Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Bu protokolün genel amacı, sinyal-gürültü oranları ve algılama limitleri açısından mevcut optik tekniklere göre avantajlar sağlayabilecek yeni bir preklinik, birlikte çalışabilir, kemilüminesan görüntüleme tekniği sunmaktır. Bu yöntem, biyolojik bilimlerle ilgili birçok alanda geleneksel optik görüntüleme teknikleriyle erişilemeyen temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip olması ve ne anlık ışık ne de radyasyon gerektirmemesidir.

Bulduğumuz şey, bu tekniğin etkilerinin, bu tekniğin sunabileceği yüksek sinyal-gürültü oranları nedeniyle, kanser de dahil olmak üzere çoklu hastalık durumlarının interoperatif görüntülemesine doğru uzandığıdır. Bu teknik için gelen ışığa ihtiyaç duyulmadığından, gelen ışık emilimi ile ilgili herhangi bir sorun yoktur. Ayrıca, kemilüminesan çekirdek molekülünü işlevsel hale getirmek için büyük bir kimyasal alet kutusu mevcuttur.

Prosedüre başlamak için, ters ozmoz suyunda 100 mikrolitrelik standart tris (bypiridine) rutenyum (II) klorür çözeltileri hazırlayın. Daha sonra, her bir standardı 100 mikrolitre 25 milimolar amonyum seryum nitrat çözeltisi ile ters ozmoz suyunda bir mikroskop lamı üzerinde birleştirin. Biyolüminesans okuyucu görüntüleme yazılımını açın ve başlat'a tıklayın.

Görüntüleme modunda, ışıldayan ve fotoğrafın işaretli olduğundan ve floresanın işaretli olmadığından emin olun. Lüminesan pozlama süresini, gruplamayı, f/stop ve emisyon filtresi parametrelerini ayarlayın. Fotoğraf pozlama süresini, gruplamayı ve f/stop parametrelerini ayarlayın.

Ardından konu yüksekliğini görüntülenecek örneğe göre ayarlayın. Kamera ile örnek sahne alanı arasında 14 santimetrelik bir mesafe için görüş alanını B olarak ayarlayın. Numune aşamasında biyolüminesans okuyucu görüntüleme odasının zeminini siyah inşaat kağıdı ile kaplayın.

Ardından, standart karışım damlacığı ile ilk slaydı, damlacık yeşil ışık kutusu artı işaretinde ortalanmış şekilde numune tablasına yerleştirin. Ardından, özel yapım bir nebülizörün üç onsluk sprey şişesini 50/50 su ve etanol çözeltisinde 1:3 trietilamin çözeltisi ile doldurun. Aspirasyon borusunda hava kabarcığı olmadığından emin olun.

Nebulizatör düzeneğini, damlacığın kamera görüşünü engellemeden, püskürtme memesi görüntülenecek damlacığa doğru bakacak şekilde görüntüleme odasına yerleştirin. Nebulizatör güç anahtarının ve güç göstergesinin açık olduğundan, manyetik geçiş anahtarının kapalı olduğundan ve güç nebulizatörü ile uzaktan kumanda kablolarının dolaşmadığından emin olun. Slayt üzerindeki işaretler gibi sıcak noktaları küçük siyah inşaat kağıdı parçalarıyla örtün.

Nebulizatör uzaktan kumanda kablosunun en az 40 santimetresini görüntüleme odasına yerleştirin. Nebulizatör kablolarını kıvırmadan hazne kapısını yavaşça kapatın. Cihaz yazılımında, edin'e tıklayın, otomatik kaydetmeyi etkinleştirin ve veri dosyası yolunu ayarlayın.

Görüntüleme sırasını başlatın. Deklanşör sesli bir tıklama ile açıldığında, numuneye üç patlama trietilamin çözeltisi püskürtmek için nebulizatör düğmesini üç kez değiştirin. Rutenyum görüntüleme ajanının minimum tespit edilebilir konsantrasyonunu belirlemek için prosedürü her standart slaytla tekrarlayın.

İn vivo görüntüleme prosedürüne başlamak için, fosfat tamponlu salin içinde 8 ila 33 nanomol tris (bipiridin) rutenyum (II) klorür içeren 100 mikrolitre çözelti hazırlayın. 25 milimolar sulu bir amonyum seryum nitrat çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, 100 mikrolitre rutenyum görüntüleme ajanını sağlıklı farelerin kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edin.

Fareleri enjeksiyondan 10 dakika sonra karbondioksit boğulması ile kurban edin. Cildi bir Y kesimi ile gövdeden çıkarın ve ardından kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için kostal kemeri çıkarın. Sağ kulakçıkta bir çıkış kesin ve 24 gauge bir iğne ile sol ventriküle 20 mililitre PBS enjekte edin.

Böbreği ve karaciğeri ortaya çıkarmak için göbek derisini kesin. İlgilenilen organ karaciğer, böbrek veya dalak ise, organdan gözle görülür uzunlamasına bir kesik açın. Biyolüminesan okuyucu yazılımında yeni bir görüntüleme dizisi hazırlayın.

Tüm karın görüntülemesi için, fareyi açık karın kameraya bakacak ve baş aleti aletin arkasına bakacak şekilde görüntüleme odasına yerleştirin. İlgilenilen organı yeşil ışık kutusu artı işaretinde ortalayın. Sprey şişesini ve nozulu nebulizatör tertibatından iyice yıkayın ve ardından şişeyi amonyum seryum nitrat çözeltisi ile doldurun.

Nebulizatörü, püskürtme memesi görüntüleme bölgesine yönlendirilmiş olarak görüntüleme odasına yerleştirin. Kameranın engellenmediğinden, kabloların dolaşmadığından ve uzaktan kumanda kablosunun en az 40 santimetresinin haznede olduğundan emin olun. Odayı kapatın ve görüntüleme dizisini başlatın.

Deklanşör bir tıklama ile açılırken, görüntüleme alanına üç kez oksitleyici madde püskürtmek için düğmeyi üç kez değiştirin. Görüntülemeden sonra, nebulizatör tertibatını çıkarın ve amonyum seryum nitratın kristalleşmesini önlemek için püskürtme memesini iyice durulayın. Daha sonraki bireysel organ görüntüleme ve miktar tayini için, fareyi cihazdan çıkarın ve açık vücut boşluğundan başlayarak iç organları çıkarın.

Kas dokusu örneklerini çıkarmak için arka bacak derisini kesin. İlgilenilen organ karaciğer, böbrek veya dalak ise, organı uzunlamasına ikiye bölün. Ardından organı bir Petri kabına veya siyah inşaat kağıdına yerleştirin.

Her organı tüm hayvanla aynı şekilde görüntüleyin ve her sekanstan sonra püskürtme memesini durulayın. Bu prosedürde, farelere rutenyum bazlı bir görüntüleme ajanı enjekte edildi ve ilgilenilen dokuya kemilüminesansı indüklemek için bir oksitleyici püskürtüldü. Bu koşullarda görüntüleme ajanının saptanabilir minimum konsantrasyonu, santimetre kare başına 6.9 pikomol olarak belirlendi.

Biyolüminesans okuyucu ile ilgilenilen organların beyaz ışıkta kemilüminesans görüntüleri elde edildi. Kemilüminesans sinyali ağırlıklı olarak intravenöz enjeksiyonu takiben böbreklerde gözlendi ve hidrofilik tris (bipiridin) rutenyum (II) katyonunun renal eliminasyonunu gösterdi. Görüntüleme ajanının tek başına PBS'ye karşı sinyal-gürültü oranı böbreklerde 27: 1 ve karaciğerde 21: 1 idi.

Fare popliteal lenf nodları ayrıca rutenyum bazlı görüntüleme ajanının daha konsantre bir çözeltisinin deri altı enjeksiyonu ile değerlendirildi. Görüntüleme ajanını içeren lenf bezleri, tek başına PBS içeren lenf bezlerine göre anlamlı derecede daha büyük bir parlaklık gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, ortam ışığını dışlamayı ve rutenyum tris bpy ile kontaminasyonu önlemeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, biyomoleküler görüntüleme alanındaki araştırmacıların farelerde kanser gibi hastalık durumlarını keşfetmelerinin önünü açacaktır. Bu yöntem, geleneksel optik görüntüleme teknikleriyle erişilemeyen sorulara ışık tutabilse de, geleneksel tekniklerle araştırılabilecek herhangi bir soru potansiyel olarak kemilüminesans ile ele alınabilir.