Name: BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Öğrenin yağ kaynaklı stromal hücreleri hızla izole etmeyi ve kemik iyileşmesi için canlı kalvaryum modelinde osteojenik aktivitelerini test etmeyi. Bu yöntem kraniyofasiyal rejeneratif tıpta büyük kemik defektlerinin tedavisinde umut vaat eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.D.M. American College of Surgeons (ACS) Yerleşik Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir. MSH, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) Klinik Araştırmacı eğitim hibesi TG2-01159 tarafından desteklenmiştir. M.S.H., H.P.L. ve M.T.L., Amerikan Maksillofasiyal Cerrahlar Derneği (ASMS)/Maksillofasiyal Cerrahlar Vakfı (MSF) Araştırma Bursu Ödülü tarafından desteklenmiştir. H.P.L., NIH hibesi R01 GM087609 ve Anthony Shu'nun onuruna Ingrid Lai ve Bill Shu'dan bir hediye ile desteklendi. H.P.L. ve M.T.L., Hagey Pediatrik Rejeneratif Tıp Laboratuvarı ve The Oak Foundation tarafından desteklendi. MTL, NIH hibeleri U01 HL099776, R01 DE021683-01 ve RC2 DE020771 tarafından desteklenmiştir. DCW, NIH hibesi 1K08DE024269, Hagey Pediatrik Rejeneratif Tıp Laboratuvarı ve Stanford Üniversitesi Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü Fakülte Akademik Ödülü ile desteklenmiştir.

Not: numuneleri rıza veren hastadan elde edildi. Tüm protokoller gözden geçirilmiş ve uygun Stanford Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. insan doku ve hücrelerinin işlerken, her zaman kurum tarafından belirtilen, Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) önlemlere uymak. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> FACS tampon hazırlanması: 10 ml FBS, 188 5 ml Poloxamer 500 ml steril fosfat tamponlu tuz için 5 ml Pen-Strep (PBS) ekleyin. </li><li> Karışımı sindirmek hazırlayın: 0.375 gr C hemolyticum kollajenaz tip II tozu ve 5 mL Poloxamer steril 199 / EBSS ortamı 188 500 ml ekleyin. </li><li> Standart orta hazırlayın: 50 ml FBS ve 500 mL Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı için 5 ml Pen-Strep ekleyin. </li></ol> 2. Hasat ve TSK izolasyonu NOT: yeterli kurumsal onaylar insan dokusu kullanarak ve izolasyon saat yerinde olduğundan emin olunuman kök hücreleri. Insan karın elde kuşatan, ya da seçmeli liposuction uygulanan sağlıklı bir donörden cilt altı yağ uyluk. Bir plastik emme kabı içinde yağ tutun. <ol><li> Orijinal plastik kutunun içinde yağ: 1 oranında bir 1, steril PBS ilave edin. (500 mi yağ var ise, 500 ml PBS ilave). 30 saniye için hafif ajitasyon ile karıştırın. Sulu tabaka, emme bağlanmış bir 10 ml plastik pipet ile sulu tabakanın alt (Şekil 1) ve daha sonra aspire yerleşmek ve atın izin verin. </li><li> büyük bir plastik kap içine yağ süzün ve 1 karışımı sindirimi ekleyin: 1 oranında. Kabı kapatın ve% 70 etanol ile dışını temizleyin. parafin film ile kapağı mühür. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 180 rpm&#39;de yörüngesel karıştırıcıda bu kabı çalkalayın. </li><li> : 1 oranında bir 1, standart orta ekleyerek sindirim nötralize. (1000 ml yağ karışımı varsa, 1.000 ml standart orta ekleyin). </li><li> eşit 25 eşit sayıda içine karışımı dağıtın0 ml plastik konik santrifüj tüpleri ve santrifüj 4 ° C &#39;de 20 dakika boyunca 300 x g&#39;de kanşım </li><li> Süpernatantı aspire ve bozulmamış pelet bırakmak için dikkatli olun. Her konik tüp için 5 ml standart ortamda pelet tekrar. </li><li> Bir 50 ml konik santrifüj tüpüne 100 mikronluk bir filtre boyunca süspansiyon filtre. Daha sonra, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire ve 5 ml oda sıcaklığında RBC parçalama tamponunda pelletini. Karışım, daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) 300 xg&#39;de santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bekletin. </li><li> Süpernatantı aspire ve 15 ml standart orta pelletini. Yine, 50 ml konik santrifüj tüpüne 100 mikronluk bir filtre boyunca filtre edin. </li><li> Yeni 50 ml konik, yoğunluk tabanlı ayırma (reaktif listesine bakınız) için tasarlanmış 15 mL polisükroz çözüm ekleyin. Sonra, bir 45 ° açıyla tüp tutarak dikkatlice yüzüne hücreleri pipetTüp polisükroz çözeltisi üzerine hücre süspansiyonu hafifçe katmanları (Şekil 2), böylece. NOT: Bu çözeltinin yüzeyine pipet hücreleri için önemlidir. Bu geri dönüşü olmayan bir karışım oluşturmak gibi bir hücre süspansiyonu polisükroz çözüm katmayın. Benzer şekilde, polisükroz çözeltisi merkezine hücreleri pipetle değildir. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de bu karışımın santrifüjleyin. Düşük ivme kullanın (- 2 10 üzerinden 3) ve bu adım için sıfıra santrifüj fren işlevini ayarlayın. NOT: ortasında bulutlu, alt net ve somon renkli üstünde: Üç katmanlar görünür olacaktır. orta tabaka ilgi hücreleri içerir. </li><li> 10 ml pipet kullanarak dikkatlice orta tabakayı kaldırmak ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer. NOT: tamamen orta tabakanın bazı geride bırakmak daha üst ve alt katmanları bazılarını almak orta tabaka transferi ve bu süreçte daha iyidir. </li> &lt;li&gt; hemasitometre kullanarak hücre sayımı ve toplam canlı hücre sayısını belirlemek. Not: Genellikle kullanımı tripan mavi hücreleri sayma yardımcı olmak için% 0.8 bir son konsantrasyona kadar, hücre karışımına ilave edildi. Canlı canlı hücreler mavi boya kadar sürmez ve beyaz görünecektir. </li></ol> BMPR IB pozitif hücrelerin ve hücre ihtiva eden ıskelesının Sıralama 3. FACS <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. (Adım 2.13 yapılan hücre sayımına bağlı olarak), 100 uL başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> etiketli plastik santrifüj tüpüne en az 10 milyon hücre Transferi &quot;BMPR-IB.&quot; Ayrı, etiketli ayrı bir plastik santrifüj tüpüne 100 uL FACS tampon bir milyon hücreleri transferi &quot;boyanmamış.&quot; &quot;Boyanmamış&quot; tüp 1 ml FACS tampon ekleyin. FACS exper kısmı sıralama buz üzerinde FACS tamponu içerisinde hücrelerin kalan tutuniment yapılmaktadır. Bu hücreleri etiketlemek &quot;Unsorted.&quot; kontroller daha sonra deneyde olarak kullanın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre &quot;BMPR IB&quot; tüp bir flüoresan anti-insan BMPR IB antikorun uygun miktarda. antikor dağıtmak için hafifçe yukarı ve aşağı karışımı pipetle. NOT: 1:10 seyreltme bir insan BMPR-IB / ALK-6 APC-konjuge antikor kullanmak (detaylar için reaktif listesine bakınız). Ancak, farklı üreticilerin antikorlar farklı tavsiye edilen konsantrasyonlarda olacaktır. </li><li> ışığı tutan bir şekilde buz kovası örtün. Hücre / antikor karışımı, 30 dakika boyunca (ya da antikor üretici talimatlarına göre) yapılmaktadır izin verin. Not: Anti-BMPR IB antikor, bir ikincil antikor gerektiren birincil konjuge olmayan antikor olarak gelir, üreticinin talimatlarına uygun olarak ikincil antikor ile buz üzerinde ayrı bir boyama adımı gerçekleştirmek. </li><li> Her iki tüpleri santrifüj4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g. pelet aspire için dikkatli olmak, süpernatant aspire. 1 ml FACS tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Yine 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de tüpler santrifüj. Süpernatantı dikkatlice aspire 1 ml başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Yeni etiketli cam FACS tüpler içine 40 mikron hücre süzgeçler aracılığıyla &quot;BMPR-IB&quot;, &quot;unstained&quot; ve &quot;Unsorted&quot; hücreleri Filtre. Hücreler filtre geride değil emin olmak için 500 uL FACS tamponu ile filtre durulayın. Ayrıca &quot;BMPR-IB-pozitif&quot; ve etiketli iki ayrı plastik santrifüj tüplerine 2 ml standart orta ekleyin &quot;BMPR-IB-negatif.&quot; FACS makine sıralanır hücreleri toplamak için bu ikisini kullanın. </li><li> FACS makinede, floresan işaretleyici için negatif bir kapı tanımlamak için lekesiz hücreleri kullanın. </li><li> 100 mikron memesi, ilgili tüplere con içine sıralama BMPR-IB pozitif ve negatif hücreler kullanılarakStandart ortam taining. FACS makine bu yeteneği varsa sıralama sırasında 4 ° C&#39;de soğutulmuş bu tüpler tutun. NOT: Sharon ve arkadaşları tarafından JOVE 13. Maddenin bakın. FACS sıralama için mükemmel bir protokol için. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak, her bir tüp içinde hücreleri sayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de &quot;&quot;, BMPR-IB-pozitif &quot;BMPR-IB-negatif&quot; ve &quot;Unsorted&quot; tüpleri Santrifüj ve hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatant aspire. Daha sonra 250 uL başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda standart ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Ön-kesim, 4 mm PLGA (poli [laktik-ko-glikolik asit]) hidroksiapatit ile kaplanmış iskeleleri elde edilir. 24-iyi plaka iyi her bir iskele yerleştirin. BMPR-IB-pozitif Unsorted, ve BMPR-IB-negatif (Şekil 3): (. I .e, 200.000 hücreleri) üç gruptan birine hücre süspansiyonu 50 ul her iskele örtün. NOT: LütfenLo ve arkadaşları tarafından JOVE madde 14 başvurun. PLGA iskelelerinin yapımı ile ilgili detaylar için. </li><li> Kısmen, (iskelelerinin kuruma önlemek için), kapağı plakası kapağı ve 30 dakika boyunca 37 ° C &#39;de, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe standart ortam ile çevre boş kuyu doldurun. </li></ol> Kalvaryum Kusur ve ACS içeren Scaffold Uygulama 4. oluşturulması NOT: yeterli kurumsal onaylar canlı farelerde kalvaryal kusurların oluşturulması için yerinde olduğundan emin olun. Bu protokol Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. <ol><li> inhale izofluran gaz veya enjekte uzun etkili anestezik kokteyl kullanarak CD-1 çıplak fare anestezisi. <ol><li> Tek başına gaz kullanmak, bir anestezi odasına fare koyun ve 2 oksijen akışını başlatmak - izofluran% 2 konsantrasyonda 3 L / dk. fare F sonraully bilinçsiz, bir emici ped ile sıcak su sirkülasyon battaniye üzerine o eğilimli yerleştirin ve oksijen ve izofluran aynı konsantrasyon ile bir anestezi burun konisi içine burun yerleştirin. Dikkatle solunum hızını izlemek ve gerektiğinde izofluran konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> yukarıda tarif edildiği gibi anestezi bölmesi fare anestezi, enjekte uzun etkili anestezik kokteyl kullanmak ve daha sonra anestezi kokteyl enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir. Anestezi odasından fareyi çıkarın ve davranışlarını gözlemlemek. NOT: Fare kısaca anestezi ancak birkaç dakika içinde ortaya çıkabilir yine tam enjekte anestezi etkisi altında anestezi gerekmektedir. bir emici ped ile kaplı bir sıcak su sirkülasyon battaniye fare aktarın. Not: bir anestetik kokteyl sağlamak için, normal tuzlu su içinde ketamin 10 mg / mL ve ksilazin, 1 mg / ml ihtiva eden bir karışım, intraperitoneal önerilir. Bu karışımın standart doz300 uL 100 mg / kg ve ksilizin 10 mg / kg ketamin eşittir 30 g fare için. Enjekte anestezi ile ilgili daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. </li><li> Anestezi derinliğini belirlemek için bir ayak tutam manevrası kullanın. hafifçe cerrah tarafından sıkışmak zaman, yeterince anestezi fare pençesini geri olmaz. </li><li> Korneanın kuruma önlemek için göz merhemi sürün. </li><li> 1 mg / kg buprenorfin SR subkutan yönetme. NOT: Üstün ağrının cerrahi sonuçlarına önce analjezi sağlanması. </li><li> tüm prosedürü sırasında, fare solunum hızını izlemek. NOT: - / dk 100 nefesler düzgün izofluran altında anestezi bir fare 50 bir solunum oranına sahip olmalıdır. Artmış solunum hızı azalmış solunum hızı anestezi çok derin olduğunu gösteriyor olabilir iken anestezi, çok hafif olduğunu gösterir. </li></ol></li><li> povidon-iyot ile kafatası dorsal deri hazırlıkine çözeltisi% 70 etanol ile üç kez, ardından. maruz cerrahi siteden ayrılmadan, steril örtüler ile örtün. NOT: steril cerrahi eldiven giyin ve işlem sırasında steril tekniği korumak. Ancak böyle steril örtü ve otoklava araçlar olarak steril yüzeyleri ve nesneler dokunun. Asistan aydınlatma, açık dikiş paketleri, vb ayarlamak mı </li><li> 15 bıçak neşter kullanılarak, dorsal kafatası çoğunluğu boyunca uzanan bir sagital orta hat kesi yapmak. ince dişli forseps kullanarak, sağ parietal kemik açığa kesi sağ tarafındaki deriyi geri çekin. </li><li> otoklavlanıp 4 mm elmas kaplı trefin matkap ile bir matkap kullanarak, paryetal kemik yoluyla kusur matkap. dura mater tabakası içine kemik geçmiş kusur uzatmayın. (Şekil 4) </li><li> defekt içine bir iskele yerleştirin ve sonra naylon dikiş çalışan cilt kesisi kapatın. </li><li> fare izleyin ve standart postoperatif bakım a sağlamakkurumsal kurallarına şeklinizi ona göre. <ol><li> o kurtarır iken temiz bir kafes içinde temiz bir kağıt havlu üzerinde fare tutun. kafes bir yarısı, bir ılık su çevrimli battaniyesi üzerine yerleştirilmelidir ve fare başlangıçta bu devre, yerleştirilmelidir. </li><li> o ambulate için yeterli bilinci yerine kadar bir fare gözetimsiz bırakmayın. tamamen iyileşti kadar diğer fareler ile bir kafes için ameliyat geçirmiş bir fare iade etmeyin. </li></ol></li><li> test edilecek olan her iskele için yeni bir fare ile yukarıdaki adımları tekrarlayın. sıcak bir boncuk sterilizatör veya diğer uygun yöntem kullanılarak ameliyatlar arasında cerrahi aletler sterilize. </li><li> Kısa bir süre işlemden sonra ve daha sonra 2, 4, 6, ve 8 hafta sonra, kalvaryal kusur, kapağın oranının analizi için bir mikro CT tarama kullanımı. NOT: Levi ve ark makalesine bakın. Kalvarial kusurların mikro BT&#39;de açıklaması için 6. </li><li> Ne zaman deney komple birTe, temiz bir ötanazi bölme içine yerleştirilmesi ve 2 L / dakikalık bir hızda bölme içine, karbon dioksit gazı akışı başlayarak fareler euthanize. solunuma tamamen (sonra yaklaşık 10 dakika) durdurdu sonra ötenazi onaylamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin. </li><li> Deney tamamlandıktan sonra isteğe bağlı olarak, kullanım kesit ve histolojik boyama defekti içinde kemik oluşumunu değerlendirmek. NOT: McArdle ve arkadaşları tarafından makalesine bakın. Kemik hazırlama ayrıntılar için 12 histoloji için numune. Histolojik ve boyama teknikleri gözden geçirmek için, bu tür Cerrahi Patoloji 15 Manual olarak histolojik el kitabına bakın. </li></ol>

<ol><li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+site+morbidity+after+anterior+iliac+crest+bone+harvest+for+single-level+anterior+cervical+discectomy+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).</li>
<li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: an update.</a> Injury. 36, S20-S27 (2005).</li>
<li>Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+graft+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Bone graft substitutes.</a> Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).</li>
<li>Walmsley, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+in+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology in bone tissue engineering.</a> Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).</li>
<li>Chapekar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: challenges and opportunities.</a> J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects.</a> PLoS One. 5 (6), e11177(2010).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29-positive+selection+enhances+osteogenic+capacity+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).</li>
<li>Wozney, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+bone+formation%3A+molecular+clones+and+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.</a> Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).</li>
<li>Wan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li>
<li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li>
<li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (71), e4425(2013).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> J Vis Exp. (68), (2012).</li>
<li>Lester, S. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLester%2C+SC+%22Manual+of+surgical+pathology%22">Manual of surgical pathology</a>. , Saunders/Elsevier. (2010).</li>
<li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+isolation%2C+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li>
</ol>

Yazarların yapacak herhangi bir açıklaması yoktur.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar TSK Hasat sırasında, kritik bir adım kollajenaz ile yağ yeterli sindirim olduğunu. Yetersiz sindirim TSK düşük bir verimle sonuçlanır. BMPR-IB + hücrelerinin FACS sıralama sırasında, dikkatli pozitifliği açısından kapısı tanımlamak önemlidir. çok gevşek kapıları tanımlanması saf değildir sıralı nüfus neden olabilir. kalvarial defekt oluşturulması sırasında, kafatası kemik yoluyla kusur delmek için ancak dura mater içine ilerlemek değil kritik öneme sahiptir....

yaralanma, enfeksiyon veya invaziv kanser kaynaklanan başlıca kemik defektleri hastanın iyileşmesi ve yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip. Teknikleri yerde hastanın kendi vücudunda sağlıklı kemik ile bu kusurları doldurmak için var, ama bu transfer, kendi morbidite ve komplikasyonları 1, 2, 3 riskini taşır. Ayrıca, bazı kusurları yeterli donör kemik defekti doldurmak için mevcut değildir o kadar büyük veya karmaşık. Protez cihazlar kemikli defektleri doldurmak için potansiyel bir seçenek ancak bu enfeksiyon riski, donanım arızası ve yabancı cisim reaksiyonu 4 dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları ile ilişkilidir. Bu nedenlerden dolayı hastanın kendi hücrelerini 5 kullanan biyolojik kemik yerine geçen mühendislik olasılığı büyük ilgi var. Yağ-kaynaklı stromal hücreler (TSK)onlar hastanın kendi yağ dokusunda bolca mevcuttur ve yeni kemik dokusu 6, 7 üreterek kemik defektleri iyileşmek için yeteneğini göstermiştir çünkü bu uygulama için potansiyel var. TSK hücreler ve çeşitli çalışmalar çeşitli nüfus spesifik hücre yüzey belirteçleri için seçilerek geliştirilmiş osteojenik aktivitesi 8, 9 hücre popülasyonları göstermiştir vardır. En yüksek osteojenik potansiyele sahip TSK seçilmesi, bu hücreleri ile seribaşı bir iskele büyük bir kemik defekti yeniden olabilir olasılığını artırmak olacaktır. Kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal kemik farklılaşmasını ve oluşumu 10 ve TSK 11 osteogenesis için önemli olduğu bilinen BMP reseptörü tip lb (BMPR-IB) düzenlenmesi için çok önemlidir. Son zamanlarda, biz olabilir b BMPR-IB o ifadeyi göstermiştirE geliştirilmiş osteojenik aktivite 12 TSK için seçmek için kullanılır. Burada, bir in vivo kalvaryal hata modeli kullanarak osteojenik aktivitesi deneyi takiben, insan yağ TSK BMPR-IB-sentezleyen izolasyonu için protokol göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>100 mikron hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 bıçaklı neşter</td><td>Miltex</td><td>4-515</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>40 mikron hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Ethilon naylon sütür, 18", P-3 iğne,&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1698G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BMPR-IB primer antikor</td><td>R& D sistemleri</td><td>FAB5051A</td><td></td></tr><tr><td>BioGel PI cerrahi eldivenler</td><td>M&ouml; lnlycke Sağlık ALA42675Z</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejo iğne sürücüsü</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>CD1 çıplak fare</td><td>Charles River</td><td>086</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip II toz</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM orta</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td></td></tr><tr><td>Matkap: Dairesel bıçak 4,0 mm</td><td>Xemax Cerrahi</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>Matkap: Z500 Fırçasız Mikromotor</td><td>NSK</td><td>NSKZ500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gicbo</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Emici Alt Pedler, 20" x 24"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Steril pamuklu gazlı bez, 4" x 4"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma yastığı</td><td>Kent Scientific</td><td>DCT-20</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 199/EBSS orta</td><td>GE&nbsp; Yaşam Bilimleri</td><td>SH30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia isoflurane</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td></td><td></td>050033</tr><tr><td>Dişli Mikro Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Dişli Mikro Forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-5150</td><td></td></tr><tr><td>Parafin film (Parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PLGA iskeleleri</td><td>Tescilli Formülasyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188, %10</td> <td>Sigma</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Çok Çizgili Steril Alan, 18" x 24"</td> <td>Busse Hastane Tek Kullanımlık</td><td>696</td><td>Uygun boyutta dikdörtgen bir delik kesin</td></tr><tr><td>Polisükroz Çözelti: Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Povidone İyot Hazırlama Solüsyonu</td><td>Medline</td><td>MDS093944H</td><td></td></tr><tr><td>Puralube petrolatum oftalmik merhem, 1/8 oz. tüp</td><td>Dechra Veteriner Ürünleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Webcol alkol hazırlama çubukları</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr></tbody></table>

bmpr-ib + hızlı İzolasyon kalvaryum hata Şifa modeli kullanılan stromal hücreleri yağ kaynaklı

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

İnvaziv kanserler, majör yaralanmalar ve enfeksiyon, hastanın kendi vücudundan önceden var olan kemikle yeniden yapılandırılamayacak kadar büyük kemik kusurlarına neden olabilir. Bir hastanın kendi hücrelerini kullanarak kemik de novo büyütme yeteneği, kemik defektlerinin, doğal kemiğin toplanmasının morbiditesi olmadan yeterli doku ile doldurulmasına izin verecektir. Doku mühendisliği için bir kaynak olarak adipoz kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) kullanımına ilgi vardır, çünkü bunlar bol miktarda bir kaynaktan elde edilir: hastanın kendi yağ dokusu. Bununla birlikte, ASC'ler heterojen bir popülasyondur ve bazı alt popülasyonlar bu uygulamada diğerlerinden daha etkili olabilir. ASC'lerin en osteojenik popülasyonunun izolasyonu, bir kemik mühendisliği sürecinin verimliliğini ve etkinliğini artırabilir. Bu protokolde ASC'ler insan donörden alınan deri altı yağ dokusundan elde edilir. BMPR-IB belirtecini ifade eden ASC'lerin alt popülasyonu FACS kullanılarak izole edilir. Bu hücreler daha sonra bir in vivo kalvarial defekt iyileşme testine uygulanır ve sınıflandırılmamış hücrelere kıyasla gelişmiş osteojenik rejeneratif potansiyele sahip olduğu bulunmuştur.

Mikro BT açıkça kafatası defekti gösterecektir ameliyat günü yapılan tarama. Şu anda 4 mm defekt içine hiçbir büyümesi olacak. Daha sonraki taramaları başlangıca kıyasla zamanla kusurun büyüklüğünü ölçmek için zamanla elde edilir. BMPR-IB- ve tasnif hücreleri (Şekil 5) ile karşılaştırıldığında BMPR IB + hücreleri ile tohumlanmış Kusur kusurun daha hızlı kapanmasına göstermelidir. Buna ek olarak, kusur içeren kafatasının kısmı kireçten ve standart yöntemler kullanılarak <...

Adipoz kaynaklı stromal hücreler, bir hastanın kendi hücrelerinden yeni doku mühendisliği için yararlı olabilir. Artmış osteojenik potansiyele sahip insan adipoz kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) bir alt popülasyonunun izolasyonu için bir protokol sunuyoruz, ardından hücrelerin in vivo kalvarial iyileşme testinde uygulanması izleyeceğiz.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

Bu protokolün genel amacı, adipoz kaynaklı stromal hücrelerin spesifik hücre popülasyonlarını izole etmek ve bir in vivo analiz kullanarak bunların osteojenik aktivitesini test etmektir. Bu yöntem, adipoz kaynaklı kök hücrelerin hasarlı kemik defektlerinde tam fonksiyonel kemik dokusu oluşturmak için nasıl kullanılabileceği gibi, kraniofasiyal rejeneratif biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin taze insan dokusundan hızla izole edilmesidir; böylece hücrelerin, gen ve hücre yüzey belirteç ekspresyonunu değiştirdiği bilinen hücre kültürü ortamında zaman geçirmesi önlenmiş olur.Bu tekniğin etkileri; kanser, travma veya enfeksiyon nedeniyle büyük kemik defektleri olan hastalara kadar uzanmaktadır. Gelecekte, ASC hücre popülasyonlarını izole etmek ve bunları rejeneratif bir şekilde kullanmak mümkün olabilir. Kalvaryal defekt oluşturmanın öğrenilmesi, temel olarak defektin kubbe şeklinde bir kafatasında oluşturulması ve dura matereye çok yakın olması nedeniyle zor olduğundan, bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır.Bu protokol için, sağlıklı bir insan donörden abdominal, yan (flank) veya uyluk subkütan yağ

rapid-isolation-bmpr-ib-adipose-derived-stromal-cells-for-use

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

İnsan perivasküler kök hücreler (PSC'ler) mezenkimal kök hücreler (MKH) benzer iskelet doku yenilenmesine yönelik yeni bir kök hücre sınıfı vardır. PSC'ler standart bir yağ emme prosedürleri sırasında temin adipoz dokusu FACS (floresans aktive hücre ayırma) yoluyla izole edilebilir, ardından kemik oluşumunu sağlamak için bir osteoendüktif iskelesi ile...

Kemik Rejenerasyon için İnsan perivasküler Kök Hücre kullanın

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Rejeneratif uygulamalar için idealdir insan iskelet kası liman birkaç çok-soy öncü nüfus içindeki kan damarları. Intima gelen Miyojenik endotel hücreleri, medya perisitler ve adventisyanın gelen adventisyal hücreler: Bu izolasyon yöntemi, kan damarlarının üç yapısal katmanları sırasıyla üç multipotent öncü hücre popülasyonlarının eşzamanlı arınma sağlar.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

otolog serum ile insan Mezenkimal Stromal Hücreleri (hMSCs) Kültürleme, ksenojenik malzeme ve diğer olumsuz etkileri ile reddi riskini azaltır. Aynı zamanda, taze hMSCs sağlayabilir mezodermal progenitörlerin bir alt kümesi, bir geri kazanımını sağlar. otolog fibrin pıhtısı içinde hMSCs gömülmesi kolay kullanım ve etkin bir cerrahi implantasyon sağlar.

Mezenkimal Stromal Otolog Koşullarında Hücre Kültürü ve Teslimat: Ortopedik Uygulamalar için Akıllı Yaklaşım

Burada, damar oluşumu içinde vivo görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve gerçek zamanlı olarak 3D İskele tarafından multiphoton mikroskobu. Genetiği değiştirilmiş iskele anjiogenez bir fare grefti kritik Kemik defekti modelinde incelenmiştir. Daha fazla yeni kan damarları tedavi grubunda denetimlerde tespit edildi.

Angiogenez Multiphoton mikroskobu In Vivo genetiği değiştirilmiş 3D-PLGA/nHAp İskele tarafından grefti kritik Kemik defekti tamir için görselleştirme

Biz macroporous microcarriers bir hücre genişletme protokolü ve kullanımları decellularized doku matris temel için bir perfüzyon biyoreaktör teslim sistemi olarak öneriyoruz. Biz de hücre çoğalması ve canlılığı üzerinde microcarriers kültürlü hücre belirlemek için farklı teknikler içerir. Ayrıca, biyoreaktör kültürler sonra hücreleri işlevselliğini göstermektedir.

Rekombinant kolajen peptid Microcarriers hücre genişletme ve hücre teslim sistemi bir biyoreaktör olarak potansiyel kullanım için ben Model

Roman Biyomalzeme büyük kemik lezyonlar onarmak için tasarlanmış sayısı sürekli olarak kemik iyileşmesi geliştirmek ve kemik nakli ile ilgili komplikasyonlar aşmak amacı ile genişletiyor. Burada, önceden klinik biyouyumluluk Biyomalzeme kemik onarımı için test edilmesi için çok disiplinli bir strateji mevcut.

Biyolojik uyumluluğu Biyomalzeme kemik rejenerasyon için profil sayfası

Bu makalede, sıçan mandibulalarından kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini izole etmek, yetiştirmek, sıralamak ve tanımlamak için tüm kemik iliği yapışması ve akış sitometrisi sıralamasını birleştiren bir yöntem sunulmaktadır.

Sıçanlarda Mandibuler Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin İzolasyonu ve Yetiştirilmesi

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Öğrenin yağ kaynaklı stromal hücreleri hızla izole etmeyi ve kemik iyileşmesi için canlı kalvaryum modelinde osteojenik aktivitelerini test etmeyi. Bu yöntem kraniyofasiyal rejeneratif tıpta büyük kemik defektlerinin tedavisinde umut vaat eder.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Daha fazla video keşfet