Name: Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, Xenopus oositlerinde sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonu ve foliküler hücre katmanlarının çıkarılması yöntemleriyle iyon kanallarının fonksiyonel ekspresyonunu. Bu optimize teknik, oosit sağkalımını artırır ve elektrofizyolojik deneyler için hızlı çözüm değişiklikleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı hibesi 315230_156929/1 tarafından desteklenmiştir. M.C.M. bir burs sahibidir (CONICYT, Ministerio de Educacion, Şili'den Beca Chile Postdoctorado).

Hayvan deneyleri Bern Kantonu Kantonstierarzt yerel komite, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) tarafından onaylanmıştır. Kara kurbağası cinsi oositlerinde hazırlanması 1. <ol><li> Katı, 20 ° C &#39;de muhafaza edilir, su içinde 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde kurbağa (Xenopus laevis) tutun. </li><li> Dişi kurbağa 9&#39;dan yumurtalıkların lobları çıkarın. NOT: lobların kaldırma rejenerasyonu için bir uyarıcı olduğunu ve sık sık oosit kalitesi cerrahisi ile geliştirir. Oosit, bir Vitellin tabakası, folikül hücrelerinin hücre tabakası, ve kan damarları 21 ihtiva eden bağ dokusu ile kaplıdır. tüm yapı &quot;folikülü.&quot; denir </li><li> Yoğun penisilin ve streptomisin (88 mM NaCl, 1 mM KCI, 2.4 mM ile desteklenmiş steril Barth&#39;ın Tuzlu 7 (MBS) içinde oosit içeren folikül ile paketlenir yumurtalıkların lobları yerleştirinNaHCO 3, 0.82 mM MgSO 4, 0.41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit; HEPES (pH 7.5, NaOH), 100 ug / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Tek çıkış aşaması V-VI 21 folikülleri. forseps ile yumurtalık lob tutun. Köklerinin üzerinde platin döngü (Şekil 1) indirin ve yavaşça yumurtalık dokusundan folikülü içeren bağ dokusu bozmaya döngü çekin. NOT: Sahne V-VI 21 folikül kendi büyüklüğü ile karakterize edilir (1.0 - çapı 1,2 mm) ve koyu pigmente hayvan yarımkürede ve sarımsı bitkisel yarımkürede arasında iyi aksine. </li><li> Bir plastik Pasteur pipeti (1.5 mm&#39;lik bir açıklık çapına geri kesilmiş) vasıtasıyla 35 mm çaplı Petri kabı sadece sağlıklı görünümlü folikülleri (yani mükemmel küresel ve bozulmamış pigmentasyon ile) aktarın. </li></ol> Not: Burada açıklanan mikroenjeksiyon sistemi Kressmann ve Birnstiel 22 tarafından bildirilen türetilmiştir. <ol><li> In vitro transkripsiyon bir alıcı, bir poli (A +) kuyruğu ve RNA miktarının eklenmesi jel elektroforezi 23 tarafından α 4 β 2 δ GABA alt birimleri kodlayan ilgili cDNA&#39;lardan cRNAs hazırlayın. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanarak borosilikat cam kılcal damarlar (1.0 mm dış çapı (OD), 0.58 mm iç çapı (ID), 100 mm uzunluk) den mikroenjeksiyon pipetler hazırlayın. bir eğimli ucu ile 15 mikron - 12 bir ucu çapı oluşturmak için bir mikromanipülatör ve microfilament kullanarak bir mikroskop altında cam kılcal damarların ipuçları kesiyorum. </li><li> 10 ml şırınga kullanılarak parafin yağı ile mikroenjeksiyon pipetler dolgu, ve daha sonra bir homebuilt MICR üzerine mikroenjeksiyon pipet monteoinjection cihaz (Şekil 2). NOT: homebuilt yağ hidrolik enjeksiyon cihazı, bir ayak pedalı ile kontrol edilen bir ızgara motorundan oluşmaktadır. Ek bir anahtar motorun dönme modunu değiştirir. Bu motor, avans ya da 10 uL cam şırınga pistonu geri çekilir bir mikrometre vidası (0,5 mm / dönüş) çalıştırır. Enjeksiyon 3 rpm&#39;lik bir hızda ve bir 0.5 dönüş folikül bir 50 nL enjeksiyon karşılık gelir. şırınga ucu kendisine Tygon hortumunun çok kısa bir parça enjeksiyon iğnesine bağlanır kalın duvarlı politetrafluoroetilen boru bağlanmıştır. Enjeksiyon kılcal bir micromanipulator tarafından denetlenen bir mandrenle tarafından düzenlenmektedir. Tüm sistem parafin yağı ile doldurulur. Onlar enjeksiyon sistemine zarar verecek herhangi bir hava kabarcıkları, kaçınılmalıdır. Kur soğuk ışık kaynağı ile aydınlatılmış. Bir stereomikroskop optik kontrol için gereklidir. Foliküllerinin bir stereomicr soğuk ışık altında görüntülenmiştirOscope (40X büyütme). Enjeksiyon kurulum Performans Xenopus oosit içine radyoaktif izleyici enjeksiyonu ile test edilir. 45 A hacim - 55 nL enjeksiyon başına teslim edilmelidir. </li><li> steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak, neme karşı dirençli bir termoplastik (2 x 2 cm), temiz iç kısmına steril bir su damlasının yerleştirilmesi kurulumu test. Bu damlacık içine enjeksiyon pipet ucu batırın ve sonra pistonu (enjeksiyon pipet içinde negatif basınç) geri çekmek için motoru çevirin. NOT: Su pipet girmek ve yağ ile görünür bir arayüz oluşturmalıdır. </li><li> damlacık gelen pipet ucu geri çekin ve enjeksiyon pipet içine pozitif basınç uygulayın. Bir su damlacığı enjeksiyon pipetine ucunda oluşturmalıdır. </li><li> Bir Pe altına yapıştırılmış: bitkisel kutuplar naylon örgü boşlukları (0.8 mm G) yukarı bakacak şekilde onları sıraya folikül enjeksiyon için hazırlayınMBS ile kaplı üç çanak (60 mm). </li><li> Bir termoplastik temiz iç kısmına steril plastik uçlu bir pipet kullanılarak mRNA 2 ul koyun. enjeksiyon pipetine içine negatif basınç uygulayarak, enjeksiyon pipetine mRNA al. </li><li> Mikromanipülatör kullanarak bireysel folikül üzerinde enjeksiyon pipet yerleştirin. </li><li> Bitkisel kutup merkezine iğne takın ve pipet içine pozitif basınç uygulayarak 0.6 mL / dk&#39;lık bir akış oranında mRNA 50 nL enjekte edilir. mRNA kaçış önlemek için folikül enjeksiyon pipet çıkarmadan önce 10 sn - 5 bekleyin. NOT: mRNA hayvan yarımkürede yer alan çekirdeğin içine enjeksiyon önlemek için bitkisel (sarımsı) kutupta enjekte edilmelidir. </li><li> MBS 2 mL dolu yeni bir petri (35 mm) enjekte folikülleri aktarın. 18 ° C&#39;ye ayarlanmış bir şarap soğutucuya çanak yerleştirin. 1 enjekte folikülleri inkübe -7 gün Kayıttan önce, yeni Sentezlenen proteinin ne olduğu ile ilgili olarak. </li></ol> 3. Foliküllerinden soyma (Şekil 3) NOT: olarak bilinen, yukarıda belirtilen kan damarları 24 içeren bir vitelline tabakası, folikül hücreleri ve bağ dokusu ile kaplıdır oosit olarak &quot;folikül.&quot; hücre yüzeyine çözümleri erişim engellemeden, mekanik stabilite temin vitelline tabakası hariç tüm tabakalar elektrofizyolojik deneyler önce çıkarılmalıdır. Çevredeki hücre katmanları olmadan folikül önce bir &quot;soyulmuş&quot; oosit 25 olarak adlandırılmıştır. Bu adım genellikle elektrofizyolojik deneyler ile aynı gün yapılır. <ol><li> Aktarım on MBS 0.5 mL, 1 mg / ml kollajenaz, ve 0.1 mg / ml tripsin inhibitörü içeren bir borosilikat cam tüp köklerinin enjekte edilmiştir. 36 ° C &#39;de muhafaza edilen bir su banyosu içinde tüp bırakın. tasarlamak20 dakika folikülleri ve bazen tüpler sallayın. </li><li> RT&#39;de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın. </li><li> 4 mM etilen glikol-bis (2-aminoetileter) ihtiva eden iki kat konsantre edilmiş MBS 0.5 mL ihtiva eden bir üçüncü tüpe köklerinin transfer - N, N, N &#39;, N&#39;-tetraasetik asit (EGTA) ve 4 dk için inkübe RT. bazen tüp sallayın. Not: hipertonik çözeltisi (iki kat konsantre edildi MBS) ve böylece oositten foliküler hücre katmanları ayırma folikül hücresi tabakaları içinde oosit, bir çekme indüklemek için kullanılır; EGTA kolajenaz aktivitesini inhibe eklenir. </li><li> RT&#39;de MBS 1 mL içeren ikinci bir tüp onlara aktararak folikülleri durulayın. yaklaşık 10 saniye süreyle tüp onları bırakın. </li><li> MBS 2 mL içeren bir Petri kabı (35 mm çap) oosit aktarın. Bir stereomikroskop altında, tarafından köklerinin gelen dış zarfları ayrısadece platin döngü kullanarak Çıplak oosit iterek. NOT: oosit dış zarf kültür kabı sıkıca kalan ve kolayca oosit ayrılabilir. Bazı oosit kendiliğinden dış zarfları kaybedecek ve soyulmuş oosit olarak telafi edilecektir. Bu prosedür oosit küresel görünümünü korur nispeten istikrarlı bir hazırlık olur. </li></ol> Oosit etrafında 4. Hızlı Çözüm Değişikliği <ol><li> 9,26 tarif edildiği gibi, bir voltaj kelepçesi deneyi gerçekleştirmek. </li><li> deney gereği perfüzyon anahtarları çevirerek yerçekimi beslenen perfüzyon sisteminin çözümünü değiştirin. <ol><li> oositin etrafında agonist konsantrasyonunu hızlı değişiklikler izin vermek için, oosit yüzeyinden yaklaşık 0.4 mm yerleştirilir ağzı olan 1.35 mm&#39;lik bir iç çapa sahip bir cam kılcal yoluyla 6 mL / dakika perfüzyon çözeltisi uygulanır. NOT: değişim hızı önceden tahmini olmuşturaz 0,5 s 27 70% olarak, d. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu makalede açıklanan yöntemler geleneksel 7-9 kullanılan sapma. 1 ila 2 saat kollajenaz muamelesi 8 yumurtalık lobları maruz standarttır; hasarsız, soyulmuş oosit izole; ve mRNA ticari enjeksiyon cihazlarını kullanarak bunları enjekte edin. Oositler, kollajenaz yüksek konsantrasyonda uzun maruz bırakılma ile zarar olması muhtemeldir 1): Klasik bir prosedür, aşağıdaki dezavantajları vardır. 2) kararsız soyulmuş oosit deney kadar saklanmalıdır. 3) Köreltilmiş oosit köklerinin daha mikroenjeksiyon sı...

Xenopus oositleri yaygın (- 3, ve oradaki referanslar Kaynaklar 2) bir ekspresyon sistemi olarak kullanılmaktadır. Onlar düzgün montaj ve plazma zarlarının içine fonksiyonel olarak aktif birden fazla alt proteinleri dahil edebiliyoruz. Bu sistemi kullanarak, fonksiyonel olarak, tek başına ya da başka proteinlerle birlikte zar proteinleri araştırılması mutasyon, kimerik ya da birleştirilmiş proteinlerin özelliklerini incelemek için, ve potansiyel ilaçların incelenmesi için mümkündür. başka heterolog sentezleme sistemleri üzerinden oosit kullanmanın avantajları dev hücre kolay kullanım, yabancı genetik bilgi Banyo perfüzyonu ile oositin bir ortamda kolayca kontrol eksprese eden hücrelerin yüksek oranda ve membran potansiyelinin kontrolü, . Bu ifade sisteminin dezavantajı birçok laboratuvarda 17-20 gözlenen mevsimsel çeşididir. Bu varyasyon nedeninet olmaktan çok uzaktır. Buna ek olarak, oosit kalitesi genellikle güçlü bir değişiklik gözlenmiştir. Geleneksel yöntemler 7-9 yumurtalık loblar izolasyonunu, bazı saat kollajenaz için yumurtalık lobların pozlama, soyulmuş oosit seçimi ve oosit mikroenjeksiyon dahil ettik. Burada, alternatif, hızlı prosedürlerin bir dizi bize oosit kalitesinde mevsimsel değişimi ve küçük farklılıklar ile 30 yılı aşkın için bu ifade sistemi ile çalışmak için izin olduğunu bildirildi. Oosit izolasyonu, mikro enjeksiyon cRNA ile ve foliküler hücre tabakası çıkarılması için anlatılan tadil edilmiş ve geliştirilmiş yöntemler, Xenopus oosit içinde tercih edilen bir proteinin ekspresyonu için kullanılabilir. oositin etrafında orta hızlı çözeltisi değişiklikleri için çok basit bir yöntem, herhangi bir ligand-kapılı iyon kanalı ve taşıyıcıların çalışmaya uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO<alt>3</alt>)<alt>2</alt>&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 & mu; g penisilin / mL ve 100 &mu; g streptomisin / mL</td></tr><tr><td>Platin tel döngü</td><td>ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga ve nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Tip 701N</td></tr><tr><td>Kalın duvarlı politetrafloroetilen boru</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafin yağı</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Naylon ağ, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; daha zengin Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat cam tüp&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Kollajenaz NB Standart Sınıf</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin inhibitörü tip I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal</td><td>Jencons (Bilimsel) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (perfüzyon için), alternatif şirket: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&nbsp; 0.58 ID x 100 Uzunluk mm (mikroenjeksiyon için)&nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damar ve nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Uzunluk mm (iki elektrotlu voltaj kelepçesi için)</td></tr> <tr><td>& gama; -Aminobütirik asit (GABA)</td> <td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3 & alfa ;, 21-Dihidroksi-5 & alfa; -pregnan-20-on (THDOC)</td> <td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>ızgara motoru</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>DC mikromotor Tip 2230, dişli Tip 22/2</td></tr><tr><td>mikrometre vidalı</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Steril plastik transfer pipetleri</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20'LI YILLAR</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oositler: mikroenjeksiyon için optimize yöntemler, foliküler hücre katmanlar çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı Çözüm değişiklikler

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Proteinler için bir heterolog sentezleme sistemi olarak Xenopus oosit birinci Gurdon ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. 1 ve yaygın olarak keşfinden beri kullanılan (Referanslar 2-3, ve oradaki referanslar). Yabancı kanal ifadesi için oosit çekici kılan bir özellik endojen iyon kanalları 4 kötü bolluğu. Bu ifade sistemi ligand-kapılı iyon kanalı, aralarında çok sayıda proteinlerin karakterizasyonu için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. GABA A Kara kurbağası cinsi oositlerinde reseptörleri ve bunların fonksiyonel karakterizasyonu sentezleme oosit, cRNA, foliküler hücre tabakası çıkarılması ve elektrofizyolojik deneyler hızlı çözüm değişikliklerle microinjections izolasyonu da dahil olmak üzere, burada anlatılmıştır. Işlemler bu laboratuarda 5,6 optimize edilmiş ve rutin 7-9 kullanılan olanlardan sapma bulundu. Geleneksel olarak, soyulmuş oositler hazırlanırRT&#39;de yumurtalık loblar uzun bir kollajenaz muamelesi ve bu soyulmuş oosit ile mRNA ile microinjected edilir. Optimize edilmiş yöntemler kullanılarak, çeşitli membran proteinleri olarak ifade edilmiştir ve rekombinant GABA A reseptörleri 10-12, insan rekombinant klorür kanalları 13, tripanosom potasyum kanallarının 14 ve miyo -inositol taşıyıcı 15, 16 olduğu gibi, bu sistem ile incelenmiştir. Burada ayrıntılı yöntemler, Xenopus oositlerde seçim herhangi bir proteinin ekspresyonu tatbik edilebilir, ve hızlı bir çözüm değişikliğin diğer ligand-kapılı iyon kanallarının incelemek için kullanılabilir.

Xenopus oositleri mekanik bir platin döngü (Şekil 1) kullanılarak ayrılmıştı. 0.5: oosit mRNA 2, δ, 0.5 p, A reseptör alt birimleri 4 a GABA kodlayan microinjected, 2.5 fmol / oosit (Şekil 2). 4 Gün sonra, foliküler hücre tabakaları (Şekil 3) uzaklaştırılmıştır. Oositler voltaj -80 mV&#39;de kenetlendi ve 1 uM 3a, 21-dihidroksi-5α-pregnan-20-on (THDOC), güçlü bir pozitif allosterik modülatör mevc...

Tek foliküllerin izolasyonu, sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonları, çevre hücre tabakalarının çıkarılması ve Xenopus oositlerinde protein ekspresyonu için optimize edilmiş prosedürler anlatılmaktadır. Ek olarak, ligand kapılı iyon kanalları ile yapılan elektrofizyolojik deneylerde hızlı çözelti değişiklikleri için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Bu prosedürün genel amacı, Xenopus oositlerindeki iyon kanalları gibi yeni proteinleri eksprese etmektir. Bu yöntem, işlevsel bir ifade sistemi gerektiren herhangi bir alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin varyasyonlarının temel avantajları, oositlerin hızı, güvenilirliği ve daha iyi sağkalımıdır.Bu yöntem, iyon kanallarının işleyişi hakkında bilgi sağlayabilir. Ek olarak, başka herhangi bir proteinin çalışmasına uygulanabilir. Bu yöntem fikri ilk olarak klasik yöntemlerin düşük oranda oosit sağkalımı ile sonuçlandığını fark ettiğimizde aklımıza geldi.Metin protokolüne göre dişi kurbağalardan yumurtalıkların loblarını çıkardıktan sonra, lobları penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş steril Modifiye Barth Solüsyonuna yerleştirin. Dokunun oksijene erişmesine izin vermek için lobları kesin. Beşinci ila altıncı aşama folikülü ayırmak için, yumurtalığı tutmak için forseps kullanın ve ardından foliküllerin üzerine bir platin halka indirin ve folikül ile bağ dokusunu yumurtalık dokusundan bozmak için halkayı yavaşça geri çekin.Platin halkayı kullanarak sağlıklı görünen oositleri ayırın. Seçilen folikülleri 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarmak için ucu 1,5 milimetre çapında kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanın. GABA A reseptörü için cRNA'ları ve metin protokolüne göre mikro enjeksiyon pipetlerini hazırladıktan sonra, bir mikro enjeksiyon pipetini geri doldurmak için parafin yağı ve ince bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.Ardından pipeti ev yapımı bir mikro enjeksiyon aparatına monte edin. Steril plastik uçlu bir pipet kullanarak, neme dayanıklı bir termoplastik parçasının temiz tarafına bir damla mRNA çözeltisi yerleştirin. Ardından enjeksiyon pipetinin ucunu damlacığa daldırın ve pistonu geri çekmek için motoru açın.mRNA çözeltisi pipete girmeli ve yağ ile görünür bir arayüz oluşturmalıdır. Ardından, pipetin ucunu damlacıktan geri çekin ve enjeksiyon pipetinin içine pozitif bir basınç uygulayın. Enjeksiyon pipetinin ucunda bir damla mRNA çözeltisi oluşmalıdır.Dibe yapıştırılmış ve enjeksiyon için MBS ile kaplanmış naylon ağlı 60 milimetrelik bir Petri kabı kullanarak, folikülleri bitkisel direkleri yukarı bakacak şekilde hizalayın. Mikromanipülatör ile enjeksiyon pipetini tek bir folikül üzerine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini bitkisel direğin ortasına yerleştirin ve dakikada 0,6 mikrolitre akış hızında 50 nanolitre mRNA enjekte etmek için pipetin içine pozitif basınç uygulayın.Haberci RNA kaçışını önlemek için enjeksiyon pipet ucunu folikülden çıkarmadan önce beş ila 10 saniye bekleyin. Enjekte edilen folikülleri iki mililitre MBS ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın. Çanağı 18 santigrat dereceye ayarlanmış bir şarap soğutucusuna yerleştirin.Yeni eksprese edilen proteinin kimliğine bağlı olarak, enjekte edilen folikülleri kayıttan önce bir ila yedi gün boyunca inkübe edin. Folikülleri soymak için, enjekte edilen on folikülü 0.5 mililitre MBS, mililitre başına bir miligram kollajenaz ve mililitre tripsin inhibitörü başına 0.1 miligram içeren bir borosilikat cam tüpe aktarın. Tüpü 36 derecelik bir su banyosuna daldırın ve folikülleri 20 dakika inkübe edin.Buradaki sıcaklık kritiktir çünkü bir derece daha fazlası oositleri öldürebilir. Folikülleri oda sıcaklığında bir mililitre MBS içeren ikinci bir tüpe aktararak durulayın ve yaklaşık on saniye boyunca tüpte bırakın. Daha sonra folikülleri, dört milimolar EGTA içeren 0.5 mililitre çift konsantre MBS içeren üçüncü bir tüpe aktarın ve numuneleri oda sıcaklığında dört dakika inkübe edin, ara sıra tüpleri sallayın.Dört dakikalık inkübasyon süresi, foliküler tabakaların oositten ayrılmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Folikülleri oda sıcaklığında bir mililitre MBS içeren başka bir tüpe aktararak durulayın ve yaklaşık 10 saniye tüpte bırakın. Oositleri iki mililitre MBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.Daha sonra, bir stereo mikroskop altında, çıplak oositi basitçe iterek dış zarfları foliküllerden ayırmak için bir platin halka kullanın. Soyulmuş oositleri kullanana kadar saklayın. Bu deneyde, mekanik olarak seçilen Xenopus oositlerine, GABA A reseptör alt birimleri için mRNA kaplaması ile mikro enjeksiyon yapıldı.Daha sonra foliküler hücre tabakaları çıkarıldı. Oositler negatif-80 milivoltta voltajla kenetlendi ve artan GABA konsantrasyonlarına ve GABA A reseptörünün güçlü bir pozitif allosterik modülatörü olan THDOC'un varlığına maruz bırakıldı. Bu panel, GABA konsantrasyonlarına bağlı olarak ortaya çıkan akım genliklerini gösterir ve bu alt birim kombinasyonunun GABA'ya duyarlılığını gösterir.Kullanılan denklem I(c)Imax/n) idi, burada c GABA konsantrasyonudur, EC50, bir mikromolar THDOC varlığında GABA konsantrasyonudur ve yarı maksimum akım genliği ortaya çıkarır. Imax, maksimum akım genliğidir. I akım genliğidir ve n Hill katsayısıdır.Alfa dört beta iki delta GABA A reseptörünün EC50'si 0.41 0.12 mikromolar ve n 0.76 0.04 idi. Bir kez ustalaştıktan sonra, folikülal hücre katmanları uygun şekilde yapılırsa yarım saat içinde çıkarılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların Xenopus oositlerinde protein ekspresyon prosedürünü iyileştirmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, foliküler hücre katmanları ile çevrili Xenopus oositlerinin nasıl izole edileceğini, mRNA ile mikro enjeksiyonlarını ve ardından foliküler hücre tabakalarının nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon...

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

Gübrelenmesi Xenopus oositleri Host Transfer Yöntemi kullanılarak

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Xenopus laevis immatür oositlerini manipüle etme, oositlerin yumurtalara in vitro olgunlaşması ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokol, bazı maternal proteinlerin bozulmasına ve döllenmede ilgilenilen genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir ve bu nedenle erken embriyonik gelişimde spesifik faktörlerin rollerini incelemek için değerlidir.

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

El yazması burada Xenopus floresan levhası 'ligandların salgılanmasını ve difüzyon analiz yöntemleri basit bir kümesi sağlar. Bu ligand dağılımını değiştirmek için başka proteinlerin yeteneğini test ve morfojen degradeler düzenleyen mekanizmalar içgörü verebilir deneyleri izin verdiği için bir ortam sağlar.

Konfokal Analizi Kullanımı<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt ve Shh morfogen Gradyanların modülyatorlar Soruşturma

Yetkin ektodermde bir yanıtı indükleyebilen genlerin ekspresyon klonlaması için bir Xenopus oosit ve hayvan başlığı sistemini tanımlıyoruz ve bu tür genlerin sonraki analizi için teknikleri tartışıyoruz. Bu sistem, çok çeşitli gen ürünlerinin fonksiyonel olarak tanımlanmasında faydalıdır.

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Öğrenin, Xenopus oositlerinde sitoplazmik RNA mikroenjeksiyonu ve foliküler hücre katmanlarının çıkarılması yöntemleriyle iyon kanallarının fonksiyonel ekspresyonunu. Bu optimize teknik, oosit sağkalımını artırır ve elektrofizyolojik deneyler için hızlı çözüm değişiklikleri sağlar.

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler (Video) | JoVE Journal

Xenopus Oositler: Mikroenjeksiyon için optimize Yöntemler, Foliküler Hücre Katmanlar çıkarılması ve Elektrofizyolojik Deneyler Hızlı Çözüm değişiklikler

Daha fazla video keşfet