BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Bu protokolün genel amacı, adipoz kaynaklı stromal hücrelerin spesifik hücre popülasyonlarını izole etmek ve bir in vivo analiz kullanarak bunların osteojenik aktivitesini test etmektir. Bu yöntem, adipoz kaynaklı kök hücrelerin hasarlı kemik defektlerinde tam fonksiyonel kemik dokusu oluşturmak için nasıl kullanılabileceği gibi, kraniofasiyal rejeneratif biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin taze insan dokusundan hızla izole edilmesidir; böylece hücrelerin, gen ve hücre yüzey belirteç ekspresyonunu değiştirdiği bilinen hücre kültürü ortamında zaman geçirmesi önlenmiş olur.

Bu tekniğin etkileri; kanser, travma veya enfeksiyon nedeniyle büyük kemik defektleri olan hastalara kadar uzanmaktadır. Gelecekte, ASC hücre popülasyonlarını izole etmek ve bunları rejeneratif bir şekilde kullanmak mümkün olabilir. Kalvaryal defekt oluşturmanın öğrenilmesi, temel olarak defektin kubbe şeklinde bir kafatasında oluşturulması ve dura matereye çok yakın olması nedeniyle zor olduğundan, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır.

Bu protokol için, sağlıklı bir insan donörden abdominal, yan (flank) veya uyluk subkütan yağ dokusu toplayın ve bunları plastik bir vakum kanisterinde saklayın. Yağa, eşit hacimde steril PBS ekleyin ve 30 saniye boyunca nazikçe çalkalayarak karıştırın. Sulu tabakanın çökmesini bekleyin ve ardından bu tabakayı 10 mililitrelik plastik bir pipet kullanarak uzaklaştırın.

Ardından, yağı büyük bir plastik kaba boşaltın ve eşit hacimde sindirim karışımı ekleyin. Kapalı yağ kabını %70 etanol ile temizleyin ve parafinle mühürleyin. Sonrasında, kabı 37 °C'lik bir inkübatörde, dakikada 180 devir hızla 30 dakika boyunca sallayın.

Ardından, reaksiyon hacmini standart besiyeri ile iki katına çıkararak sindirimi nötralize edin. Hücreleri santrifüjle çöktürün, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve her bir peleti 5 mililitre standart besiyerinde yeniden süspande edin. Daha sonra, tüm süspansiyonları 100 mikronluk bir filtreden geçirerek 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Filtratı 4 °C'de, 300 G'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti beş mililitre oda sıcaklığındaki RBC lizis tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyon haline geldikten sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca lizise bırakın. Ardından, tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca santrifüjleyin ve ayırma adımlarını metin protokolüne göre tamamlayın.

Doğru hücre ayıklama işlemi bu protokol için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, hücreleri 100 µL başına bir milyon hücre olacak şekilde FACS tamponunda yeniden süspande edin ve buz üzerinde tutun. Ardından, en az 10 milyon hücreyi buz üzerinde, BMPR-1B olarak etiketlenmiş plastik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Bir milyon hücreyi, üzerinde "boyanmamış" (unstained) yazan buz üzerindeki bir tüpe aktarın ve üzerine bir mililitre FACS tamponu ekleyin. Kalan hücreleri "sıralanmamış" (unsorted) olarak etiketleyin. Ardından, BMPR-1B tüpüne antikoru ekleyin ve karıştırmak için nazikçe triturasyon uygulayın.

Bu karışımı üretici tarafından önerilen süre boyunca inkübe edin. Ardından, FACS ayıklaması için hücreleri çöktürün ve dikkatlice bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspande edin. Daha sonra işlemi tekrarlayarak hücreleri mililitre başına bir milyon hücre olacak şekilde yeniden süspande edin.

Şimdi, üç hücre popülasyonunun tamamını 40 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirerek cam FACS tüplerine aktarın. Filtrelerde kalan son hücreleri durulamak için 500 microliters FACS tamponu kullanın. Ardından, antikor pozitif ve negatif popülasyonlar için iki toplama tüpü hazırlayın.

Her birini iki mililitre standart hücre kültürü ortamı ile doldurun, FACS cihazında önce boyanmamış hücreleri çalıştırın ve sonuçları floresan belirteç için negatif bir kapı (gate) tanımlamak için kullanın. Daha sonra, 100 mikronluk bir nozul kullanarak, boyanmış hücreleri standart ortam içeren ilgili tüplerine ayırın. Mümkünse, ayıklama işlemi sırasında bu tüpleri dört derece Celsius'ta soğutulmuş olarak tutun.

Hücreleri metin protokolünde açıklandığı şekilde iskeleye yükleyerek işleme devam edin. Hayvanı anestezi altına aldıktan sonra, cerrahi bölgedeki kılları kesin ve açığa çıkan cildi önce povidone iyot çözeltisi, ardından %70 ethanol ile üç kez silin. Daha sonra, cerrahi bölgeyi açıkta bırakacak şekilde hayvanın üzerini örtün.

Şimdi, 15 numaralı bistüri ucu kullanarak, dorsal kafatasının büyük bir kısmını kapsayan sagital orta hat kesisi yapın. Ardından, ince dişli pensle, sağ parietal kemiği açığa çıkarmak için kesinin sağ tarafındaki deriyi geri çekin. Matkabı, otoklavlanmış dört milimetrelik elmas kaplı trepan matkap ucu ile hazırlayın.

Ardından, parietal kemik boyunca bir defekt açın, ancak defekti kemiğin ötesine genişletmeyin ve dura mater tabakasını el değmemiş bırakın. Şimdi, hücre veya kontrol çözeltisi içeren bir iskaleyi defektin içine yerleştirin ve cilt insizyonunu sürekli naylon sütür ile kapatın. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği şekilde ameliyat sonrası fare bakım protokollerini uygulayın.

Ameliyat gününde gerçekleştirilen kafatası defektinin mikro CT taramaları, yeni defekti net bir şekilde göstermektedir. Daha sonraki zaman noktalarında tekrarlanan taramalar, BMPR-1B pozitif hücrelerin ekildiği defektlerin, BMPR-1B negatif veya ayıklanmamış hücrelere göre daha hızlı kapandığını göstermektedir. İyileşme, tam yara kapanmasının yüzdesi olarak nicelendirildiğinde, fark kolayca anlaşılmaktadır.

Ardından, defektleri içeren kafatası kısımları dekalsifiye edildi ve kıkırdağı kemikten ve aradaki tüm olgunlaşma aşamalarından ayıran Movat's pentachrome kullanılarak yeni oluşan ve kontrol kemik rejenerasyonunu tanımlamak için boyandı. Ayıklanmamış hücrelerle karşılaştırıldığında, BMPR-1B pozitif hücrelerin rejeneratif süreç üzerinde, özellikle defekt sınırları boyunca en belirgin şekilde, güçlü bir etkisi vardı. Bu videoyu izledikten sonra, hastaya özgü ASC'lerin izole edilmesi ve bunların kemik defektlerini iyileştirmek için kullanılması konusunda bu deneyin taşıdığı klinik potansiyel hakkında iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.

Farklı soy çizgi taahhütlerine sahip ASC'lerin izolasyonu için FACS kullanımı, farklı hücre tiplerinin ve dokuların zamanla nasıl iyileştiğini analiz etmek için mikro CT ve bu deneydeki kranial defekt modelini daha fazla osteoloji iyileşme deneyi planlamak için kullanmak gibi, daha fazla osteoloji iyileşme sorusunu yanıtalamak amacıyla buradan birçok alt deney türetilebilir. İnsan dokusuyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Eldiven takmak, göz koruması kullanmak ve tüm tehlikeli atıkları uygun şekilde bertaraf etmek dahil olmak üzere gerekli önlemleri aldığınızdan emin olun.