Name: LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Öğrenin LC-MS/MS analizi ile nükleer kofaktörlerle etkileşimdeki proteinleri yüksek verimli belirleme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamak için protein-protein etkileşimlerini ortaya çıkarır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı (HT), Takeda Bilim Vakfı (HT) ve Japonya Bilimi Teşvik Derneği (B) to Genç Bilim İnsanları için Yardım Hibeleri tarafından desteklenmiştir.

1. Transfeksiyon <ol><li> 100 mM kültür plakaları (2 x 10 6 hücre / çanak) içinde HEK293 hücrelerinin tohumu. Kültür,% 10 fetal dana serumu, 100 ug / ml streptomisin ve 100 birim / ml penisilin takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı içinde hücre. % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin. </li><li> Sonraki gün, FLAG-etiketli ARIP4 plazmid 10 ug üreticinin talimatlarına 11&#39;e göre transfeksiyon reaktifi 40 ul kullanarak hücreleri transfekte. </li></ol> 2. Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Yaklaşık olarak transfeksiyondan 36 saat, buz gibi soğuk PBS ile hücrelerin yıkayın ve bir kazıyıcı kullanarak hücreleri hasat edilir. 1.5 mltube içine hücreleri aktarın ve 4 ° C &#39;de 2 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj o. Aspire süpernatan ve 5x hücre pelletini 0.4 M KCI tamponu pelet hacmi (yüksek tuz tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.4 M KCI, 5 mM MgCl2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-mercaptethanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca karışımın döndürün. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 17,700 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. </li><li> (Yeni bir 2 ml&#39;lik tüp süpernatantı (bütün hücre ekstresi) aktarın ve 0 M KCI tampon başlangıç hacminin 3x ilave seyreltme tamponu: 20 mM Tris-HCI (pH 8.0), 5 mM MgCl2,% 10 gliserol, % 0.1 NP-40, 10 mM β-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). </li><li> Başka bir santrifüj (4 ° C &#39;de 10 dakika süre ile 17,700 x g) gerçekleştirmek ve yeni bir 2 ml tüp supernatant (bütün hücre ekstresi) aktarın. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> 20 mM Tris: santrifüj (2.4) boyunca (0.1 M KCI tamponu ile iki kez düşük tuzlu tampon yıkama, ardından PBS ile anti-FLAG, boncuk tanelerin 50 ul, 0.1 M glisin-hidroklorür, ve daha sonra 1 M Tris-hidroklorür, yıkama HCI (pH 8.0), 0.1 m KCI, 5 mM MgCI2,% 10 gliserol,% 0.1 NP-40, 10 mM B-merkaptoetanol, 1 x proteaz inhibitör kokteyli). Bu yıkama işlemi için santrifüj 4 ° C de 1 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de gerçekleştirilir. </li><li> bütün hücre ekstresi ile FLAG, boncuk tanelerin 50 ul karıştırın ve yavaşça 2-4 ° C (adım 2.4 bütün hücre ekstresi% 1, ayrıca ileride kullanmak üzere, -80 ° C&#39;de saklanmalıdır 4 st için karışımın döndürme ) bir girdi olarak. </li><li> Bir mikro spin kolon (yerçekimi bırak) örnek aktarın. (Giriş ve akış-through Western Blot analizi kullanılarak hem protein düzeylerini kontrol), 1.5 ml tüp içinde akış yoluyla tutmak sıvı azot kullanarak dondurma ve -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> FLAG boncuk (yerçekimi damla) ilave edilmiştir 0.1 M KCI tamponu (düşük tuz tamponu) 1 ml ilave edilir. </li><li> 3.4 En az dört kez daha (beş yıkar toplam) adımı tekrarlayın. </li></ol> 4. Elüsyon <ol><li> 1.5 ml tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de olarak santrifüje tabi tutulur; boncuk kurur. </li><li> alt Capsütun. </li><li> 0.1 M glisin-HCl (pH 2.5) (bayrak boncukların hacmine eşit), 50 ul ekle. </li><li> Yavaşça oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karışımın çalkalayın. </li><li> yeni bir 1.5 ml&#39;lik tüp içine sütunu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de da santrifüj. </li><li> elüt Çözelti, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 10 ul ile nötralize edilir; pipetleme veya vorteks makinesi ile iyice karıştırın. </li></ol> 5. alkilasyonu ve tripsinleme <ol><li> 100 mM NH4 HCO3-, CH3CN 10 ul, ve karışım ditiotreitol 2 ul (112 ul toplam hacim) 50 ul ekle. </li><li> 56 ° C&#39;de 30 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek yerleştirin. </li><li> iyodoasetamid örnek 333 mM, 10 ul ilave edin ve 37 ° C&#39;de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Karışıma tripsin 10 ul (33 ng / | il) ilave edilir ve 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe. </li></ol><ol><li> Gecede Tripsinizasyonu takiben LC-MS / MS tesisine veya analiz 12 için üçüncü taraf kütle spektrometresi laboratuarına son ürünü taşımak. </li></ol>

<ol><li>De Las Rivas, J., Fontanillo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+essentials%3A+key+concepts+to+building+and+analyzing+interactome+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.Biol%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks.</a> PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).</li>
<li>Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interactions+involved+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interactions involved in cellular signaling.</a> Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).</li>
<li>MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+PLIN+proteins%2C+ATGL+and+CGI-58%2C+interactions+at+rest+and+following+stimulated+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction.</a> Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).</li>
<li>Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactive-state+preassembly+of+G%28q%29-coupled+receptors+and+G%28q%29+heterotrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Chem.Biol%22%5BJournal%5D)">Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers.</a> Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+with+chromatin+modifiers+that+occupies+E2F-+and+Myc-responsive+genes+in+G0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells.</a> Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+histone+modifications+mediated+by+a+CtBP+co-repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex.</a> Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).</li>
<li>Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+human+papillomavirus+type+16+E7+oncoprotein+with+the+600-kDa+retinoblastoma+protein-associated+factor%2C+p600%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).</li>
<li>Huang, B. X., Kim, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+identification+of+Akt+interacting+proteins+by+two-step+chemical+crosslinking%2C+co-immunoprecipitation+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry.</a> PLoS One. 8 (4), 61430(2013).</li>
<li>ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+immuno-precipitation+proteomics+-+the+user%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide.</a> Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).</li>
<li>Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Suppression+by+Transient+Recruitment+of+ARIP4+to+Sumoylated+nuclear+receptor+Ad4BP%2FSF-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1.</a> Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagic+receptor+p62+regulates+the+abundance+of+transcriptional+coregulator+ARIP4+during+nutrient+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Rep%22%5BJournal%5D)">Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation.</a> Sci.Rep. 5, 14498(2015).</li>
<li>Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+an+intracellular+lectin%2C+calnexin%2C+from+Aspergillus+oryzae+using+N-glycan-conjugated+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.Biotechnol.Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads.</a> Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).</li>
<li>Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyrk1A+potentiates+steroid+hormone-induced+transcription+via+the+chromatin+remodeling+factor+Arip4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4.</a> Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).</li>
<li>Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+immunoprecipitation+mass+spectrometry+of+endogenous+proteins+%28RIME%29+for+analysis+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes.</a> Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).</li>
<li>Fonslow, B. R., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+applied+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Sep.Sci%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis.</a> J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Verimli transfeksiyon bu protokol ile başarılı bir sonuç elde etmek esastır. Buna göre, imüno-FLAG etiketli proteini seviyelerini belirlemek için, Batı benek analizi kullanılarak önerilir. Bu adım, IP başarıyla gerçekleştirildi olduğunu, kendi ilgi protein düzgün dahası, aşırı ve doğrulamak için olanak sağlar. FLAG-etiketli protein seviyeleri, aynı zamanda kütle spektrometresi analizi önce kontrol edilmelidir. Bir sahte örnek, yanlış pozitif sonuç elde bilmek ve gerçek etkileşimlerden arka a...

Protein-protein etkileşimi, birçok biyolojik fonksiyonları çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, bu etkileşimler sinyal transdüksiyonunda rol oynamaktadır; hücre zarlarından protein taşıma; Hücre metabolizması; ve DNA replikasyonu, DNA hasarı tamiri, rekombinasyon ve transkripsiyon da 1, 2, 3, 4 de dahil olmak üzere çok sayıda nükleer işlemler. Bu etkileşimlerin yer alan proteinleri belirlenmesi bu hücresel süreçlerin anlayışımızı ilerleyen nedenle önemlidir. Imüno-(IP) protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan bir geçerli bir tekniktir. Ko-immünopresipitasyon proteinlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için, kütle spektrometresi, genellikle kullanılır 5, 6, 7, 8,9. bir antikor ile bir protein kompleksinin bir bilinen elemanının hedefleyerek, protein kompleksi izole etmek ve daha sonra kütle spektrometresi analizi ile de bilinmeyen bileşenleri tanımlamak mümkündür. ARIP4 (androjen reseptörü-etkileşimli protein 4), bir transkripsiyon coregulator açmak ya da bağlam-bağımlı bir şekilde 9, 10 hedef promoterleri bastırmak amacıyla nükleer reseptör proteinleri ile etkileşime girer. daha iyi bu nükleer faktörler düzenleyen transkripsiyon düzenleyici mekanizmaları anlamak için, biz arındırmak ve LC-MS / MS sistemi kullanılarak ARIP4 etkileşen proteinleri tespit için kapsamlı bir yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli (EDTA içermez) (100x)</td><td>nacalai tesque</td><td>03969-21</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Afinite Jeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin Sütunları</td><td>BIO-RAD</td><td>732-6204</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms / ms analizi nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein hazırlama yöntemi

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transkripsiyonel koregülatörler, nükleer kromatin yapısının verimli transkripsiyonel regülasyonu için hayati öneme sahiptir. Yardımcı düzenleyiciler, transkripsiyonun düzenlenmesinde çeşitli roller oynar. Bunlar, transkripsiyon faktörleri ile doğrudan etkileşimi, histonların ve diğer proteinlerin kovalent modifikasyonunu ve ara sıra kromatin konformasyon değişikliğini içerir. Buna göre, bu ağ içinde etkileşime giren proteinleri tanımlamak için nispeten hızlı yöntemler oluşturmak, altta yatan düzenleyici mekanizmaları anlamamızı geliştirmek için çok önemlidir. LC-MS/MS aracılı protein bağlayıcı partner tanımlaması, protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için kullanılan doğrulanmış bir tekniktir. Bir protein kompleksinin önceden tanımlanmış bir üyesini bir antikorla (bazen etiketli bir protein için bir antikorla) immünopresipite ederek, kütle spektrometresi analizi yoluyla bilinmeyen protein etkileşimlerini tanımlamak mümkündür. Burada, nükleer kofaktörleri ve bunların bağlanma ortaklarını içeren protein etkileşimlerinin LC-MS/MS aracılı yüksek verimli tanımlanması için bir protein hazırlama yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem, hedeflenen nükleer faktörlerin transkripsiyonel düzenleyici mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Güçlü bir ARIP4 sinyali 160 kDa, hem de sahte bir numune kontrol ve çeşitli diğer bilinmeyen proteinleri gibi (Şekil 1) tanımlanmıştır. LC-MS / MS analizi ARIP4 kompleks peptidleri ve FLAG boncuklar (Tablo 1) fraksiyonu içinde potansiyel peptid kofaktörleri iki tespit edilmiştir. P62 (Sequestosome1), bilinen bir ARIP4 kofaktör 11, bu sistemin 11 etkinliğini teyit analizi (Tablo 1) olarak te...

Biz, LC-MS / MS sistemi kullanılarak coregulatory etkileşimi proteinlerinin saflaştırılması için bir yöntem oluşturmuştur.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

Bu prosedürün genel amacı, LC-MS/MS Analizi kullanarak bir Nükleer Kofaktör ile etkileşime giren proteinleri tanımlamaktır. Bu yöntem, gen regülasyonu alanındaki transkripsiyonel mekanizmalarla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir nükleer kofaktör ile etkileşime giren proteinleri tanımlayabilmemizdir.Dahası, bu yöntem hedef alınan nükleer faktörlerin transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını daha iyi anlamamıza olanak tanır. Flag etiketli ARIP4 eksprese eden HEK 293 hücrelerini, transfeksiyondan 36 saat sonra hücre tabakasını buz gibi PBS ile yıkayarak ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayarak hasat edin. Hücreleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ardından dört santigrat derecede iki dakika boyunca 8000g hızda santrifüjleyin.Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini, pelet hacminin beş katı kadar Yüksek Tuz Tamponu içinde yeniden süspande edin. Karışımı dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca döndürün. 20 dakikalık döndürme işleminin ardından, tüpü dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca 17.700g'de santrifüjleyin.Ardından, süpernatantları yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın ve süpernatant hacminin üç katı kadar Seyreltme tamponu ekleyin. Bir santrifüj işlemi daha gerçekleştirin ve ardından süpernatantı yeni bir iki mililitrelik tüpe aktarın. 10 dakikalık santrifüj işlemi sırasında 50 mikrolitre anti-flag boncuklarını PBS ile yıkayın.Ardından tüpü 4 °C'de, 2000g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve yıkama adımlarını önce 1 molar glisin hidroklorür ile, ardından 1 molar tris hidroklorür ile tekrarlayın. Sonrasında Low salt buffer ile iki kez yıkayın.Ardından, yıkanmış boncukların 50 µL'sini tüm hücre ekstraktları ile karıştırın. Karışımı, 2 ila 4 °C'de dört saat boyunca nazikçe döndürün. Daha sonra, örneği bir mikro spin kolona aktarmak için küt uçlu bir pipet ucu kullanın ve çözeltinin 1,5 mL'lik bir tüpe damlayarak geçmesini sağlayın.Akış ürününü sıvı azot ile hızlıca dondurun ve -80 °C'de saklayın. Ardından, flag boncuklarını beş kez düşük tuzlu tampon ile yıkayın. Elüsyon için kolonu 1,5 ml'lik bir tüpe yerleştirin ve boncukları kurutmak için 2000g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.Kolonun altını kapatın ve ardından 50 µL 1 M glisin hidroklorür ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nazikçe çalkalayın. 10 dakika sonra kolonu yeni bir 1,5 mL tüpe yerleştirin ve 2000g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin.Elüye edilen çözeltiyi 10 µL 1 M tris hidroklorür ile nötralize edin ve pipetleme ve vorteksleme yaparak iyice karıştırın. 50 µL 100 mM amonyum bikarbonat ekleyin. 10 µL asetonitril, 2 µL ditiyotreitol ve 50 µL nötralize edilmiş numune ekleyin.56 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası örneği 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Ardından örneğe 10 µL 333 mM iyodoasetamid ekleyin ve 37 °C'de, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Karışıma 10 µL tripsin ekleyin ve 37 °C'de gece boyu inkübe edin.Ertesi gün, nihai ürünü analiz için bir LC-MS/MS tesisine veya üçüncü taraf bir kütle spektrometrisi laboratuvarına nakledin. Bu görüntü, flag spesifik bir antikor ile immün çöktürme ve elektroforez ile ayırma sonrası HEK 293 hücrelerinde eksprese edilen flag epitop etiketli ARIP4'ün gümüş boyamasını göstermektedir. Kontrol olarak, ekzojen protein eksprese etmeyen HEK 293 hücreleri üzerinde yalancı (mock) bir saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir.Yöntemimizi kullanarak, ilgilenilen transkripsiyon faktörü aracılığıyla varsayımsal nükleer kofaktörlerin belirlenmesi ve transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarına dair anlayışımızın daha da geliştirilmesi mümkündür.

a-protein-preparation-method-for-high-throughput-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Bu video, protein-protein etkileşim analizi için bir PVDF membranı üzerinde birlikte immünopresipite protein komplekslerini göstermektedir. Komplekslerden indirgenmiş proteinler, daha küçük peptitlerde tek tek proteinleri parçalamak için tripsin ile muamele edildi, daha sonra kalan peptitler PVDF zarından ekstrakte edildi. Kompleksteki her iki proteinden türetilen çekilen peptit daha sonra kurutuldu ve daha fazla analiz için düşük bir formik asit konsantrasyonunda yeniden süspanse edildi.

Etkileşim çalışmaları için birlikte immünopresipite edilmiş proteinleri hazırlamak için zar üzerinde protein sindirimi

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Protein-protein etkileşimleri bir hücrenin hem çekirdeğinde hem de sitoplazmasında meydana gelebilir. Bu etkileşimleri araştırmak için geleneksel ko-immünopresipitasyon ve modern yakınlık ligasyon testi uygulanır. Bu çalışmada, NF90-RBM3 etkileşimlerinin çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımını görselleştirmek için bu iki yöntemi karşılaştırıyoruz.

Co-immunoprecipitation tarafından Nükleer ve Sitoplazmik Kesirler Protein-protein Etkileşim görselleştirme ve<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Doğrudan LNCRNA-protein etkileşimlerini tanımlamak için UV tabanlı bir ChIRP yöntemi.

Kültürlenmiş Hücrelerden Fare Testisine Doğrudan Etkileşime Giren Proteinlerin Doğrulanabilir Tanımlanması İçin UV Tabanlı ChIRP Yöntemi

Öğrenin LC-MS/MS analizi ile nükleer kofaktörlerle etkileşimdeki proteinleri yüksek verimli belirleme yöntemini. Bu teknik, transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarını anlamak için protein-protein etkileşimlerini ortaya çıkarır.

LC-MS / MS Analizi Nükleer kofaktör ile etkileşimde proteinlerin yüksek verimli belirlenmesi için bir protein Hazırlama Yöntemi

Daha fazla video keşfet