Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bu yöntemin genel amacı, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak, bozulmamış akciğerin uzun süreli, yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmektir. Bu yöntem, kanser araştırmaları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, metastazın en erken aşamalarında stroma ve tümör hücreleri arasında ne tür etkileşimlerin gerçekleştiği gibi. Bu tekniğin temel avantajı, canlı ve bozulmamış akciğerin teorik olarak 12 saate kadar tek hücre çözünürlüğünde görselleştirilebilmesidir.

İşleme, 2-0 sütürün üç inçlik bir parçasını, burcun bir çeyrek inç yukarısından trakeal katetere çift düğümle bağlayarak başlayın. Ardından, anestezi altındaki farenin gözlerine göz merhemi uygulayın ve göğsün orta hattından sırtın dörtte birine kadar ve koltuk altından göğüs kafesinin hemen altına kadar olan bölgedeki tüyleri depilatuar krem kullanarak temizleyin. Fazla losyonu temizleyin ve açığa çıkan cildi %70 etanol ile sterilize edin.

Ardından, hayvanı entübe edin. 2-0 sütürü, burun ucuna, ön dişlerin altına bağlayın. Kateterlerin yerinden çıkmamasına dikkat ederek hayvanı cerrahi alana taşıyın ve ventilatörü çalıştırın.

Ventilatörü trakeal katetere bağlayın. Ardından kateteri buruna ve sol ön ekstremiteyi katetere bantlayın. Parmak sıkıştırma testine yanıt alınmadığından emin olduktan sonra, sol göğüs duvarının üzerindeki bir santimetrekarelik deri bölgesini keskin bir makasla çıkarın.

Meme yağ pedini kaldırın ve açığa çıkan kan damarlarını koterize edin. Ardından, ön kolun tabanındaki aksiller veni kesmemeye dikkat ederek yağ pedini rezeke edin ve kas tabakasını göğüs kafesine kadar çıkarın. Altıncı kaburgayı kaldırmak için pens kullanın.

Ardından, keskin makası beş derecelik dar bir açıda tutarak, kaburgayı ciltteki açıklığın kenarına yakın bir yerden kesin. Göğüs duvarındaki açıklığı genişleterek tüm akciğer lobunu açığa çıkarmak için ardışık dört kaburgayı çıkarın. Daha sonra fareyi dikkatlice mikroskop görüntüleme tablasına aktarın.

Vakum kapalıyken, vakum penceresinin iç bölmesini PBS ile doldurun. Fareyi ters çevirin ve açıkta kalan akciğeri vakum görüntüleme lameli penceresinin üzerine yerleştirin. Vakumu yavaşça açın.

İkiye katlanmış pelür kağıdından yapılmış bir sabitleme düzeneğini farenin göğsü üzerine iki kez yerleştirin ve düzeneği sahne plakasına bantlayın. Ardından hayvanın patisine bir pulse oksimetre takın. Sonra çevresel hazneyi sahneye yerleştirin ve fareyi fizyolojik sıcaklıkta tutmak için ısıtıcıyı açın.

Hayvan uygun pozisyona getirildiğinde, 25'lik 95 sayısal açıklıklı objektif lensini lamеl yakınına getirin. Epifloresan modunda fitzy kanalını görüntüleyin ve akciğer dokusunu odaklayın. Ardından, steril bir şırıngaya 100 µL tümör hücresi süspansiyonu doldurun, kuyruk ven kateterindeki PBS şırıngasını çıkarın ve tümör hücresi şırıngasını bağlayın.

Tümör hücrelerini kuyruk venine yavaşça enjekte edin. Ardından PBS şırıngasını tekrar kuyruk ven kateterine bağlayın ve mikroskop oküleri aracılığıyla tümör hücrelerini akciğer dokusu boyunca konumlandırın. Şimdi PBS şırıngasını 100 µL rhodamine dextran yüklü bir şırıngayla değiştirin ve dextranı kuyruk kateteri aracılığıyla fareye yavaşça enjekte edin.

Dekstran uygulamasının ardından 50 µL steril PBS ile yıkama yapın. Daha sonra, vaskülarizasyonun akışını ve bütünlüğünü görselleştirmek için daha önce belirlenmiş her bir tümör hücresi konumunda görüntüler elde edin. Enjeksiyondan yirmi dört saat sonra, tekil tümör hücrelerinin damar sistemi içindeki makrofajlar ve monositlerle etkileşimi görselleştirilebilir.

Görüntüleme stabilitesi, alanın ardışık Z-yığınlarının elde edilmesine ve üç boyutlu bir yeniden yapılandırmanın oluşturulmasına olanak tanıyacak düzeydedir. Burada, enjeksiyondan 12 gün sonra, tek bir metastatik lezyonun akciğer yüzeyinin 15 µm altında, 205 dakika boyunca 890 µm'lik bir görüş alanını kapsayan, beş çarpı beşlik bir görüntüleme alanları mozaiği gösterilmektedir. Geniş görüş alanına rağmen, mozaiği oluşturan temel karelerin yüksek çözünürlüğü, kromozomal ayrılma ile kanıtlandığı üzere tek bir hücrenin mitozu gibi hücre altı olayların yakalanmasını sağlamaktadır.

Yüksek moleküler ağırlıklı, floresan işaretli bir dekstranın intravasküler enjeksiyonu, vasküler lümenin işaretlenmesiyle sonuçlanır; ancak, işaretlenmemiş dolaşan eritrositler ve lökositler dekstranı tıkayabilir. Akciğerin küçük kılcal damarlarında bu tıkanma, dekstran sinyalinde yanıp sönmelere ve vasküler sınırlarda netlik kaybına yol açar. Bu protokolün sağladığı yüksek uzamsal kararlılık, kan kanalının bulanıklaşma olmadan zaman ortalamasının alınmasına olanak tanıyarak geçici tıkanmaları giderir.

Diğer sinyal kanalları daha sonra, damar sınırlarının net bir görünümünü sağlamak için vaskülatür üzerine bindirilebilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, büyük kan damarlarını önceden koterize etmeden kesmemeye dikkat etmek ve akciğer dokusuna hiçbir şekilde dokunmaktan kaçınmak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, tümör hücresi yayılımı ve proliferasyonunun en erken evreleri görselleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerde intravital görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.