Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Bu prosedürün genel amacı, Xenopus oositlerindeki iyon kanalları gibi yeni proteinleri eksprese etmektir. Bu yöntem, işlevsel bir ifade sistemi gerektiren herhangi bir alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin varyasyonlarının temel avantajları, oositlerin hızı, güvenilirliği ve daha iyi sağkalımıdır.

Bu yöntem, iyon kanallarının işleyişi hakkında bilgi sağlayabilir. Ek olarak, başka herhangi bir proteinin çalışmasına uygulanabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak klasik yöntemlerin düşük oranda oosit sağkalımı ile sonuçlandığını fark ettiğimizde aklımıza geldi.

Metin protokolüne göre dişi kurbağalardan yumurtalıkların loblarını çıkardıktan sonra, lobları penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş steril Modifiye Barth Solüsyonuna yerleştirin. Dokunun oksijene erişmesine izin vermek için lobları kesin. Beşinci ila altıncı aşama folikülü ayırmak için, yumurtalığı tutmak için forseps kullanın ve ardından foliküllerin üzerine bir platin halka indirin ve folikül ile bağ dokusunu yumurtalık dokusundan bozmak için halkayı yavaşça geri çekin.

Platin halkayı kullanarak sağlıklı görünen oositleri ayırın. Seçilen folikülleri 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarmak için ucu 1,5 milimetre çapında kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanın. GABA A reseptörü için cRNA'ları ve metin protokolüne göre mikro enjeksiyon pipetlerini hazırladıktan sonra, bir mikro enjeksiyon pipetini geri doldurmak için parafin yağı ve ince bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından pipeti ev yapımı bir mikro enjeksiyon aparatına monte edin. Steril plastik uçlu bir pipet kullanarak, neme dayanıklı bir termoplastik parçasının temiz tarafına bir damla mRNA çözeltisi yerleştirin. Ardından enjeksiyon pipetinin ucunu damlacığa daldırın ve pistonu geri çekmek için motoru açın.

mRNA çözeltisi pipete girmeli ve yağ ile görünür bir arayüz oluşturmalıdır. Ardından, pipetin ucunu damlacıktan geri çekin ve enjeksiyon pipetinin içine pozitif bir basınç uygulayın. Enjeksiyon pipetinin ucunda bir damla mRNA çözeltisi oluşmalıdır.

Dibe yapıştırılmış ve enjeksiyon için MBS ile kaplanmış naylon ağlı 60 milimetrelik bir Petri kabı kullanarak, folikülleri bitkisel direkleri yukarı bakacak şekilde hizalayın. Mikromanipülatör ile enjeksiyon pipetini tek bir folikül üzerine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini bitkisel direğin ortasına yerleştirin ve dakikada 0,6 mikrolitre akış hızında 50 nanolitre mRNA enjekte etmek için pipetin içine pozitif basınç uygulayın.

Haberci RNA kaçışını önlemek için enjeksiyon pipet ucunu folikülden çıkarmadan önce beş ila 10 saniye bekleyin. Enjekte edilen folikülleri iki mililitre MBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın. Çanağı 18 santigrat dereceye ayarlanmış bir şarap soğutucusuna yerleştirin.

Yeni eksprese edilen proteinin kimliğine bağlı olarak, enjekte edilen folikülleri kayıttan önce bir ila yedi gün boyunca inkübe edin. Folikülleri soymak için, enjekte edilen on folikülü 0.5 mililitre MBS, mililitre başına bir miligram kollajenaz ve mililitre tripsin inhibitörü başına 0.1 miligram içeren bir borosilikat cam tüpe aktarın. Tüpü 36 derecelik bir su banyosuna daldırın ve folikülleri 20 dakika inkübe edin.

Buradaki sıcaklık kritiktir çünkü bir derece daha fazlası oositleri öldürebilir. Folikülleri oda sıcaklığında bir mililitre MBS içeren ikinci bir tüpe aktararak durulayın ve yaklaşık on saniye boyunca tüpte bırakın. Daha sonra folikülleri, dört milimolar EGTA içeren 0.5 mililitre çift konsantre MBS içeren üçüncü bir tüpe aktarın ve numuneleri oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin, ara sıra tüpleri sallayın.

Dört dakikalık inkübasyon süresi, foliküler tabakaların oositten ayrılmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Folikülleri oda sıcaklığında bir mililitre MBS içeren başka bir tüpe aktararak durulayın ve yaklaşık 10 saniye tüpte bırakın. Oositleri iki mililitre MBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Daha sonra, bir stereo mikroskop altında, çıplak oositi basitçe iterek dış zarfları foliküllerden ayırmak için bir platin halka kullanın. Soyulmuş oositleri kullanana kadar saklayın. Bu deneyde, mekanik olarak seçilen Xenopus oositlerine, GABA A reseptör alt birimleri için mRNA kaplaması ile mikro enjeksiyon yapıldı.

Daha sonra foliküler hücre tabakaları çıkarıldı. Oositler negatif-80 milivoltta voltajla kenetlendi ve artan GABA konsantrasyonlarına ve GABA A reseptörünün güçlü bir pozitif allosterik modülatörü olan THDOC'un varlığına maruz bırakıldı. Bu panel, GABA konsantrasyonlarına bağlı olarak ortaya çıkan akım genliklerini gösterir ve bu alt birim kombinasyonunun GABA'ya duyarlılığını gösterir.

Kullanılan denklem I(c)Imax/n) idi, burada c GABA konsantrasyonudur, EC50, bir mikromolar THDOC varlığında GABA konsantrasyonudur ve yarı maksimum akım genliği ortaya çıkarır. Imax, maksimum akım genliğidir. I akım genliğidir ve n Hill katsayısıdır.

Alfa dört beta iki delta GABA A reseptörünün EC50'si 0.41 0.12 mikromolar ve n 0.76 0.04 idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, folikülal hücre katmanları uygun şekilde yapılırsa yarım saat içinde çıkarılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların Xenopus oositlerinde protein ekspresyon prosedürünü iyileştirmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, foliküler hücre katmanları ile çevrili Xenopus oositlerinin nasıl izole edileceğini, mRNA ile mikro enjeksiyonlarını ve ardından foliküler hücre tabakalarının nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.