Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu yöntemin genel amacı, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin uzun süreli, yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; metastazın en erken aşamalarında stroma ve tümör hücreleri arasında hangi etkileşimlerin güvence altına alındığı gibi. Bu tekniğin temel avantajı, canlı, sağlam akciğerin teorik olarak 12 saate kadar tek hücre çözünürlüğünde görüntülenebilmesidir.

Üç inç uzunluğunda 2-0 sütürü, burcun çeyrek inç yukarısında, çift düğümlü bir trakeal katetere bağlayarak başlayın. Daha sonra anestezi uygulanmış bir farenin gözlerine göz merhemi sürün ve tüyleri hayvanın sol tarafından göğsün orta çizgisinden sırtın dörtte birine ve koltuk altından göğüs kafesinin hemen altına kadar çıkarmak için tüy dökücü krem kullanın. Fazla losyonu temizleyin ve açıkta kalan cildi %70 etanol ile sterilize edin.

Sonra, hayvanı entübe edin. Ve 2-0 dikişi burnun etrafına, ön dişlerin altına bağlayın. Kateterleri yerinden çıkarmamaya dikkat ederek hayvanı cerrahi alana taşıyın ve ventilatörü açın.

Ventilatörü trakeal katetere bağlayın. Ardından kateteri buruna ve sol ön ayağı katetere bantlayın. Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini onayladıktan sonra, sol göğüs duvarının üzerindeki bir santimetre karelik cildi çıkarmak için keskin bir makas kullanın.

Meme yağ pedini kaldırın ve açıkta kalan kan damarlarını koterize edin. Daha sonra, yağ yastığını rezeke edin ve ön ayağın tabanındaki aksiller damarı kesmemeye dikkat ederek kas tabakasını göğüs kafesine kadar çıkarın. Altıncı kaburgayı kaldırmak için forseps kullanın.

Ardından, keskin makası beş derecelik sığ bir açıyla tutarak, kaburgayı derideki açıklığın kenarına yakın bir yerde kesin. Göğüs duvarındaki açıklığı genişletmek ve tüm akciğer lobunu açığa çıkarmak için art arda dört kaburgayı çıkarın. Ardından fareyi dikkatlice mikroskop görüntüleme aşamasına aktarın.

Vakum kapalıyken, vakum penceresinin iç haznesini PBS ile doldurun. Fareyi ters çevirin ve açıkta kalan akciğeri vakumlu görüntüleme lamel penceresinin üzerine yerleştirin. Yavaşça vakumu açın.

Farenin göğsünün üzerine iki kez ikiye katlanmış kağıt mendilden yapılmış bir emniyet kemeri yerleştirin ve emniyet kemerini sahne plakasına bantlayın. Sonra hayvanın pençesine bir nabız oksimetresi takın. Ardından çevre odasını sahneye yerleştirin ve fareyi fizyolojik bir sıcaklıkta tutmak için ısıyı açın.

Hayvan pozisyondayken, 25'e 95 sayısal diyafram açıklığına sahip objektif lensini kapak kaymasının yanına getirin. Epifloresan modunda, fitzy kanalını görüntüleyin ve akciğer dokusunu odak noktasına getirin. Daha sonra, 100 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonu içeren steril bir şırınga yükleyin, PBS şırıngasını kuyruk ven kateterinden çıkarın ve tümör hücresi şırıngasını bağlayın.

Tümör hücrelerini yavaşça kuyruk damarına enjekte edin. Daha sonra PBS şırıngasını kuyruk ven kateterine yeniden bağlayın ve mikroskop oküler aracılığıyla akciğer dokusu boyunca tümör hücrelerini bulun. Şimdi PBS şırıngasını 100 mikrolitre rodamin dekstran yüklü bir şırınga ile değiştirin ve dekstranı kuyruk kateteri yoluyla fareye yavaşça enjekte edin.

Dekstran uygulamasını 50 mikrolitrelik, steril, PBS yıkama ile takip edin. Daha sonra, vaskülatürün akışını ve bütünlüğünü görselleştirmek için önceden yerleştirilmiş tümör hücresi konumlarının her birinde görüntüler elde edin. Enjeksiyondan yirmi dört saat sonra, tek tümör hücrelerinin vaskülatür içindeki makrofajlar ve monositlerle etkileşime girdiği görüntülenebilir.

Görüntülemenin kararlılığı, alanın sıralı Z-yığınlarının elde edilebileceği ve üç boyutlu bir rekonstrüksiyonun oluşturulabileceği şekildedir. Burada, 890 mikronluk bir görüş alanını kapsayan, 200'den fazla ve beş dakikayı kapsayan, tek bir metastatik lezyonun akciğer yüzeyinin 15 mikron altında, enjeksiyondan 12 gün sonra beşe beş görüntüleme alanı mozaiği gösterilmektedir. Geniş görüş alanına rağmen, mozaiği oluşturan alttaki çerçevelerin yüksek çözünürlüğü, kromozomal ayrılma ile kanıtlandığı gibi, tek bir hücrenin mitozu gibi hücre altı olayların yakalanmasını sağlar.

Floresan olarak dekstran olarak etiketlenmiş yüksek moleküler ağırlıklı intravasküler enjeksiyon, vasküler lümenin etiketlenmesine neden olur; Bununla birlikte, etiketlenmemiş dolaşımdaki eritrositler ve lökositler dekstranı tıkayabilir. Akciğerin küçük kılcal damarlarında, bu tıkanıklık dekstran sinyalinin yanıp sönmesine ve vasküler sınırlarda tanım kaybına neden olur. Bu protokol tarafından sağlanan yüksek uzamsal stabilite, kan kanalının bulanıklaşmadan zaman ortalamasının alınmasına izin verir, böylece geçici tıkanıklıkları geri yükler.

Diğer sinyal kanalları daha sonra damar sınırlarının net bir görüntüsünü sağlamak için damar sistemi üzerine yerleştirilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, büyük kan damarlarını önce koterize etmeden kesmemeye ve akciğer dokusuna hiç dokunmaktan kaçınmaya dikkat etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, tümör hücresi yayılımının ve çoğalmasının en erken aşamaları görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, vakumla stabilize edilmiş görüntüleme penceresi ile sağlam akciğerde intravital görüntülemenin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.