Name: İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak İn Vitro Kanser Modelleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Keşfedin RNA dizileme ile ilaç direnciyle ilişkili anormal splicing mekanizmalarını in vitro kanser modellerinde. Bu yöntem, sitotoksisite taraması ve transkriptomik analizi birleştirerek kemoterapi direncinin erken tespitini iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan dirençli hücre hatlarını sağladıkları için Prof. J.J. McGuire, Prof. R. Kofler ve Dr. K. Quint'e teşekkür eder. Çalışma, Amsterdam Kanser Merkezi (CCA) Vakfı (JC, EG ve RS'ye), KiKa (AW için Çocuk Kansersiz Hibesi) vakfı, Mezotelyoma Uygulamalı Araştırma Vakfı'ndan Peter G. Angelos Grant Hukuk Büroları (VEG ve EG'ye), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), ve Regione Toscana Bando FAS Salute (EG'ye).

<ol><li>Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer drug resistance.</a> Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).</li>
<li>McDermott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Development+of+Chemotherapy+and+Targeted+Therapy+Drug-Resistant+Cancer+Cell+Lines%3A+A+Practical+Guide+with+Case+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies.</a> Front Oncol. 4, 40(2014).</li>
<li>Kaspers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prednisolone+resistance+in+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+vitro-vivo+correlations+and+cross-resistance+to+other+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs.</a> Blood. (1), 259-266 (1998).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+the+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: the MTT assay.</a> Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Vichai, V., Kirtikara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+colorimetric+assay+for+cytotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).</li>
<li>Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-mRNA+splicing+in+cancer%3A+the+relevance+in+oncogenesis%2C+treatment+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).</li>
<li>Wojtuszkiewicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folylpolyglutamate+synthetase+splicing+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukemia+are+provoked+by+methotrexate+and+other+chemotherapeutics+and+mediate+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance.</a> Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).</li>
<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).</li>
<li>Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Applications+of+RNA+Sequencing+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinform+Biol+Insights%22%5BJournal%5D)">Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges.</a> Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).</li>
<li>Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+RNA-Seq+and+its+applications+to+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev+Res%22%5BJournal%5D)">Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development.</a> Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stranded+and+non-stranded+RNAseq+transcriptome+profiling+and+investigation+of+gene+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap.</a> BMC Genomics. 16, 675(2015).</li>
<li>Carrara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+detection+workflow+needs+a+careful+combination+of+sample+prep+and+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis.</a> BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSeQC%3A+quality+control+of+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).</li>
<li>Hooper, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+software+for+genome-wide+discovery+of+differential+splicing+in+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genomics%22%5BJournal%5D)">A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data.</a> Hum Genomics. 8, (2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATS%3A+a+Bayesian+framework+for+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data.</a> Nucleic Acids Res. 8, e61(2012).</li>
<li>Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mRNA+splice+variants+by+qRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).</li>
<li>Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-receptor-gene+defects+and+resistance+to+glucocorticoid-induced+apoptosis+in+human+leukemic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines.</a> Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).</li>
<li>Schmidt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+resistance+in+two+key+models+of+acute+lymphoblastic+leukemia+occurs+at+the+level+of+theglucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor.</a> FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).</li>
<li>McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+folylpolyglutamate+synthetase+activity+as+a+mechanism+of+methotrexate+resistance+in+CCRF-CEM+human+leukemia+sublines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).</li>
<li>Quint, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+cells+surviving+gemcitabine+treatment+express+markers+of+stem+cell+differentiation+and+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition.</a> Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX5+is+a+positive+regulator+of+oncogenic+NOTCH1+signaling+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).</li>
<li>Mazurek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+dependence+of+acute+myeloid+leukemia+on+the+DEAD-box+RNA+helicase+DDX5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5.</a> Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).</li>
<li>Calabretta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+PKM+alternative+splicing+by+PTBP1+promotes+gemcitabine+resistance+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells.</a> Oncogene. , (2016).</li>
<li>Azoitei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKM2+promotes+tumor+angiogenesis+by+regulating+HIF-1%CE%B1+through+NF-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation.</a> Mol Cancer. 15 (1), (2016).</li>
<li>Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+modulation+overcomes+glucocorticoid+resistance+in+T-lineage+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia.</a> Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).</li>
<li>Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+ex+vivo+methotrexate+resistance+in+acute+lymphoblastic+and+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia.</a> Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).</li>
<li>Funel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+and+primary+cell+cultures+improve+pharmacogenetic+analysis+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma.</a> Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).</li>
<li>Gillet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+relevance+of+established+cancer+cell+lines+to+the+study+of+mechanisms+of+clinical+anti-cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).</li>
<li>Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada ilaç direnci ile ilişkili olarak farklı birleştirme olayları tanımlamak için analizler köklü sitotoksisite tarama teknikleri ve güçlü NGS tabanlı transkriptomik birleştiren yeni bir yaklaşım açıklar. Spektrofotometrik analizler, in vitro kanser modellerinde ilaç duyarlılığını değerlendirmek için uygun ve sağlam yüksek verimlilik yöntemleri ve sitotoksisite gösterimleri yapan birçok laboratuvarlar için ilk tercih etmektedir. Bu yöntem için Giderme yanı sıra olası varyasyonlar yaygın başka bir yerde 4...

Kanser tedavisinde, kemoterapi malign hücrelerin direnci, ya içsel ya da uzun süreli ilaç maruziyeti üzerine edinilen önemli gelişmelere rağmen, lösemi ve solid tümörlerin 1 geniş bir yelpazede tedavi başarısızlığı için en önemli nedenidir. In vitro hücre hattı modellerinde ilaç direncini altında yatan mekanizmaları nitelendirmek için kemoterapötik maddelerin dirençli kanser hücrelerinin adım adım seçimi ile geliştirilir. Bu prosedür klinik ortamlarda kullanılan rejimleri taklit ve bu nedenle ilgili direnç mekanizmaları derinliği soruşturma sağlar. Tedavi hayatta dirençli hücreler daha sonra hücre canlılığı / sitotoksisite deneyleri 2 kullanılarak ebeveyn duyarlı hücrelerden ayırt edilir. Birincil hücrelerin in vitro ilaç direnci profilleri kemoterapi 3 klinik yan önemli ilgili olduğu gösterilmiştir. Yüksek verim cytotoxicity deneyler, in vitro ilaç duyarlılığını belirlemek için uygun bir yöntem teşkil etmektedir. Burada, hücre canlılığı ile değerlendirilir, örneğin 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazolyum bromür - yani, belirli alt tabakalar metabolik dönüşüm (dayanır MTT deneyi 4, böylece, hücrelerin mitokondrial faaliyeti yansıtan renkli ürünlere tetrazolyum tuzlarının kullanımı). Alternatif olarak, hücresel protein içeriğini sülforhodamin B (SRB) deneyi 5 kullanılarak belirlenebilir. Burada, yaşayabilir hücrelerin sayısı gerek olmadan, bir spektrofotometre, uygun bir dalga boyunda ölçülen optik yoğunluk (OD) ile orantılıdır yaygın ve zaman alıcı bir hücre sayımı işlemleri. Belirli bir kemoterapötik ilaç ile uyarılan büyüme inhibisyonu hücreleri test maddesi ile muamele edilmiş ve muamele edilmemiş kontrol hücrelerinin OD ile karşılaştırıldığı kuyu OD göre hesaplanabilir. Bir doz-tepki eğrisi obta olankontrol hücrelerine göre canlı hücre yüzdeleri karşılık ilaç konsantrasyonu işaretlenmesiyle çağırın. Son olarak, ilaç duyarlılığı tedavi edilmemiş hücrelere (IC50) ile kıyaslandığında hücre büyüme inhibisyonu% 50 ile sonuçlanan konsantrasyon olarak kaydedilmiştir. ilaç direncinin altında yatan mekanizmalar, ilaç etkinliği ve hücresel metabolizma belirleyicilerinin gen ifadesini etkileyen değişiklikler gibi pek çok farklı anormallikleri içerir. Mutasyonlar, aberasyonların bir transkripsiyonel olarak ve post-transkripsiyonel seviyede yanı sıra rahatsız epigenetik düzenlemeler de dahil olmak üzere, bu moleküler lezyonlar genellikle ilaç metabolizması ya da apoptoz 6 ya oynayan genleri etkiler. Alternatif pre-mRNA ekleme ve karmaşık düzenleme son zamanlarda kanser hücrelerinin 7 ilaç direnci dikte edebilir bir roman varlık olarak önem aldık. İnsan genlerinin% 95 a kadar, alternatif olarak, bu aracılığıyla normal hücrelerde birleştirilirAynı genin birçok farklı protein izoformları üreten sıkıca düzenlenmiş süreç. Alternatif yapıştırma genellikle kanser deregüle ve birkaç tümör ilaç metabolizmasında (örn, deoksisitidin kinaz, folylpolyglutamate sintetaz, veya çoklu ilaç direnci proteini) 6,8 katılan genlerin artan sayıda değişik ekleme mekanizması ile karakterize edilir. Bununla birlikte, ilaç dirençli hücrelerin yapıştırma profillerinin kapsamlı bir analiz acı eksiktir. Nedenle, bir alternatif birleştirme analizi için yüksek verimli yöntemlerin geliştirilmesi zorunludur. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları geliştirmeye yardımcı olabilir. Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerinin hızla gelişmesi genom ifade düzenlenmesini ve çeşitli biyolojik süreçler 9 rollerini yöneten moleküler mekanizmaları içine yeni anlayışlar ile biyomedikal araştırmalar zenginleştirdi. RNA dizi (RNA DİZ) güçlü bir alt uygulamadırtranskriptomik alanında NGS arasında. Bu, miRNA, siRNA ve diğer küçük RNA (nitelik ve nicelik) aynı anda binlerce gen ifadesi desen bir genom profil izin verir ve iyi roman kodlama mRNA karakterizasyonu için uygun hem de uzun olmayan kodlama RNA sınıflar (örneğin, snRNA ve piRNA) 10,11. RNA Seq transcriptome karakterizasyonu (örneğin, Sanger dizileme ve anlatım mikroarray&#39;ler) önceki teknolojilere göre birçok avantajı vardır. Bu mevcut genom açıklama dayalı değildir, bu kararın bir tek nükleotid düzeyi vardır ve ekspresyon seviyesi tahmini için daha geniş bir dinamik aralığı vardır. Kısaca, RNA DİZ deneyler temel deneysel akışı cDNA kütüphane yapımı ve son olarak, yoğun paralel derin sıralama 12,13 dönüşüm ve ardından poliadenile transkript (mRNA) seçimi ve parçalanma meydana gelir. Nedeniyle sequencin hızlı düşüşSon birkaç yıldır, RNA-seq üzerinde g maliyetleri yavaş yavaş diğer teknolojiler yerini almaktadır ve önemli çabalar kütüphane hazırlık protokolleri geliştirmek için yapılıyor. Örneğin, deoksiüridin trifosfat (dUTP) ve önceki PCR amplifikasyonu, urasil-DNA glycosilase (Yeraltı) ile işaretli olan iplikçik sindirilmesi ile ikinci dizi cDNA, işaretleyerek mRNA transkriptlerinin şerit bilgilerini korumak için mümkündür. Bu süreç ekspresyon düzeyleri 14,15 gen açıklama ve tahmin doğruluğunu artırır. Analiz ve RNA-seq verilerin yorumlanması biyoinformatik boru hatları 16,17 içinde karmaşık ve güçlü hesaplama yazılım paketleri ve işlem gerektiren. İlk olarak, ham sıkı kalite gereksinimlerini ulaşamayan dizileri, teknik ve biyolojik eserlerin çıkarılması ve atılması (kesim) tarafından kalite kontrol sürecinden okur. Daha sonra bir referans genom eşleştirilir ve endekslidir her bir örnek için okurGen düzeyinde, ekson düzey ya da transkript düzeyinde içine sırayla her kategorinin bolluğu belirlemek için. Uygulamaya bağlı olarak, rafine edilmiş veriler daha sonra alel-spesifik ekspresyonu, alternatif uç uca eklenmesi gen füzyonu ve tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP), 12 tanımlanması için istatistiksel model hesaplanmıştır. Son olarak, seçilen seviyeye (yani, gen ekspresyonu veya alternatif ayırma) ile diferansiyel analizi, farklı koşullar altında elde edilen örnekleri karşılaştırma için kullanılabilir. Diferansiyel yapıştırma analizi iki örnek arasındaki ekleme sitesi kullanımında farklar açıklanır. Bu amaçla ayrılmış yazılım paketleri giderek artan sayıda, farklı istatistiksel modeller, performans ve kullanıcı arayüzü 18 dayalı bulunmaktadır. Bunlar arasında, PASPASLAR (Transkript yapıştırma değişkenli Analizi) Bayes istatistiksel çerçeveye dayalı bir serbestçe kullanılabilir ve kesin hesaplama aracı olarak ortaya çıkmaktadır ve farklılık sorumluluk yönün tespit etmek için tasarlanmıştek veya eşli uç RNA-seq veri birinden rential yapıştırma olayları. Hizalanmış (.bam) dosyaları başlayarak, MATS alternatif birleştirme olayları tüm önemli türleri algılayabilir (ekson atlama, alternatif 3 &#39;splice site alternatif 5&#39; splice site birbirini dışlayan ekson ve intron tutma - Ayrıca bakınız Şekil 1). İlk olarak, yazılım tanımlar örneğin ekson atlama için, belirli bir ekleme olayı destekleyen okur ve iki tip bunları sınıflandırır. incelenen ekson içinde harita ve belirli ekson ve iki memba ve mansap yan ekzon arasındaki kavşaklar yayılan (kanonik ekleme olayı için) &quot;İçerme okur&quot;. İki yan ekzon arasındaki kavşak yayılan (alternatif bağlantı olayı için) &quot;atlanıyor okur&quot;. Daha sonra, MATS hem kurallı ve alternatif etkinlikler için normalize içerme seviyesini döndürür ve numune veya koşulları arasındaki değerleri karşılaştırır. Sonuçta, bu P-değeri a hesaplarnd yanlış keşif oranı (FDR) iki durum arasında bir genin varyantı oranında fark her ekleme olayı 19,34 için belirli bir kullanıcı tanımlı eşiği aşan varsayarak. RNA seq ile birlikte diferansiyel yapıştırma analizi takiben, geniş bir deneysel doğrulama gerçek pozitif gen adayları 18 belirlemek için garanti edilir. Kantitatif ters transkribe-polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) RNA Sekans analizi 20 elde edilen aday doğrulama en yaygın olarak kullanılan ve en iyi yöntemdir. Bu yazının amacı solid tümörlerin ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci ile ilişkili birleştirme profilleri araştırmak için sağlam bir metodoloji sağlamaktır. Yaklaşımımız ilaç direnci belirtilen genler onaylanması için kurulmuş bir QRT-PCR yöntemi ile kombinasyon halinde ilaç dirençli kanser seçilen hücre hattı model RNA seq göre transcriptome profil kullanmaktadır. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu çalışmada kullanılan insan lösemi hücre hattı modelleri çocuk T hücre akut lenfoblastik lösemi dahildir (T-ALL) hücre çizgisi CCRF-CEM (CEM-WT), iki glukokortikoid (GC) dayanıklı alt klonlar CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) olup, CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 ve metotreksat (MTX) -dirençli subline CEM / R30dm 23. GCS, MTX göre mevcut tedaviler vakaların yaklaşık% 90, klinik fayda oluşturulması da, GC-direnç ortaya hala açık molekül mekanizma ile çözülmemiş bir sorun teşkil etmektedir. GC dayanıklı alt klonları izole etmek için, CEM-WT, hücreler, 2 ila 3 hafta içinde 1 uM deksametazon (Dex) &#39;de kültürlenmiştir. MTX dirençli subline CEM / R30dm tekrarlanan kısa dönem (24 saat) klinik protokollere bir taklit olarak 30 uM MTX CEM-WT hücrelerinin maruz kalma yoluyla geliştirilmiştir. İlginç bir şekilde, Bu hücre hattı ayrıca mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir olan Dex çapraz direnç (yayınlanmamış sonuçlar) görülür. katı tumya da bu çalışmada incelenen modelin kemoterapiye olağanüstü refrakterliği için ünlü pankreatik duktal adenokarsinom vardır. Bu amaçla, Panc-1 hücre çizgisi ve ilaç 24 1 uM sürekli inkübe etmek suretiyle elde edilen kendi gemsitabin dayanıklı alt klon Panc-1 R seçilir. Burada üç protokolleri birleştirerek in vitro ilaç direnci yatan yeni mekanizmalarını keşfetmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır: kolorimetrik sitotoksisite deneyleri ile ilgili yeni uç uca eklenen varyantları belirlemek için lösemik hücreler ve katı tümörler, RNA seq göre boru kanser hücrelerindeki ilacın duyarlılığını değerlendirmek için ilaç duyarlılık / direnç ve RT-PCR ve QRT-PCR analizi potansiyel adayları doğrulamak için.

<table><tbody><tr><td>Sulforhodamine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230162</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251399</td><td></td></tr><tr><td>CCRF-CEM</td><td>ATCC, Manassas, VA, ABD</td><td>ATCC CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>Panc-1</td><td>ATCC, Manassas, VA, ABD</td><td>ATCC CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>DMEM yüksek glikoz</td><td>Lonza, Basel, İsviçre</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, ABD</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır ve buzağı serumu</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>penisilin G streptomisin sülfat</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, ABD</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) -aminometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>MTT formazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2003</td><td></td></tr><tr><td>Anthos-Elisa-reader 2001</td><td>Labtec, Heerhugowaard, Hollanda</td><td></td><td>UV-Vis 96 kuyulu plaka spektrofotometresi</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 kuyulu plakalar</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M0812-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA Solüsyonu 100 ml</td><td>Lonza, Basel, İsviçre</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Hücre Kültürü Şişeleri 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya</td><td>82051-074</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Hücre Kültürü Şişeleri 75 cm3</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (NaCl% 0.9)</td><td>B.Braun Melsungen AG, Almanya</td><td>362 3140</td><td></td></tr></tbody></table>

İlaç direnci İlgili roman splice türevlerini algılamak için rna sıralamayı kullanarak<em&gt; İn vitro</em&gt; kanser modelleri

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

İlaç direnci hematolojik malignanlıklar ve katı tümörlerin her ikisi için, kanser tedavisinde önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Intrinsik ya da kazanılmış direnci artan ilaç eleme dahil mekanizmalar, bir dizi neden olabilir, ilaç alımını, ilaç inaktivasyonunu ilaç hedefleri değişiklikler azalmıştır. Son veriler, diğer daha iyi bilinen genetik (mutasyon, amplifikasyonu) ve epigenetik (DNA hipermetilasyonu histon post-translasyonel modifikasyon) modifikasyonlarla, ilaç direnci mekanizması, aynı zamanda birleştirme sapmaları ile düzenlenir olabileceğini göstermiştir. Bu daha etkili tedavi yaklaşımları planlamak için gelecekte dikkat edilmesi gereken soruşturma hızla büyüyen bir alandır. Bu yazıda anlatılan protokol solid tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran hedefleniyor. Bu hedefe, biz RNA seq ve kurmak yoluyla in vitro modellerinde bazılarının transkriptomik profillerini analized bir QRT-PCR tabanlı yöntem aday genleri doğrulamak için. Özellikle, DDX5 ve PKM&#39;si kopyasının farklı kesilmesinden değerlendirildi. hesaplamalı araç PASPASLARI tarafından tespit edilen anormal yapıştırma farklı DDX5 ekleme varyantları ebeveyn vs dirençli hücrelerde ifade gösteren, lösemi hücrelerinde doğrulanmıştır. Bu hücrelerde, daha da gemsitabin maruz kalma ile tetiklenen ilaç direnci farklı mekanizmayı göstermektedir ebeveyn Panc-1 hücreleri ile karşılaştırıldığında Panc-1 gemsitabin dayanıklı muadili saptanmadı yüksek Pkm2 / PKM1 oranı, gözlendi.

Protokolde tarif edilen sitotoksisite deneyleri, in vitro olarak kemoterapötik maddelerin kanser hücrelerinin direncini değerlendirmek için güvenilir ve sağlam bir yöntem sağlar. CEM / R30dm, CEM-R5 ve CEM-C3: MTT testi vasıtasıyla, Dex Duyarlılık Dex duyarlı ebeveyn CEM-WT hücreleri dahil olmak üzere dört T-ALL hücre çizgileri, ve üç Dex dayanıklı alt hatları belirlenmiştir. ve Dex dirençli hücre hatları (640 uM - 0.33 nM) - İki farklı konsantrasyon aralıkları CEM-WT arasındaki...

Burada katı tümörler ve hematolojik malignitelerde ilaç direnci üzerinde anormal yapıştırma etkisini araştıran amaçlayan bir protokol açıklar. Bu hedefe, biz RNA seq ile ebeveyn ve in vitro dirençli modellerin transkriptomik profillerini analiz ve aday genler doğrulamak için bir QRT-PCR tabanlı bir yöntem kurdu.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Bu protokolün genel amacı, solid tümörlerin ve hematolojik malignitelerin in vitro modellerinde, aberrant splicing (hatalı ekleme) ile ilaç direnci profilleri arasındaki ilişikiyi incelemektir. Bu yöntem, post-transkripsiyonel düzeyde ilaç direncinin altında yatan mekanizmalar nelerdir gibi, moleküler farmakoloji ve kemoterapi direnci alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, iyi tanımlanmış sitotoksisite tarama protokolünü, güçlü bir yeni nesil dizileme tabanlı transkriptomik analiz ile birleştirmesidir.Bu teknik, kemoterapi başarısızlığının altında yatan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir ve ilaç direncinin erken tespitini geliştirecektir. Bu yöntem, hücre hattı modellerinde ilaç direncinin genom genelindeki belirleyicileri hakkında bilgi sağlayabilir. Ancak aynı zamanda, primer hasta örnekleri ve xenograft gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Bu prosedür, Amsterdam Kanser Merkezi'ndeki laboratuvarımızdan teknisyen Johan Fomirno tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Lökemik hücreler için MTT analizini gerçekleştirmek üzere, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir deney plakası hazırlayın. Kuyucukları ilaç konsantrasyonları, kontrol hücreleri ve hücre içermeyen kontrol besiyeri için ayırın.Deksametazon veya dex için bir ilaç dilüsyon serisi hazırlayın. Her dex dilüsyonundan 30 µL'yi 96 kuyucuklu plakanın uygun bir kuyucuğuna ekleyin. Her konsantrasyonun üç paralel (triplicate) olarak eklendiğinden emin olun.Eksponansiyel olarak büyüyen lökemik hücreleri hasat edin ve optimal ekim konsantrasyonlarında yeniden süspande edin. İlaç çözeltisi veya büyüme ortamı içeren her bir kuyucuğa 120 microliters hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta, %5carbon dioxide içeren ortamda 72 hours boyunca inkübe edin. İnkübasyon adımının ardından, tekrarlayıcı bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 15 microliters MTT reaktifi ekleyin.Plakayı, dakikada maksimum 900 sarsıntı hızına sahip bir plaka sallayıcı ile beş dakika boyunca sallayın. Plakaları, hücre kültürü inkübatöründe 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbon dioksit ortamında tekrar yerleştirin ve dört ila altı saat daha inkübe edin. İnkübasyonun ardından, absorbans değerleri bileşiğin uygun şekilde çözünmesine bağlı olduğundan, formazan kristallerini iyice yeniden süspanse ettiğinizden emin olun.Her kuyucuğa 150 µL asitlendirilmiş izopropanol ekleyin ve tüm formazan kristallerini tamamen yeniden süspande etmek için çok kanallı bir pipetle iyice karıştırın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, arka plan OD'sini düzelterek doğru bir ölçüm sağlamak için 540 ve 720 nm'de optik yoğunluğu veya OD'yi belirleyin. Pankreatik karsinom hücreleri için SRB analizi gerçekleştirmek üzere, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir deney plağı hazırlayın. Eksponansiyel fazda büyüyen pankreatik karsinom hücrelerini, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalara, 100 µL besiyeri içerisinde uygun yoğunlukta üç paralel şeklinde ekin.Hücrelerin plakaya düzgün şekilde yapışmasını sağlamak için, yalnızca ortam içeren kuyucuklara 100 µL ortam ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO₂ içeren ortamda gece boyunca inkübe edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir dilüsyondan 100 µL'yi 96 kuyucuklu plakanın uygun bir kuyucuğuna ekleyin. Her konsantrasyonun üç tekrarlı (triplicate) olduğundan emin olun.37 °C'de %5 karbondioksit ile 72 saat boyunca inkübe edin. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak kuyucuklara 25 µL soğuk TCA çözeltisi ekleyin. Proteinlerin kuyucukların dibinde çökelmesi ve fikse olması için plakaları 4 °C'de en az 60 dakika boyunca inkübe edin.Besiyerini uzaklaştırarak plakayı boşaltın ve bir peçete ile kısa süreliğine kurulayın. Plakayı boşaltıp oda sıcaklığında kurutmadan önce beş kez musluk suyu ile yıkayın. Tekrarlayıcı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 50 µL SRB çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca boyayın.Ardından, SRB boyasını uzaklaştırarak plakayı boşaltın. Plakayı %1 asetik asit ile dört kez yıkadıktan sonra plakayı boşaltın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 150 microliters Tris solüsyonu ekleyin ve bir plaka çalkalayıcıda, dakikada maksimum 900 sarsıntı hızında üç dakika boyunca karıştırın.Optik yoğunluğu 540 nanometrede okuyun. Numuneleri 300 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, ticari olarak satılan silika membran spin kolonlarını kullanarak toplam mRNA'yı ekstrakte edin.UV-Vis spektrofotometre kullanarak toplam RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. Sekanslama kütüphanesini hazırlamak için örnek başına iki mikrogram toplam mRNA kullanın. mRNA kütüphane hazırlama protokolünü üretici talimatlarına uygun olarak takip edin.Kütüphaneler bir bioanalyzer kullanılarak tek bir örnekte litre başına 10 nanomol nihai konsantrasyona kadar havuzlandıktan sonra, tek okumalı 100 baz çifti modunda yüksek kapasiteli bir dizileme sistemi kullanın. Tüm primerleri metin protokolünde açıklandığı şekilde tasarlayın. İlk zincir cDNA sentezi için, izole edilen bir mikrogram RNA'nın, steril su ile bire beş oranında seyreltilmiş reaksiyon tamponu içindeki mikrolitre başına 200 ünite Moloney murine leukemia virus ters transkriptazı kullanılarak cDNA'ya ters transkripsiyonunu gerçekleştirin.RT-PCR reaksiyonunu gerçekleştirmek için, PCR reaksiyon karışımına bir mikrolitre cDNA ekleyin ve tüpleri termosikletöre yerleştirin. Programı metin protokolünde açıklandığı şekilde çalıştırın. PCR işleminin ardından, örnekleri %1'lik agaroz jele yükleyin ve jeli bir elektroforez sisteminde TBE tamponu içerisinde 100 volt ile yaklaşık 30 dakika boyunca çalıştırın.Çapraz kontaminasyonu önlemek için qRT-PCR analizi gerçekleştirirken filtre uçlar kullanın. qRT-PCR yapmak için, tespit edilecek her bir spesifik ekleme varyantı ve housekeeping geni için siyanin yeşili PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Master mix'i beyaz bir 96 kuyucuklu plakaya yükleyin ve her örnek için çiftler hazırlayın.Plakayı termosikletöre yerleştirmeden önce her karışıma suda 10 kat seyreltilmiş beş µL cDNA ekleyin. Lösemi hücreleri için MTT analizi ve pankreas karsinom hücreleri için SRB analizi ile belirlenen büyüme inhibisyon eğrileri burada gösterilmiştir. Deksametazon dirençli ve gemsitabin dirençli hücrelere ait eğriler, parental duyarlı hücrelere kıyasla büyüme inhibisyonunu belirtecek şekilde sağa kaymıştır.Tüm hücre hatları için cDNA kütüphanelerinin konsantrasyonu ve kalitesi, bir bioanalyzer DNA çipi ile belirlenir. Elektroferogramlar, sonraki RNA dizileme prosedürü için iyi kaliteye işaret eden, yaklaşık 300 baz çiftinde floresan pikleri göstermektedir. Aday gen DDX5'in kısa okumaları, bağlantı çizgilerinin ekleme eklemlerini (splice junctions) temsil ettiği Sashimi grafikleri şeklinde görselleştirilebilir.DDX5 transkripti, glukokortikoid dirençli hücre hatları olan CEM-C3 ve CEM-R5 ile karşılaştırıldığında, CEM vahşi tip ve CEM/R30dm hücrelerinde ekzon 12'nin farklı kullanımını göstermektedir. RNA dizileme sonuçları, primer çiftleri ve alternatif olarak eklenen ekzonun üst ve alt kısmında yer alan eksonlara verilen verimle seçilen genler üzerinde RT-PCR yapılarak doğrulanmıştır. DDX5 geninin diferansiyel eklenmesi burada gösterilmiştir.İzoform spesifik ters primerler kullanılarak qRT-PCR analizi ile diferansiyel eklenmiş transkriptlerin kantifikasyonu, DDX5 delta ekzon 12 splice varyantının ve spesifik glukokortikoid dirençli alt hücre hatlarının spesifik down-regülasyonunu doğrular. Bu teknik uzmanlaşıldığında, üç ila dört hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, degradasyonu önlemek için RNA örneklerini buz üzerinde tutmayı hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, yeni bir splice varyantının ektopik aşırı ekspresyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu, alternatif splicing profilinin ilaç direnci üzerindeki fonksiyonel etkisi gibi ek sorulara yanıt verecektir. Bu teknik, moleküler farmakoloji alanındaki araştırmacıların ilaç direncinin genom çapındaki belirleyicilerini keşfetmelerine yol açabilir.

using-rna-sequencing-to-detect-novel-splice-variants-related-to-drug

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Burada, hassas ve belirli algılama dizileri gibi tek hücre düzeyinde tek nükleotid çözünürlük ile 50 nukleotid kısa sağlayan bir in situ hibridizasyon tahlil açıklayın. El ile veya otomatik olarak gerçekleştirilebilir, tahlil splice türevleri, kısa dizileri ve mutasyonlar doku çerçevede görselleştirme etkinleştirebilirsiniz.

Genetik varyantların, kısa hedefleri ve nokta mutasyonlar bir RNA In Situ hibridizasyon tahlil ile morfolojik doku bağlamda görüntülenmesi

Bu protokol, kemoterapötik tedaviden sonra alternatif birleştirme regülasyonunda karakteristik olmayan işleve sahip bir proteinin rolünü değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir araç sunar.

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.

RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

Protokol, mikroRNA ve çoğullanmış proteinleri aynı anda tespit etmek ve ölçmek için formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile tandem bir immünofloresan hibridizasyon testini tanımlar.

Yeni Bir Tespit ve Miktar Belirleme Yöntemi Olarak Kilitli Nükleik Asit Yerinde Hibridizasyon Yoluyla MikroRNA Amplifikasyonu ve Tanınması

Keşfedin RNA dizileme ile ilaç direnciyle ilişkili anormal splicing mekanizmalarını in vitro kanser modellerinde. Bu yöntem, sitotoksisite taraması ve transkriptomik analizi birleştirerek kemoterapi direncinin erken tespitini iyileştirir.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak

Daha fazla video keşfet