LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, LC-MS/MS Analizi kullanarak bir Nükleer Kofaktör ile etkileşime giren proteinleri tanımlamaktır. Bu yöntem, gen düzenleme alanındaki transkripsiyonel mekanizmalarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir nükleer kofaktör ile etkileşime giren proteinleri tanımlayabilmemizdir.

Ayrıca, bu yöntem, hedeflenen nükleer faktörlerin transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalarını daha iyi anlamamızı sağlar. Transveksiyondan 36 saat sonra, hücre tabakasını buz gibi soğuk PBS ile yıkayarak ve hücreleri bir hücre sıyırıcı ile toplayarak, bayrak etiketli ARIP4'ü ifade eden HEK 293 hücrelerini hasat edin. Hücreleri 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra dört santigrat derecede iki dakika boyunca 8000 g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini Yüksek Tuz Tamponunun pelet hacminin beş katı kadar yeniden süspanse edin. Karışımı dört santigrat derecede 20 dakika döndürün. 20 dakikalık dönüşten sonra, tüpü 17.700 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanları iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve süpernatan hacminin üç katına kadar Seyreltme tamponu ekleyin. Başka bir setrifugasyon gerçekleştirin ve ardından süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. 10 dakikalık santrifüjleme sırasında 50 mikrolitre bayrak önleyici boncukları PBS ile yıkayın.

Daha sonra tüpü 2000 g'da dört santigrat derecede bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve önce 1 molar glisin hidroklorür ve ardından bir molar tris hidroklorür ile yıkama adımlarını tekrarlayın. Ardından Düşük tuz tamponu ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, 50 mikrolitre yıkanmış boncukları tam hücre özleri ile karıştırın. Karışımı iki ila dört santigrat derecede dört saat boyunca yavaşça döndürün. Ardından, numuneyi bir mikro döndürme kolonuna aktarmak için körelmiş bir uç kullanın ve çözeltinin 1,5 mililitrelik bir tüpe damlamasına izin verin.

Akışı sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ardından, bayrak boncuklarını Düşük tuz tamponu ile beş kez yıkayın. Çıkarmak için, sütunu 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve boncukları kurutmak için bir dakika boyunca 2000 g'da santrifüjleyin.

Kolonun altını kapatın ve ardından 50 mikrolitre 1 molar glisin hidroklorür ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe çalkalayın. 10 dakika sonra, sütunu 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin ve bir dakika boyunca 2000 g'da santrifüjleyin.

Ayrıştırılan çözeltiyi 10 mikrolitre bir molar tris hidroklorür ile nötralize edin ve pipetleme ve girdaplama ile iyice karıştırın. 50 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin. 10 mikrolitre asetonitril, iki mikrolitre ditiyotreitol ve 50 mikrolitre nötralize numune.

56 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneyi 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra numuneye 10 mikrolitre 333 milimolar iyodoasetamid ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin, karışıma 10 mikrolitre tripsin ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, nihai ürünü analiz için bir LC-MS/MS tesisine veya üçüncü taraf bir kütle spektrometresi laboratuvarına taşıyın. Bu görüntü, bayrağa özgü bir antikor ile immün çökeltme ve elektroforez ile ayrılma sonrasında HEK 293 hücrelerinde eksprese edilen ARIP4 etiketli bayrak epitopunun gümüş boyamasını göstermektedir. Bir kontrol olarak, eksojen proteinleri eksprese etmeyen HEK 293 hücreleri üzerinde sahte bir saflaştırma gerçekleştirildi.

Yöntemimizi kullanarak, varsayılan nükleer kofaktörleri transkripsiyonel ilgi faktörleri aracılığıyla tanımlamak ve transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı daha da geliştirmek mümkündür.