Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme Drosophila Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler
29 Aralık 2016
Burada, Drosophila gastrulasyonunun canlı görüntülerini yakalamak için bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, erken gelişimde yer alan apikal daralmayı daha iyi anlamamızı ve doku yapısı modifikasyonu sırasında hücresel hareketleri yöneten mekanizmaları daha fazla analiz etmemizi sağladı.
Bu prosedürün genel amacı, Drosophila gastrulasyonu sırasında hücresel şekli ve hareketi daha iyi anlamaktır. Burada, embriyonik gelişimin bu aşamasında morfogenetik hücresel hareketin başlatılmasını test etmek için Drosophila gastrulasyonunun sağlam bir ölçüm yöntemini sunuyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, gastrulasyon sırasında hücrenin yeniden düzenlenmesinin, gastrulasyon sırasında apikal daralma ile birlikte tanımlanabilmesidir.
Deneye başlamak için 375 mililitre su karışımı hazırlayın. 125 mililitre %100 piyasada bulunan elma suyu. 12.5 gram agar.
12.5 gram glikoz. Daha sonra, agar eriyene kadar karışımı bir mikrodalgada ısıtın. Ve üç santimetrelik bir hücre kültürü kabına dökün.
Karışımı ileride kullanmak üzere 4 santigrat derecede saklayın. Elma tabağını hazırladıktan sonra, sineklerin yumurtlamasını sağlamak için üzerine ince bir tabaka yoğrulmuş maya ezmesi ekleyin. 25 erkek ve 25 dişi sineği yoğurulmuş maya ile kaplı bir elma tabağına bir şişeye koyun.
Sineklerin daha fazla yumurta bırakmasını sağlamak için plastik Drosophilas stok şişelerini alüminyum folyo ile sarın. Şişeyi gece boyunca bir kuluçka makinesinde baş aşağı tutun. Ertesi sabah elma suyu tabağını yenisiyle değiştirin.
Daha sonra şişeyi alüminyum folyo ile sarın ve sineklerin üç ila dört saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin. Sinekler yumurtladıktan sonra, yumurtaları bir pamuklu çubukla plakadan gevşetin. Embriyoları bir süzgeçte toplayın ve fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın.
Embriyoları 12 oyuklu kültür kaplarında PBS ile üç kez daha yıkayın. Embriyoları 12 oyuklu kültür kaplarında% 50 çamaşır suyu ile dekoryonlayın. Dekoryonasyon işleminden sonra embriyoları PBS ile üç kez daha yıkayın.
Embriyoları PBS içeren üç santimetrelik bir hücre kültürü kabına aktarın. Ve mikroskop altında beşinci aşama embriyoları, sınırlarındaki şeffaflık seviyesine göre seçin. 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, aşamalı embriyoları toplayın.
Daha sonra, seçilen iki embriyoyu bir cam kapak fişine yerleştirin ve fazla PBS'yi kağıt mendil ile çıkarın. İnce bükülmüş bir kağıt mendil ile embriyoların sırt tarafını kapak kızağına kadar yönlendirin. Daha sonra embriyoları ince bir iğne kullanarak silikon gres ile cam kapak astarına tutturun.
Embriyoların üzerine küçük bir damla içi boş karbon yağı 700 ekleyin ve embriyoları içeren lamel girintili lamın üzerine baş aşağı yerleştirin. Slaytın altında biraz boşluk bırakarak. Ardından kapak fişini slayta yapıştırın.
Son olarak, embriyoları bir konfokal görüntüleme sistemi, bir argon 488 lazer ve bir yağa daldırma hedefi kullanarak inceleyin. Gastrulasyon sırasında Drosophila'nın tek tek hücrelerin apikal alanlarını analiz etmek için 500 saniye boyunca hücre hareketinin DE-cadherin GFP'si kullanılarak canlı görüntülemeden hızlandırılmış görüntüler elde edildi. 500 saniyede, apikal daralma ve istila açıkça görülebilir.
Yöntemimizi kullanarak. Drosophila gastrulasyonunun moleküler mekanizmalarının yanı sıra kanser metastazında rol oynayan epitelden mezenkimal geçişe daha fazla anlayabiliriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, erken gelişim sırasındaki apikal daralmaya dair anlayışımızı geliştiren, Drosophila gastrülasyonunun canlı görüntülerini yakalamaya yönelik bir prosedür sunmaktadır. Bu teknik, doku yapısının modifikasyonunda yer alan hücresel hareketlerin ayrıntılı analizine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişim Biyolojisi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Drosophila gastrülasyonu, embriyonik gelişimin kritik bir evresidir.
- Hücre şeklini ve hareketini anlamak, gelişim süreçlerini kavramak için temel teşkil eder.
- Apikal daralma, morfogenetik hareketlerde önemli bir rol oynamaktadır.
- Canlı görüntüleme teknikleri, dinamik hücresel davranışlar hakkında içgörüler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila gastrülasyonu sırasındaki hücresel hareketlerin anlaşılmasını geliştirmek.
- Morfogenetik hücresel hareketleri ölçmek için sağlam bir yöntem geliştirmek.
- Gastrülasyon sırasında hücre yeniden düzenlenmelerini ve apikal daralmayı tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için spesifik bir karışımın hazırlanması.
- Gastrülasyon sırasında Drosophila embriyolarının canlı görüntülemesi.
- Hücresel hareketlerin ve şekil değişikliklerinin analizi.
- Temel morfogenetik olayların tanımlanması.
Temel Sonuçlar
- Drosophila gastrülasyonunun canlı görüntülerinin başarıyla yakalanması.
- Apikal daralma ve hücre yeniden düzenlenmesinin tanımlanması.
- Erken gelişim sırasındaki hücresel dinamiklerin geliştirilmiş bir anlayışı.
- Gelişim biyolojisindeki gelecek çalışmalar için sağlam bir metodoloji.
Sonuçlar
- Bu prosedür, Drosophila gastrülasyonu hakkında değerli bilgiler sağlamaktadır.
- Canlı görüntüleme, hücresel hareketlerin incelenmesi için güçlü bir araçtır.
- Bulgular, gelişimsel süreçlerin daha geniş kapsamlı anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Drosophila gastrülasyonu sırasında hücre şekli değişikliğinin ve hareketinin canlı görüntülemesi, fibroz ve kanser metastazı ile ilişkili bir süreç olan epitelden mezenşime geçişin (EMT) temelindeki moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir platform sunar. Bu yöntem, apikal büzülmenin ve hücre yeniden düzenlenmesinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlayarak, EMT ile ilgili yolakların erken aşamadaki hedef doğrulamasında öngörülebilir güvenilirliği destekler. Bu yaklaşım, gelişimsel biyolojiden biyofarma Ar-Ge'sindeki hastalıkla ilgili mekanistik çalışmalara geçişte translasyonel sürekliliği güçlendirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Canlı, çok hücreli bir bağlamda EMT ile ilgili gen fonksiyonlarının ve yolak dinamiklerinin sorgulanmasına olanak tanır.
- Hastalık mekanizmalarıyla bağlantılı morfogenetik olayların doğrudan görselleştirilmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Apikal daralmayı ve hücre kaderi geçişlerini kontrol eden genlerin fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
- Onkoloji ve fibrozis portföylerinde EMT modüle eden hedeflerin önceliklendirilmesi için öngörücü güven sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Hücre hareketini ve şekil değişikliklerini gerçek zamanlı olarak nicelendirmek için valide edilmiş bir görüntüleme sistemi kurar.
- Apikal daralmanın ve hücre yeniden düzenlenmesinin kantitatif analiz çıktıları olarak tekrarlanabilir şekilde ölçülmesini sağlar.
- EMT modüle eden bileşikler için fenotipik tarama platformlarının standartlaştırılmasını destekler.
- Alt akıştaki yüksek içerikli tarama iş akışları için sağlam biyolojik sistemler hazırlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Gelişimsel EMT süreçlerini, metastaz ve doku yeniden şekillenmesinin hastalıkla ilgili modelleriyle ilişkilendirir.
- Preklinik çalışmalar için translasyonel biyobelirteç seçimine temel oluşturan mekanistik içgörüler sağlar.
- Canlı hücre fenotipik kanıtlarına dayanarak, EMT hedefli adayların riskten arındırılmış şekilde ilerletilmesine olanak tanır.
- EMT kaynaklı hastalık alanlarında, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği güçlendirir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu görüntüleme yöntemi, erken hipotez testlerinden EMT ile ilişkili hedefler için preklinik model geliştirmeye kadar olan keşif sürekliliğine entegre edilmektedir.
- Keşif Biyolojisi: EMT ve morfogenetik regülatörler için hipotez testlerini ve yolak aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Hücre şekli ve hareketine ilişkin kantitatif, tekrarlanabilir çıktılar sağlayarak analiz hazırlığına olanak tanır.
- Analizler: Genetik veya farmakolojik perturbasyonların karşılaştırmalı analizi için yüksek içerikli görüntüleme verileri sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumu için gelişimsel mekanizmaları hastalıkla ilgili EMT modellerine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli EMT ve morfogenez çalışmalarına uyarlanabilir, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: EMT hedefli keşif programları için öngörülebilirlik güvenini ve mekanistik risk azaltımını artırır.
- Operasyonel Değer: Projeler arası tekrarlanabilirlik için standartlaştırılmış, ölçeklenebilir görüntüleme iş akışları sunar.
- Stratejik Değer: Devam/dur kararlarına temel oluşturur ve EMT kaynaklı endikasyonlarda geç aşama biyolojik riskleri azaltır.
- Portföy Etkisi: Farklı terapötik alanlardaki EMT modüle eden varlıkların risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Canlı görüntüleme, konfokal mikroskopi ve Drosophila embriyolojisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Gelişmiş görüntüleme cihazlarına ve zaman ayarlı (time-lapse) analizler için analitik yazılımlara erişim gerektirir.
- Tekrarlanabilirlik için embriyo evreleme ve görüntüleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer model sistemlere adaptasyon, raporlayıcı konstrüktların ve görüntüleme koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında işlem hacmi sınırlamaları ve hassas embriyo taşıma gereksinimi yer almaktadır.
