekkür eder.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu tür proteinler ve antikorlar gibi floresan etiketli fonksiyonel etiketleri ile kombine in vivo optik görüntüleme Yüksek çözünürlüklü metastatik kaskad anlayışımızı büyük oranda arttırmıştır. Bu, doğrudan görselleştirme ve tek hücreli ve tümör hücrelerinde alt-hücresel parametrelerin, konakçı hücreler ve bunların mikro-ölçümünü sağladı. Primer tümörün içindeki bu görüntüleme büyüme işgali ya da yayma 6,7 birinin destekleyici ayrık mikroçevrelerde keşfine, örneğin, yol açmıştır. Işgali duru...

Yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme tek hücreli ve alt-hücresel parametreler ölçülmüş ve sayısal olarak izin birçok biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Kanser araştırmalarında, tümör stromal hücrelerin intravital görüntüleme hayvanda sadece mevcut bir çok mikro-çevresel etkileşimleri 6-11 keşfine yol açmıştır. In vivo tek bir hücre çözünürlüğü, optik görüntüleme kullanılarak göğüs kanserinde intravasation ve tümör hücrelerinin yayılması ile bağlantılı mikroçevrelerde keşiflerine da prognoz ve göğüs kanseri hastalarında 12-16 tedaviye yanıt için yeni işaretleri yol açmıştır. bozulmamış iç hayati organlara içinde derin görüntülemek için mevcut en iyi görüntüleme teknolojileri tüm organ mükemmel manzarasına sahiptir ve klinik belirti bile önce patolojileri ortaya çıkarabilir klinik yöntemler (MRI, PET CT) &#39;dir. Bunlar edemiyoruz, however nedeniyle tek bir hücre çözünürlükte onların eksikliği tümör ilerlemesini sürüş metastaz erken aşamaları ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için. Zamanla akciğer metastazı bu modaliteleri görünür, onlar iyi kurulmuş ve artıyor. Onlar çok daha erken, daha önce geliş ve hayatta kalma erken adımları görüntüleme, 19 beklenenden daha gelmesi yaygın tümör akciğere ulaşması ya 17 hayatta olmayan veya başlangıçta atıl 18 kalır hücreleri ve gözlem% 90 için çok önemli hale gelmesi tahmini göz önüne alındığında uzak bölgelerde metastatik tohumlama ve tümör büyümesinin nüks süreci anlamak. Akciğerde bu gözlemleri Sahne ancak son derece zor olduğu kanıtlanmıştır; görüntüleme çalışmalarının büyük çoğunluğu yalnızca tek zaman noktalarında akciğer içine bir görünüm vermek ex vivo veya eksplant hazırlıkları 20-23 kullanmışlardır. Bu hazırlıklar yararlı bilgiler sağlamakla birlikteım, onlar mikroçevresinin çeşitli bileşenleri arasında meydana gelen etkileşimlere, sebep-sonuç ilişkileri ve dinamikleri tam bir anlayış vermeyin. Uygun bir dolaşım sistemi (ve homeostasis eşlik eden dengesizlik) ve vücudun bağışıklık sisteminin geri kalanından kesilmesi eksikliği arzulu bu hazırlıkların in vivo sağlam dokuda oluşturmak sonuçlara doğrulamak için yapar. Birçok grup Wearn ve Alman plevra tabakası 24 açığa cerrahi olarak ilk ve Terry implante edilebilir görüntüleme penceresi 25 kullanan ilk olmak sağlam akciğer 2,4,5,24-33 intravital görüntüleme gerçekleştirdik. Akciğerde Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ölçüde akciğer sürekli hareket tarafından engellenmektedir ve çeşitli teknikler bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Wagner ve Filley 27 köpek akciğer doğal hareket okuduve Wagner doku 28 hareketsiz onun pencere cerrahi hazırlık vakum kullanılan iken nispeten sabit bölge üzerindeki implante pencereyi bulmak için cerrahi protokol tasarlanmış. Bronş sıkıştırma, sıralı apne ve kapı görüntüleme, örneklemeyi edinimi, akciğer lobu ve vakum 34 yapışması: O zamandan beri, çeşitli teknikler görüntüsüne dahil akciğer faydalanılmıştır. Bunların her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve hiç kimse teknik başka 34&#39;e kadar üstün ortaya çıkmıştır. Örneğin, bronş sıkma ve ardışık apne akciğer gazların normal alışverişini değiştirebilir ve atelektazi neden olabilir. Geçitli görüntüleme ve oversampled edinimi bu dezavantajları muzdarip ama yüksek hızda veya özel görüntüleme cihazları yaygın olarak erişilebilir değil gerekmez. Sonunda akciğer hem yapıştırma ve vakum tekniği yukarıda belirtilen sakıncaları hem önlemek, ancak bakım tak değilse kesme kuvveti kaynaklı yaralanma görülebiliren. Son yıllarda, vakum penceresi minyatürize edilmiş ve konfokal ve multiphoton mikroskopi 4,5,33 ve mükemmel yüksek çözünürlüklü görüntü kullanılarak farelerde kullanılmak üzere adapte elde edilmiştir 2. Tablo 1, bu zengin geçmişini özetleyen ve yeni tarif o kağıtları özeti intravital akciğer görüntüleme pencereleri kullanımında gelişmeler. Bu protokol mümkün olan en yüksek hücre içi çözünürlük ile canlı, sağlam akciğer görüntü metastaz genişletilmiş time-lapse multiphoton intravital mikroskopi kullanımını tarif etmektedir. Görüntüler yüksek sayısal açıklık objektif lens ve çoklu photomultiplier tüp (PMT) dedektörleri ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak en fazla 12 saat boyunca elde edilir. Transgenik fare modelleri flüoresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran ve floresan protein transfekte edilmiş tümör hücreleri (damar ve tümör hücreleri respectivel etiket ile floresan etiket yerel makrofajlara kullanılırY). floresan etiketli hücrelerin bu seçim tümör hücre endotelyal hücre-makrofaj etkileşimleri ve dinamikleri görselleştirme sağlar iken, bu protokol floresan veya floresan olmayan fare herhangi suşu için çalışacaktır. Kazanılmasından sonra, artık sürüklenme hareketi (varsa) etiketsiz dolaşan kan hücrelerinin neden yanıp sönen ortadan kaldırmak için 35,36 ve özel makrolar zaman ortalama damar kanalı eklentisi Fiji kullanılarak elimine edilir. Bu protokol, görüntüleme metastaz odaklanırken, teknikler akciğer yüksek çözünürlüklü tek hücreli bir görüntüleme ile gözlemlenebilir diğer biyolojik süreçlerde uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Nikel Kaplama Pirinç Vakum Regülatörü 1/8 NPT Dişi, Göstergeli, 0 - 20" Hg Vakumlu McMaster</td><td>Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>Vakum Regülatörü</td></tr><tr><td>1/4 "Hortum ID X 1/8" NPTF Erkek Boru için Pirinç Dikenli Hortum Montaj Adaptörü</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>Vakum Regülatörü Hortum Adaptörü</td></tr><tr><td>Pyrex Marka Tüpülasyonlu Filtreleme Şişeleri; 4 No'lu lastik tıpa için boyunlu aletli; Kapasite: 50 ml</td><td>Corning Yaşam Bilimleri Camı</td><td>5360-50</td><td>Vakumlu Şişe</td></tr><tr><td>Yuvarlak Cam Lameller Kalınlık # 1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm çap & nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>260368</td><td>Kapak fişleri</td></tr><tr><td>Exel International Tek Kullanımlık Safelet I.V. Kateterler; 22 g x 1 inç&nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>Trakeal Kateter</td></tr><tr><td>PERMA-HAND Siyah Örgülü İpek Sütürler, ETHICON LIGAPAK Dağıtım Makarası Boyutu 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Dize</td></tr><tr><td>Sıvı Süper Yapıştırıcı, Şeffaf, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Siyano-akrilat Tutkal</td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin izotiyosiyanat &ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD Dextran</td></tr><tr><td>Laboratuvar Şeffaf Tygon PVC Boru, 1/16 "ID, 1/8" OD, 1/32 "Duvar Kalınlığı, 25 ft. Uzunluk</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>İnce Boru ve Luer</td></tr><tr><td>Çatlamaya Dayanıklı Polietilen Boru için Boru, 1/8 "ID, 1/4" OD, 1/16 "Duvar Kalınlığı, Beyaz, 50 ft. Uzunluk&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>Kalın Boru</td></tr><tr><td>Tüy Dökücü Losyon</td><td></td> <td>Nair-Mikro</td><td></td></tr> <tr><td>Tıbbi Boru 95 Durometre LDPE</td><td>Bilimsel Emtialar A.Ş.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>Kuyruk ven kateteri için boru</td></tr><tr><td>30 G x 1 inç. BD PrecisionGlide İğne</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Kuyruk ven kateteri için iğneler</td></tr><tr><td>Püriten Steril Olmayan Pamuk Uçlu Swablar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Polikarbonat Dikenli Boru Bağlantısı, 3/32 "x 1/16" Tüp Kimliği</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>Tüpler arasındaki konektörler</td></tr><tr><td>Tek Delikli Kauçuk Tıpalar Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-135F</td><td>Vakum Şişesi için Durdurucu</td></tr><tr><td>SHARP Hassas Bariyer Uçları, P-100, 100 ve mikro için; l</td><td>Denville Bilimsel A.Ş.</td><td>P1125</td><td>Pipet Ucu</td></tr><tr><td>Laboratuvar bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>008897</td><td>Oftalmik Merhem</td></tr><tr><td>İkizler Koter Kiti</td><td>Harvard Aparatı</td><td>726067</td><td>Koter Kalemi</td></tr><tr><td>Graefe Mikro Diseksiyon Forsepsleri; Dişli; hafif eğri; 0,8 mm Uç Genişliği; 4" Uzunluk</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>Forseps</td></tr><tr><td>Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Keskin/Keskin 24 mm</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS-5912</td><td>Keskin Makas</td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makası 4" Düz Künt/Küt</td><td>Roboz Cerrahi</td><td>RS-5980</td><td>Künt Makas</td></tr><tr><td>Mendil</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>koşum</td></tr><tr><td>PhysioSuite System</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>Vitals Monitor</td></tr><tr><td>1 ml Şırınga, Tüberkülin Kayma Ucu</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Şırınga</td></tr><tr><td>Cyano akrilat</td><td>Zımba</td><td>LOC1647358</td><td>Kapak Slip Yapıştırıcı</td></tr><tr><td>Petrol Jeli</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>Su Bariyeri</td></tr><tr><td>Adaptörü Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm</td><td>Harvard Aparatı</td><td>734118</td><td>Kateter Konektörü</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT nabız oksimetresi</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Nabız Oksimetresi</td></tr><tr><td>İzoetezi (izofluran)</td><td>Henry Schein Hayvan Sağlığı</td><td>50033</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Oksijen</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PVC Küresel Vana, Bağlamak için İtme, 1/4</td><td>In Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>Vakum Vanası</td></tr><tr><td>Küçük Hayvan Vantilatörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>683</td><td>Alternatifi Kent Scientific'ten temin edilebilir: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Çoklu Foton Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>Özel yapım kapsam Çevre Muhafazasına alternatif</td></tr><tr><td></td><td>FV1000 için Hassas</td><td>Plastik</td> Hazne <td>Özel yapım muhafazaya alternatif</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Serum Fizyolojik ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Güç Ölçer</td><td>Tutarlı</td><td>AlanMaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Güç Ölçer Kafası</td><td>Tutarlı</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Yonca Floresan Protein Vektör</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sülfat Seçici Antibiyotik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Floresan-Aktive Hücre Sıralayıcı&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 ve mikro; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Plaka</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kültür Kabı</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kim Mendil</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

bir vakum stabilize görüntüleme penceresi ile akciğer uzun vadeli yüksek Çözünürlüklü intravital mikroskopi

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

Akciğer, karaciğer ve kemik gibi ikincil sitelere Metastaz yaklaşık 90% 1 mortalite oranı travmatik bir olaydır. Bu sitelerin, akciğer nedeniyle vücudun hassas doğası ve uygun fizyolojisi sürdürülmesinde hayati rol içindeki kapalı konumuna intravital optik görüntüleme kullanarak değerlendirmek en zor olandır. Klinik yöntemler (pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi (BT)) bu doku noninvaziv görüntülerini sağlayabilen olsa da, tek bir piksel ile en erken ekim olayları görselleştirmek için gerekli çözünürlük, eksikliği yaklaşık bin hücrelerinden oluşan. Sadece bir tümör hücresinin geldikten sonra olaylar hayatta kalma ve daha sonraki büyüme için deterministik olan metastatik akciğer tohumlama postülanın Güncel modelleri. Bu tek hücreli çözünürlükte 2 ile gerçek zamanlı intravital görüntüleme araçları tohumlama cel fenotipleri tanımlamak için gerekli olduğu anlamına gelirls bu modelleri test ve. Akciğer yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme çeşitli eks vivo preparatlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir birlikte, bu deneyler, tipik haliyle tek bir zaman noktası deneyler ve (nedeniyle önemli ölçüde değişmiş ortam sıcaklığı, bolluğu, sitokinler, vb eşya ve olası hatalı sonuçlara duyarlı ) göğüs boşluğuna ve dolaşım sistemi 3 çıkarıldıktan kaynaklanan. Son çalışmalar bir vakum ancak görüntüleme penceresi 2,4,5 stabilize kullanarak mümkün sağlam akciğerin o zaman atlamalı intravital optik görüntüleme olduğunu göstermiştir, tipik görüntüleme süreleri yaklaşık 6 saat ile sınırlı kalmıştır. Burada 12 saatlik bir süre boyunca böyle bir pencere kullanılarak akciğer uzun süreli intravital zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol açıklar. Bu yöntem kullanılarak elde edilen zaman atlama görüntü sıralarını akciğer görselleştirme ve hücre-hücre etkileşimleri kantitatif membran dinamikleri ve vasküler perfüzyon sağlar. Biz daha dAkciğer mikrovasküler emsalsiz net bir görünüm verir bir görüntü işleme tekniği Escribe.

Bu yöntem ile elde edilebilir sonuçlar tipini göstermek için, ameliyat öncesi zaman noktaları değişen MacBlue fareler 44 kuyruk venine floresan protein yonca ile etiketlenmiş E0771-LG, tümör hücreleri enjekte ettik. Ameliyattan sonra, 155 kD rodamin etiketli dekstran damarlar ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı işaretlemek için IV enjekte edildi. Fareler 24 saat sonrası enjeksiyon görüntüleme yaparken, tek hücre m...

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

Bu yöntemin genel amacı, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak, bozulmamış akciğerin uzun süreli, yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, metastazın en erken aşamalarında stroma ve tümör hücreleri arasında ne tür etkileşimlerin gerçekleştiği gibi. Bu tekniğin temel avantajı, canlı ve bozulmamış akciğerin teorik olarak 12 saate kadar tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilebilmesidir.İşleme, 2-0 sütürün üç inçlik bir parçasını, burcun bir çeyrek inç yukarısından trakeal katetere çift düğümle bağlayarak başlayın. Ardından, anestezi altındaki farenin gözlerine göz merhemi uygulayın ve göğsün orta hattından sırtın dörtte birine kadar ve koltuk altından göğüs kafesinin hemen altına kadar olan bölgedeki tüyleri depilatuar krem kullanarak temizleyin. Fazla losyonu temizleyin ve açığa çıkan cildi %70 etanol ile sterilize edin.Ardından, hayvanı entübe edin. 2-0 sütürü, burun ucuna, ön dişlerin altına bağlayın. Kateterlerin yerinden çıkmamasına dikkat ederek hayvanı cerrahi alana taşıyın ve ventilatörü çalıştırın.Ventilatörü trakeal katetere bağlayın. Ardından kateteri buruna ve sol ön ekstremiteyi katetere bantlayın. Parmak sıkıştırma testine yanıt alınmadığından emin olduktan sonra, sol göğüs duvarının üzerindeki bir santimetrekarelik deri bölgesini keskin bir makasla çıkarın.Meme yağ pedini kaldırın ve açığa çıkan kan damarlarını koterize edin. Ardından, ön kolun tabanındaki aksiller veni kesmemeye dikkat ederek yağ pedini rezeke edin ve kas tabakasını göğüs kafesine kadar çıkarın. Altıncı kaburgayı kaldırmak için pens kullanın.Ardından, keskin makası beş derecelik dar bir açıda tutarak, kaburgayı ciltteki açıklığın kenarına yakın bir yerden kesin. Göğüs duvarındaki açıklığı genişleterek tüm akciğer lobunu açığa çıkarmak için ardışık dört kaburgayı çıkarın. Daha sonra fareyi dikkatlice mikroskop görüntüleme tablasına aktarın.Vakum kapalıyken, vakum penceresinin iç bölmesini PBS ile doldurun. Fareyi ters çevirin ve açıkta kalan akciğeri vakum görüntüleme lameli penceresinin üzerine yerleştirin. Vakumu yavaşça açın.İkiye katlanmış pelür kağıdından yapılmış bir sabitleme düzeneğini farenin göğsü üzerine iki kez yerleştirin ve düzeneği sahne plakasına bantlayın. Ardından hayvanın patisine bir pulse oksimetre takın. Sonra çevresel hazneyi sahneye yerleştirin ve fareyi fizyolojik sıcaklıkta tutmak için ısıtıcıyı açın.Hayvan uygun pozisyona getirildiğinde, 25'lik 95 sayısal açıklıklı objektif lensini lamеl yakınına getirin. Epifloresan modunda fitzy kanalını görüntüleyin ve akciğer dokusunu odaklayın. Ardından, steril bir şırıngaya 100 µL tümör hücresi süspansiyonu doldurun, kuyruk ven kateterindeki PBS şırıngasını çıkarın ve tümör hücresi şırıngasını bağlayın.Tümör hücrelerini kuyruk venine yavaşça enjekte edin. Ardından PBS şırıngasını tekrar kuyruk ven kateterine bağlayın ve mikroskop oküleri aracılığıyla tümör hücrelerini akciğer dokusu boyunca konumlandırın. Şimdi PBS şırıngasını 100 µL rhodamine dextran yüklü bir şırıngayla değiştirin ve dextranı kuyruk kateteri aracılığıyla fareye yavaşça enjekte edin.Dekstran uygulamasının ardından 50 µL steril PBS ile yıkama yapın. Daha sonra, vaskülarizasyonun akışını ve bütünlüğünü görselleştirmek için daha önce belirlenmiş her bir tümör hücresi konumunda görüntüler elde edin. Enjeksiyondan yirmi dört saat sonra, tekil tümör hücrelerinin damar sistemi içindeki makrofajlar ve monositlerle etkileşimi görselleştirilebilir.Görüntüleme stabilitesi, alanın ardışık Z-yığınlarının elde edilmesine ve üç boyutlu bir yeniden yapılandırmanın oluşturulmasına olanak tanıyacak düzeydedir. Burada, enjeksiyondan 12 gün sonra, tek bir metastatik lezyonun akciğer yüzeyinin 15 µm altında, 205 dakika boyunca 890 µm'lik bir görüş alanını kapsayan, beş çarpı beşlik bir görüntüleme alanları mozaiği gösterilmektedir. Geniş görüş alanına rağmen, mozaiği oluşturan temel karelerin yüksek çözünürlüğü, kromozomal ayrılma ile kanıtlandığı üzere tek bir hücrenin mitozu gibi hücre altı olayların yakalanmasını sağlamaktadır.Yüksek moleküler ağırlıklı, floresan işaretli bir dekstranın intravasküler enjeksiyonu, vasküler lümenin işaretlenmesiyle sonuçlanır; ancak, işaretlenmemiş dolaşan eritrositler ve lökositler dekstranı tıkayabilir. Akciğerin küçük kılcal damarlarında bu tıkanma, dekstran sinyalinde yanıp sönmelere ve vasküler sınırlarda netlik kaybına yol açar. Bu protokolün sağladığı yüksek uzamsal kararlılık, kan kanalının bulanıklaşma olmadan zaman ortalamasının alınmasına olanak tanıyarak geçici tıkanmaları giderir.Diğer sinyal kanalları daha sonra, damar sınırlarının net bir görünümünü sağlamak için vaskülatür üzerine bindirilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, büyük kan damarlarını önceden koterize etmeden kesmemeye dikkat etmek ve akciğer dokusuna hiçbir şekilde dokunmaktan kaçınmak önemlidir.Bu prosedürün ardından, tümör hücresi yayılımı ve proliferasyonunun en erken evreleri görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerde intravital görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

long-term-high-resolution-intravital-microscopy-lung-with-vacuum

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz patojenleri fagosite veya nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NET) üretirken enfekte akciğerlerde nötrofil granülositler dinamiklerinin gözlem için 2-foton mikroskopi nasıl kullanılacağını göstermektedir.

2-foton Mikroskop kullanarak Enfekte Akciğerler Nötrofiller Fagositoz ve NET-oluşumu Doğrudan Gözlem

Bu videoda, hücresel dinamiklerin uzun süreli görselleştirilmesi için stabilize bir pencere aracılığıyla bir fare pankreasının intravital görüntülemesini açıklıyoruz.

İntravital görüntüleme: Stabilize bir görüntüleme penceresi aracılığıyla fare pankreasının hücresel düzeyde gözlemlenmesi için bir yöntem

Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.

Pankreas intravital görüntüleme penceresine sahip bir Murine Modelinde Pankreasın Stabilize Boyuna In Vivo Hücresel Düzey Görselleştirmesi

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.

Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

İntravital floresan mikroskopi, lökosit-endotel etkileşimlerini ve kılcal perfüzyonu gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir akciğer görüntüleme sistemi kullanarak pulmoner mikrosirkülasyondaki bu parametreleri görüntüleme ve ölçme yöntemlerini açıklar.

Vakumla Stabilize Edilmiş Bir Görüntüleme Sistemi Kullanılarak Deneysel Akut Akciğer Hasarında Pulmoner Mikrosirkülasyonun İntravital Geniş Alan Floresan Mikroskopisi

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Öğrenin, vakum stabilize görüntüleme penceresi kullanarak akciğerde uzun vadeli yüksek çözünürlüklü tek hücreli canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik metastaz sırasında stroma ve tümör hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılır.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Daha fazla video keşfet