G Protein-seçici GPCR konformasyoları Canlı Hücre Süspansiyon Fluorometer Deneyinde FRET sensörleri kullanılarak ölçülebilir

Bu canlı hücre Forster rezonans enerji transferinin veya FRET bazlı testin genel amacı, farklı agonist koşullar altında G proteini seçici G proteinine bağlı reseptör veya GPCR konformasyonlarını değerlendirmektir. Bu yöntem, GPCR'nin farklı efektörlerle etkileşimleri ve farklı ilaçların reseptör onayı üzerindeki etkisi hakkında GPCR alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, sensörlerin modüler olması ve tam ve G alfa alt birimi dahil olmak üzere farklı GPCR ve G alfa peptit kombinasyonları için kolayca yeniden tasarlanabilmesidir.

Bu yöntem, G proteini seçimi ve farklı lygenlere yanıt hakkında bilgi sağlayabilir. Diferansiyel G protein aktivasyonunun fizyolojik sonucunu araştırmak için de uygulanabilir. Prosedüre başlamadan önce, ilgilenilen hücreleri, kültürler birleşene kadar yüzde beş karbondioksitte nemlendirilmiş bir atmosferde 37 santigrat derecede tam ortamda kültürleyin.

Daha sonra, hücreleri Tripsin ile ayırın ve kültürleri, iki milimetre ortamda hücre başına sekiz kez 10 ila beşinci hücreye, on altı ila 20 saatlik kültür için altı kuyu kabı muamele edilmiş doku kültürüne geçirin. 16 ila 20 saat sonra, hücreler biyolojik bir güvenlik kabinindeki plakalara yapıştığında oyuk başına bir transfeksiyon reaksiyonu hazırlayın ve reaktif karışımlarının 15 ila 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. İnkübasyonun sonunda, her hücre kültürüne kuyucuk boyunca damla damla bir reaksiyon ekleyin.

Reaktifin kültürler boyunca tam bir dağılımını sağlamak için plakayı hafifçe sallayın. Ardından plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. 20 saat sonra, plazma zarının protein ekspresyonu için kültürleri analiz edin ve hücre sağlığını değerlendirin.

Proteinin önemli ölçüde içselleştirilmesi gözlenirse, plazma zarında önemli bir ekspresyon tespit edilene kadar transfeksiyonu izleyin. Protein ekspresyon seviyesinin değerlendirilmesi, optimal bir deney düzeneği için zorunludur. Hücreler zayıf bir şekilde transfekte edilmişse veya protein ekspresyonu çok düşükse, hücrelerin toplanmasını bekleyin.

Aksi takdirde, floresan sinyali analiz için yetersiz olabilir. Hücreler toplanmaya hazır olduğunda, onları biyo-güvenlik kabinine aktarın ve bir mililitre ortamı yavaşça çıkarın. Bir P1000 pipeti kullanarak, hücreleri oyuk başına bir mililitre kalan ortamda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını ayrı ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Hücreleri sayın ve santrifüjleme ile hücreleri peletleyin. Ortamı hücre peletinden çıkarın. Süpernatanı bir mililitre 37 santigrat derece hücre tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Pelet, ikinci dönüşten sonra taze hücre tamponunda mililitre başına dört kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edilir. Daha sonra, bir küvete 90 mikrolitre kontrol hücresi ekleyin ve kontrol FRET spektrumunu elde edin. Her ölçüm için yeni 90 mikrolitre hücre ile üç ila beş tekrar kontrol spektrumu topladıktan sonra, transfekte edilmiş hücreler için süspansiyon, sıkma ve yıkama adımlarını tekrarlayın.

Her 500 mikrolitrelik tüpe 90 mikrolitre transfekte edilmiş hücreyi, bir ısı bloğunda iki ila altı ve sekiz ila 12 tutucuya alikot edin, her bir alikot arasındaki hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. Tüm hücreler transfer edildiğinde, tedavi edilmemiş durum örnekleri için iki ila altı tüplere 10 mikrolitre ilaç tamponu ekleyin. Daha sonra ilaç çözeltisinin bir milimolarından 10 mikrolitreyi sekizinci tüpe ekleyin.

10 dakikadan geri sayım yapmak için bir zamanlayıcı başlatın ve tüpün içeriğini nazikçe karıştırmak için bir P200 pipeti kullanın. Karıştırdıktan sonra tüpü kapatın ve ısı bloğuna geri koyun. Sonra hemen ikinci tüpü alın.

İçeriğini yeni bir uçla nazikçe karıştırın. İşlenmemiş durum küvetine 90 mikrolitre transfekte edilmiş hücre süspansiyonu ekleyin ve küveti florometreye yerleştirin. Kontrol spektrumları ile aynı parametreleri kullanarak numune için FRET spektrumunu elde edin.

Dokuz dakika ve 10 saniyede, bir milimolar ilaç çözeltisinin 10 mikrolitresi ile dokuzuncu tüpü açın. Tüp içeriğini yavaşça karıştırın ve tüpü ısı bloğuna geri koyun. Ardından hemen üçüncü tüpü alın ve küvet içeriğini ikinci tüp için gösterildiği gibi karıştırın ve ölçün.

Beş dakika 10 saniyede, sekizinci tüpü bir P200 pipeti ile hafifçe karıştırın. İlaçla tedavi edilen numune ölçümü için ayrı bir küvete 90 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve ilaç durumu numunesi için FRET spektrumunu elde edin. Tüm spektrumlar alındıktan sonra proje dosyalarını kaydedin.

Küvetleri ultra saf suyla iyice yıkayın ve bir sonraki durum için tüpleri yeniden doldurun. Bu görüntüde, altı kuyulu kaplama ve transfeksiyon için en uygun olan homojen bir hücre kültürü tek tabakası gösterilmektedir. Bununla birlikte, dendritik şekillere yol açan kümelenmiş desenlerde büyüyen bu hücreler, tutarlı bir kaplama ve doğru protein ekspresyon analizi veya FRET ölçümü için önerilmez.

Transfeksiyon koşulları, tekrarlanabilir ifade elde etmek için de optimize edilebilir. Tüm veriler toplandıktan ve analiz için bir CSV dosyasına girildikten sonra, oluşturulan sonuçlar bu temsili RAW ve Normalleştirilmiş ortalama FRET spektrumlarına benzeyecektir. Bu temsili deneyden elde edilen tüm RAW FRET spektrumları, numuneden minimum su zirvesi ile tutarlı bir veri analizine olanak tanıyan pürüzsüz, yeterli bir sinyal-gürültü aralığı gösterir.

Veriler 475 nanometrede normalleştirildiğinde, bu değerin saniyedeki sayıları 1.0 olarak ayarlanır ve tedavi edilen ve edilmeyen numuneler arasındaki 525 nanometre okumasındaki önemli değişiklik belirginleşir. Protein ekspresyonu düşükse veya floresan okuması için küvette zayıf bir transfeksiyon verimliliği veya düşük hücre yoğunluğu varsa, RAW verileri gürültülü olabilir ve arka plan çıkarma ve normalleştirmede bir soruna neden olabilir ve bu da hizalanmayan ve analiz edilemeyen spektrumlara neden olabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 25 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, deneyin tüm adımları boyunca hücreleri ele alırken nazik olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, teknik, farklı reseptör FRET sensörlerini, farklı ilaçları ve efektörleri ve farklı hücre tiplerini test etmek için genişletilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, bu sensörleri kullanan son çalışmaların G protein seçiminin moleküler mekanizmasına ışık tuttuğu GPCR alanına katkıda bulunmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre bağı FRET yapı ölçüm testi kullanarak belirli GPCR onaylarının nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Memeli hücre kültürü ve bazı deneysel ilaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.