DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Bu prosedürün genel amacı, seçilen bir hücrenin genom çapındaki replikasyon zamanlama programını haritalandırmaktır. Bu yöntem, replikasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, genomik replikasyon programının sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda nasıl değiştiği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli hücrelerde ve koşullarda replikasyon zamanlamasını haritalamak için hızlı ve basit bir yol sunmasıdır. Protokolü yazan kişi, Tıp Fakültesi'nde bir FACS uzmanı olan Dan Lehmann'dır. Bu prosedür genellikle en az 1-2 × 10⁶ hızlı büyüyen senkronize edilmemiş hücre ile başlar.

Adheran hücreler için, her plakayı kalsiyum ve magnezyum içermeyen üç mililitre PBS ile aspire edin ve yıkayın. PBS'yi dökün ve her plakaya bir mililitre ticari Trypsin-EDTA ekleyin. Hücreler ayrılana kadar 37 °C'de beş dakika inkübe edin.

Tripsini nötralize etmek için üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe veya beş mililitrelik polistiren tüpe toplayın. Hücreleri buz üzerinde tutun. Bu prosedüre başlamak için, hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 300 x G'de santrifüjleyin.

Hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile aspire edin ve yıkayın. Ardından hücreleri santrifüjleyin. İkinci yıkamanın ardından PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri 250 mikrolitre soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.

Tüpü hafifçe vortekslerken, -20 °C sıcaklıktaki %100 yüksek saflıktaki etanolden 800 µL yavaşça damla damla ekleyin. Bu işlem, nihai etanol konsantrasyonunun %70 ila %80 olmasını sağlar. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Bu prosedüre, fikse edilmiş hücreleri 4 °C'de on dakika boyunca 500 x G'de santrifüj ederek başlayın. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama sonrası çöktürme işlemi yapın.

İkinci yıkamadan sonra süpernatanı aspire edin ve her hücreyi şu PI karışımı ile yeniden süspande edin: beş mikrolitre on miligram/mililitre RNAaz ve 50 mikrolitre bir miligram/mililitre propidyum iyodür içeren bir mililitre PBS. Örneği 35 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek 5 mililitrelik bir polistiren tüpe filtreleyin.

Tüpü parafilm ile mühürleyin. Oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin. Propidyum iyodür ışığa duyarlı olduğu için örnekleri karanlıkta tutun.

Hücreler bir FACS cihazı kullanılarak ayrılacaktır. Hücreleri propidyum iyodür yoğunluklarına göre ayırt etmek için 561 nanometre lazeri kullanın. En iyi sonuçlar için, ilgili hücre boyutu için önerilen en küçük nozulu kullanın.

Çoğu hücre için bu değer 85 micrometers'dır. Sabit ve yavaş bir akış kullanın. Genellikle saniyede 300 ile 500 olaya kadar olan değerler kullanılır.

Gating kullanarak, FCS'ye karşı SSC çizerek ölü hücreleri ve hücre altı kalıntıları ayırt edin. Canlı hücreler arasından, önce SSC genişliğine karşı SSC yüksekliğini, ardından FFC genişliğine karşı FFC yüksekliğini ve propidium iodide genişliğine karşı propidium iodide yüksekliğini çizerek dubletleri ayırt edin. Canlı sinyal hücreleri için, hücrelerin DNA içeriğini temsil eden propidium iodide alan yoğunluğunun bir histogramını çizin.

Hücreleri soğuk koşullar altında G1 ve S fazlarına göre ayırın. S fazı için kapılama geniş olmalı ve G1 ile G2 fazlarına taşmalıdır. G1 kapılaması ise dar olmalı ve S fazından mümkün olduğunca uzak tutulmalıdır.

Bazı hücre tipleri için, uygun bir hücre döngüsü dağılımı elde etmek zor olabilir. S fazı hücreleri olmadan G1 fazını almak en kritik noktadır. Sıralanmış hücrelerin bulunduğu tüpleri fax makinesinden çıkarın.

Sıralama işleminden sonra tüpleri buz üzerinde tutun. Hücre sıralamasını takiben, her örneğe ait DNA, üreticinin talimatları doğrultusunda ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır. Ardından, DNA'yı odaklanmış bir ultrasonikatör ile ortalama 250 baz çifti hedef pik boyutuna gelecek şekilde parçalayın.

Fragmente DNA'nın boyutunu elektroforez ile doğrulayın. Önerilen boyut dağılımı, yaklaşık 250 baz çiftinde bir pik ile 200 ila 700 baz çifti arasındadır. Ardından, kütüphane metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanır, dizilenir ve analiz edilir.

Fare embriyonik fibroblastlarından alınan tüm birinci kromozom için bir replikasyon zamanı haritası gösterilmektedir. Yaklaşık 50 megabaslık bir bölgeye daha yakından bakıldığında; noktalar, bireysel pencereler için normalize edilmiş S/G1 oranını, düz çizgi ise kübik yumuşatma ve interpolasyon sonuçlarını temsil etmektedir.

Yüksek S/G1 değerleri erken replikasyona karşılık gelirken, düşük değerler geç replikasyona karşılık gelir. Kırmızı oklar sabit replikasyon zamanı bölgelerine, yeşil oklar ise zamansal geçiş bölgelerine işaret etmektedir. Bu şekil, fare kromozom birindeki aynı 18 megabazlık bölgede, fare pre-B hücrelerinin triplikalarıyla karşılaştırıldığında, fare embriyonik fibroblastlarının triplikaları arasındaki replikasyon zamanı haritalarının tekrarlanabilirliğini göstermektedir.

Turuncu oklar, hücre hatları arasındaki diferansiyel bölgelere örnekleri göstermektedir. Altı örnek arasındaki spearman korelasyonlarının ısı haritası sonuçları daha da doğrulamaktadır. Hücrelerin toplanmasından haritaların oluşturulmasına kadar olan bu teknik, bir kez uzmanlaşıldığında ve doğru şekilde uygulandığında bir hafta içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, büyüyen hücreler için replikasyon zamanlaması genomik haritalarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.