Name: DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Keşfedin, memeli hücrelerde genom çapında replikasyon zamanlaması haritalarını hızlı ve basit bir şekilde oluşturmak için CNR-ToR yöntemini. FACS ile S ve G1 faz hücrelerini ayırarak DNA içeriği farklarını analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz rakamları oluşturmada yardım için Oriya Vardi teşekkür ederiz. BS grubunda çalışma, İsrail Bilim Vakfı (hibe No 567/10) ve Grant (# 281306) Başlangıç ​​Avrupa Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir.

Not: Şartname sadece büyüyor, eşitlenmemiş hücreler üzerinde ölçülebilir. Genellikle S fazında ~ 1 x 10 5 hücre neden olur 2 x 10 6 hızlı büyüyen hücreler, (oran sınırlayıcı adım) - prosedür en az 1 ile başlamalıdır. Iki ya da üç kez tekrarlanmış kullanılarak her bir deney için tavsiye edilir. CNR-ToR&#39;un tüm süreci bir hafta içinde tamamlanabilir - iki gün bir veya iki gün sıralama için gerekli olan ve ek bir gün ilk veri analizi için gerekli olan, kütüphane hazırlanmasına kadar tüm adımlar adanmış olmalıdır. Kültür hücreleri 1. Koleksiyonu NOT: protokolü (yaklaşık 2 içeren - 5 x 10 6 hücre) 10 cm&#39;lik plakalar kültür büyüyen hücreler için yazılmıştır, ancak kolayca diğer platformlara ayarlanabilir. <ol><li> süspansiyon içinde büyütüldü hücreler için, fiksasyon (bölüm 2) geçin. </li><li> Yapışık hücreler, aspirat ve pl yıkama içinCa 2+ ve Mg 2+ olmadan 3 ml PBS ile yedi. </li><li> PBS atın ve hücreler ayrılana kadar 1 ml ticari bir tripsin-EDTA ile 37 ° C &#39;de 5 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: tripsin tedavi süresi, her hücre türü için ayarlanmalıdır. </li><li> Tripsin nötralize ve 15 ml konik tüp veya 5 ml polistiren tüp hücreleri toplamak için 3 ml kültür ortamı ekleyin. buz üzerinde tutun. </li></ol> 2. Sabitleme Not: Bu parça için, tüm adımlar 4 ° C&#39;de yapılmalıdır. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> Aspire edin ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez yıkama hücreleri. </li><li> 250 uL (toplam) soğuk PBS içinde süspanse edin hücreleri. </li><li> tüp hafifçe vorteks birlikte, yavaş yavaş Cı% 100 etanol -20 ° damla damla 800 mL ekleyin. % 80 - Bu 70 bir son etanol konsantrasyonu yol açar. NOT: Yüksek saflıkta etanol bu aşamada tavsiye edilir. </li><li> fo buz üzerinde inkübe hücreleriR 30 dk. NOT: Bu aşama, hücreler 4 ° C&#39;de ya da -20 ° C&#39;de bir kaç ay için bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 3. PI Boyama <ol><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> dikkatle süpernatant aspirat ve 1 ml soğuk PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. </li><li> Aspire, aşağıdaki karışım ile her bir örnek tekrar süspansiyon ve 1 ml PBS, 5 uL 10 mg / mL RnazA, 50 uL 1 mg / ml propidium iodide (PI, kullanımdan önce şişe karıştırıldı). ~ 2 x 10 6 hücre / ml) kadar konsantrasyonunu ayarlayın. NOT: Işık uzak tutun - PI duyarlı ışıktır. </li><li> 5 ml polistiren tüp 35 mikron örgü süzülmeye ve Parafilm ile yakın. </li><li> 30 dakika - 15, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin. NOT: Hücreler artık FACS analizi için hazırız. Gerekirse, lekeli hücreler, karanlıkta 4 ° C&#39;de en az 24 saat süre ile depolanabilir. </li></ol> 4. Sıralama <ol><li> FACS makinesi kullanılarak Sıralama hücreleri. Bizekendi PI yoğunluğuna dayalı hücreleri ayırt etmek için 561 nm lazer e. 488 nm veya 532 gibi 535 nm uyarma maksimum yakın diğer lazerler FACS makine konfigürasyonuna bağlı olarak kullanılabilir. </li><li> En iyi sonuçlar için, (çoğu hücreleri 85 mikron için) belirli bir hücre boyutu için önerilen en küçük meme kullanın. verim üzerinde saflık modları öncelik. 45 psi kılıf basıncı ile, genellikle yukarı 300-500 olaylar / s, sürekli yavaş akış kullanın. </li><li> Yolluk kullanarak, SSC vs FCS çizimi ile ölü hücreleri ve hücre içi enkaz (düşük FCS ve yüksek SSC) ayırt. PI-H (çiftli aynı H-değere sahip olacaktır vs canlı hücreler bir FSC-W FSC-H arsa vs ve PI W tarafından takip SSC-Genişlik (W) vs SSC-Boy (H) çizerek çiftleri ayırt ama daha büyük W-değer). canlı tek hücrelerin hücrelerin DNA içeriğini temsil eden PI-Alan (A) yoğunluk histogramı çizin. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, G1 ve S evreye kriteri hücreleri,. S Yolluk genişliğinde ve G1 yolluk dar ve bildiğim kadarıyla S mümkün olduğunca gerekirken, G1 ve G2 fazları davetsiz gerekir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55157/55157fig1.jpg" /> Şekil 1. Hücre döngüsü faz belirleme PI yoğunluğuna göre. fare embriyonik fibroblast (MEF) nüfusun (PI-Alan ile ölçülen) hücresel DNA içeriğinin dağılımını gösteren histogram. Işaretlenmiş bölgeleri kullanılarak, 4N DNA muhtevasına) - DNA içeriği, iki alt-popülasyonları i) G1 hücreleri (2N DNA içeriği) ve ii) S fazı hücreleri (2N içine nüfus sıralamak için kullanılmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55157/55157fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> NOT: G1 hücreleri toplanması amacı farklı genomik bölgeler arasında sıralama verimliliği önyargıları hesaba etmektir. Alternatif uygulamaRoach, aynı hücre tipinden G1 tutuklandı hücreleri kullanmaktır. Bu yaklaşım temizleyici sonuçlar verir (o S fazı kontaminasyonu minimize beri) ama tutuklandı hücreleri ve ölçülen hücreler arasındaki genetik farklılıklardan kaynaklanan önyargıları tanıtmak olabilir. <ol start="5"><li> soğuk koşullarda sıralama ve 1.5 / 2 ml tüpler içine sıralanan hücreleri toplamak. sıralama aşağıdaki buz üzerinde tüpler tutun. Not: 4 ° C&#39;de 18 ° C&#39;de 3 saat - 1 -% 5 BSA, DNA kurtarma geliştirmek için, düşük bağlanma tüpleri kullanmak için ya da 4 ile kaplanmış tüpler kullanımı daha iyidir. </li></ol> 5. DNA Saflaştırma <ol><li> Her bir örnek (G1 ve G) için bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak. Not: ticari kit kullanılarak üreticinin tavsiye ettiği gibi, yüksek verim için 2 ml tüp içine 400 uL yıkama tamponu ile yıkayın. </li><li> fluorometreyle DNA konsantrasyonu kontrol edin. NOT: FACS tarafından toplanan 100.000 memeli hücrelerden, bir DNA ~ 1 mikrogram almalısınız. birt Bu aşamada DNA 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;de birkaç gün muhafaza edilebilir. </li></ol> 6. Sonication <ol><li> kullanılan manyetik standı ile uyumlu olan bir 1.7 mL tüp içine DNA transferi. </li><li> manyetik bir stand kullanılarak üreticinin talimatlarına göre 2x SPRI boncuklar kullanılarak DNA Konsantre ve 50 uL yıkama tamponu içinde elüte. </li><li> 250 bp bir ortalama hedef pik boyutuna odaklanmış ultrasonikatör yamultma DNA. 50 uL DNA örneği için aşağıdaki ayarları kullanın: 50 W,% 20 Duty faktörü, patlama başına 200 Cycles, 20 ° C, 120 s. </li><li> elektroforez ile kesilmiş DNA boyutunu kontrol edin. ~ 250 bp bir zirve ile 700 bp - önerilen boyut dağılımı 200. NOT: Bu aşama, DNA, 4 ° C&#39;de veya uzun depolama için -20 ° C&#39;da bir kaç gün için muhafaza edilir ve bu da. </li></ol> 7. Kütüphane Hazırlık ve Sıralama NOT: farklı Birçok kütüphane hazırlık setleri veent sıralama platformları malzemeler bölümünde bizim tarafımızdan kullanılan ve söz konusu olanları benzer şekilde çalışması gerekir. Aslında, geçmişte, Tanımı harita mikrodizi platformları 2 ile çok benzer bir metot kullanılarak elde edildi. <ol><li> herhangi bir ticari kütüphane hazırlık kiti kullanılarak kütüphaneleri hazırlayın. </li><li> 800 bp - kütüphane hazırlık sonunda, 300 manyetik boncuklar kullanılarak boyutunu seçin. </li><li> kütüphaneler hazırladıktan sonra, fluorometreyle DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> elektroforezi kullanılarak DNA boyutunu ölçmek. </li><li> Herhangi bir platformda sıralama yapın. Not: Ardışık en az 10 m önerilir numune başına okur. Bu derinlik okuma yaklaşık her 300 bp (3 ~ için Gb boyutu genomu) eşdeğerdir ve 50 çözünürlükte Tanımı ölçümleri için yeterlidir - 100 kb. pencere boyutunda bir azalmaya neden olur derinliği artırılması ve böylece daha yüksek bir kesinlikle çözünürlüğünü artırma sağlayacaktır. Eşli uç sıralama gerekli değildirSadece kapsama bilgi beri bu protokol toplanır. Ancak, tekrar eden diziler içeren okur yerini çözümünde yardımcı olabilir. </li></ol> 8. Analiz NOT: Veri analizi A. Koren ve arkadaşları tarafından kullanılan yönteme dayanmaktadır. 19. <ol><li> bowtie2 ya da herhangi bir güvenilir kısa okumak hizalama kullanılarak ilgili genom Harita dizi verileri. değişen boyutu, 200 kapsamına giren kesimlerine eşit kapsama kromozomal pencereler G1 fraksiyonunda okur tanımlayın ve saymak S fazı aynı pencerelerde okur. </li><li> her pencere için S / G1 oranını hesaplayın. Bu genom (Şekil 3) boyunca S / G1 oranında büyük dalgalanmalar bir harita oluştursun. Tanımı ölçümlerin güvenilirliği için iyi bir denetim çok düz olmalıdır (G1 iki ayrı ölçümlerinden) G1 / G1 oranına Bu haritayı karşılaştırmaktır. </li><li> 0 veriler ortalama normalleştirmek ve her v çıkarılarak 1 SD(X kromozomu hariç) ve tüm pencereleri S / G1 standart sapma ile sonuçları bölünmesi tüm pencerelerin ortalama değerini Alue. Bu z skorları dönüştürmek ve farklı deneyler arasında karşılaştırma sağlamak amacıyla yapılır. </li><li> UCSC genom tarayıcısı yanı sıra 15&#39;den az veri pencereler içeren kalan her arası boşluk fragmanı listelenen tüm boşluk bölgeleri çıkarın. </li><li> 10 bir parametre ile Matlab fonksiyonu csaps üzerinden kübik yumuşatma eğri kalan parçaları Düzgün - 16 ve ayar noktaları her 100 kb enterpolasyon. NOT: yumuşatma ve interpolasyon parametreleri veri derinliğine göre ayarlanmalıdır. Diğer uygun düzeltme yöntemleri ve işlevleri vardır ve kullanılabilir. </li><li> görsel olarak her çoğaltmak güvenilirliğini onayladıktan sonra, tüm okur birleştirme ve bu verilere yukarıda açıklanan aynı işlemi gerçekleştirerek daha derin bir çözünürlük profili hesaplar. </li></ol>

<ol><li>Farkash-Amar, S., Simon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+the+replication+program+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of the replication program in mammals.</a> Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).</li>
<li>Yaffe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+DNA+replication+timing+reveals+conserved+large-scale+chromosomal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture.</a> PLoS Genet. 6 (7), e1001011(2010).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), (2008).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Farkash-Amar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+organization+of+replication+time+zones+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Global organization of replication time zones of the mouse genome.</a> Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).</li>
<li>Koren, A., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+replication+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Random replication of the inactive X chromosome.</a> Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+genome-wide+profiling+in+human+primary+erythroblasts+reveal+replication+program+organization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization.</a> PLoS Genet. 10 (5), e1004319(2014).</li>
<li>McNairn, A. J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+replication%3A+linking+epigenetics+to+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication.</a> Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Kenigsberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutation+spectrum+in+genomic+late+replication+domains+shapes+mammalian+GC+content%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content.</a> Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).</li>
<li>Woo, Y. H., Li, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+selection+shape+the+landscape+of+nucleotide+variation+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes.</a> Nat Commun. 3, 1004(2012).</li>
<li>Liu, L., De, S., Michor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+and+higher-order+nuclear+organization+determine+single-nucleotide+substitution+patterns+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes.</a> Nat Commun. 4, 1502(2013).</li>
<li>Goren, A., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicating+by+the+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicating by the clock.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).</li>
<li>Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+DNA+replication+time+zones+by+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization.</a> EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).</li>
<li>Smith, L., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replicating+timing+combined+with+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (70), e4400(2012).</li>
<li>Simon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchronous+replication+of+imprinted+genes+is+established+in+the+gametes+and+maintained+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development.</a> Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).</li>
<li>Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US5232828">Coating agents for cell recovery.</a> Google Patents. , (1993).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

CNR-Tanımı (Rhind N. ve Gilbert DM 20 tarafından incelenmiştir) S FACS ve G1 aşamaları ile ayrılabilir bir ökaryotik proliferatif hücre popülasyonu ilke olarak gerçekleştirilebilir. Burada tarif edilen yöntem, insan ve fare gibi ~ 3 Gb bir genom boyutuna sahip memeli hücrelerine ayarlanmıştır. (Hücre hazırlama ve dizileme derinliğinde) CNR-tor protokol küçük değişiklikler ökaryotlarda için ayarlamak için, ihtiyaç vardır. bu hız sınırlayıcı bir adımdır çünkü Dikkat S fazı hücrelerinin yeterli mikt...

Memeli DNA replikasyonu, hücre döngüsü sırasında tam olarak bir kez her kromozomun tam çoğaltma sağlamak için sıkıca düzenlenir. Çoğaltma oldukça düzenlenmiş sıraya göre gerçekleşir - Birden fazla büyük genomik bölgeler (~ Mb) diğer genomik bölgelerde orta ya da geç S fazı (orta ve geç kopyalayan etki) daha sonra çoğaltmak ise 1 (erken etki kopyalayan) S fazına başında çoğaltırlar. Genomun 50%, kanser dönüşüm 5 içinde farklılaşması 3, 4 sırasında ve daha az bir ölçüde, dokular 2 arasındaki ToR&#39;u bilgileri - genomunun en% 30 ise, tüm dokulardan (yapıcı Tanımı etki) aynı anda çoğaltır . Ayrıca, bazı genomik bölge senkronize olmayan bir 6, 7, 8, yani bir fark vardır çoğaltmaiki allel arasındaki Tanımında. Tanımı transkripsiyon seviyeleri, GC içeriği, kromatin durum, genin yoğunluk, vb 1, 9 da dahil olmak üzere pek çok genomik ve Epigenomik özellikleri ile ilişkilidir. Tanımı mutasyon oranları ve tip 10, 11 ve bu nedenle şaşırtıcı olmayan ilişkili, çoğaltma programı pertürbasyonlar kanseri 12, 13 ile bağlantılıdır. Şartname ve kromatin yapısı arasındaki nedensel ilişki henüz anlaşılamamıştır. Açık kromatin erken çoğaltma kolaylaştırır mümkündür. Bununla birlikte, alternatif bir model, 14 kromatin çoğaltma sırasında bir araya getirilen ve farklı bir kromatin başlangıçta mevcut düzenleyiciler ve S fazında kurşun ucu erken ve geç replike bölgeleri 1 ambalajını diferansiyel düşündürmektedir </sup&gt;. Son zamanlarda Tanımı genomik bölgelerden 11 oluşur mutasyon tipini etkileyerek GC içeriğine şekiller göstermiştir. In situ hibridizasyon (FISH) floresan bağımsız lokuslar Tor ölçmek için ana yöntem. Tek FISH sinyallerini genel belirli bir alel 15, 16 çifti arasında bir yüzdesini sergiler S fazı hücrelerin yüzdesi sayarak basit gerçekleştirilir. Alternatif bir yöntem, S boyunca çoklu zaman noktaları DNA içeriğine göre olan hücreler, sıralama BrdU DNA etiketleme BrdU içeren DNA immüno-çökeltilmesinin ve qPCR 17, çökelen DNA bolluk kontrol darbe oluşur. Genomik Tanımı eşleme iki yöntemle elde edilebilir. İlk yöntem, yukarıda tarif edilen BrdU-IP tabanlı yöntemin genomik versiyonu olduğu bir miktarının ölçümüHer fraksiyonda Çökelen DNA mikrodizilerinin melezleştirme yoluyla tüm genom ya da derin dizilemesi ile eş zamanlı olarak yapılır. İkinci yöntem, CNR-tor G1 hücrelerdeki DNA içeriği ile S fazı hücreleri ve normalize her genomik bölgenin kopya sayısını ölçülmesi esasına dayanır. Bu yöntemde, hücreler, replike olmayan (G1 fazı) ve replike (S fazı) grupları (Şekil 1) içine FACS ile sıralanır. G1 Hücreler tüm genomik bölgelerde aynı kopya sayısını ve böylece onların DNA içeriği aynı olmalıdır. Öte yandan, S DNA kopya sayısı Geç replike bölgeleri dolayısıyla DNA içeriği olacak hücrelerin çoğunda yapılmamış tekrarlanıp değil ise, erken replike bölgeler çok hücre replikasyonu yapılmış ve bu nedenle DNA içeriği iki olduğundan, Şartname bağlıdır G1 hücre edilene benzer. Bu nedenle DNA içeriği G1 oranı S Şartname göstergesidir. Her bir genomik bölge için DNA miktarı ile hibridizasyon yoluyla ölçülürmikroarrayler veya derin sıralama 2, 8 ile. CNR-Şartname yöntemin avantajları daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır. Şekil 2&#39;de tarif edildiği gibi, kağıt genomik Tanımı eşleme CNR-tor yöntemi tarif etmektedir. Kağıt sonuçlarının temel analiz ve genomik Şartname haritalarının oluşturulması kadar hücrelerin toplanması kadar tüm sürecin ince ayrıntıları anlatılır. Bu yazıda anlatılan protokol başarıyla kültüründe yetişen çeşitli hücre tipleri üzerinde yapılmıştır. Bu protokolün gelecek iyileştirmeler in vivo ToR&#39;un haritalama ve nadir hücre tiplerinde yol açabilir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>BI (Biyolojik Endüstriler)</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>BI (Biyolojik Endüstriler)</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polistiren yuvarlak Hücre süzgeç kapaklı alt tüp&nbsp;</td><td>BD-Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Gadot</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-A 10 mg / mL</td><td>Sigma</td><td>R4875</td><td></td></tr><tr><td>Propidiom iyodür 1 mg / mL</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td>Parafilm PM-996</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tüpleri ve nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL MaxyClear tüp&nbsp;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Boncuklar - Agencourt AMPure XP&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonikatör</td><td>Covaris</td><td>M serisi & nbsp; -530092</td><td></td></tr><tr><td>50 & mikro; L microTUBE AFA Fiber Vidalı Kapak 6 x 16 mm</td><td>Covaris</td><td>520096</td><td></td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Yüksek Hassasiyet (HS) Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez 2200 Teyp istasyonu sistemi</td><td>Agilent</td><td>D1000 ScreenTape</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama - Illumina NextSeq sistemi</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>DNA saflaştırması için Dneasy kiti</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PureProteom Manyetik Stand</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BrdU/FITC</td><td>DAKO</td><td>F7210</td><td></td></tr><tr><td>FACS sıralayıcı</td><td>BD</td><td>FACSARIA III</td><td></td></tr><tr><td>FACS yazılımı</td><td>BD</td><td>FACSDiva v 8.0.1</td><td></td></tr></tbody></table>

dna İçerik Ölçüm tarafından memeli Çoğaltma zamanlama genom tayini

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

genomun replikasyonu, DNA kopyalama doğruluğunu sağlayan bir yüksek ölçüde düzenlenmiş bir işlemde, hücre döngüsünün S fazında oluşur. Her genomik bölge çoğaltma birden kökenleri eşzamanlı aktivasyonu yoluyla S fazında belirgin bir anda çoğaltılır. çoğaltma (İş Tanımı) Zaman birçok genomik ve epigenetik özellikleri ile ilişkilidir ve mutasyon oranları ve kanser ile bağlantılıdır. Sağlıkta ve hastalıkta, çoğaltma programın tam genomik görünümü kavramak önemli bir gelecek hedefi ve mücadeledir. , Memeli hücrelerinin genomu geniş Tanımı eşleştirmek için basit bir yaklaşım: Bu makalede ayrıntılı olarak (CNR-İş Tanımı burada denir) yöntemini &quot;Çoğaltma genomik Zaman haritalama için S / G1 Kopya sayısı Oranı&quot; açıklar. yöntem S fazı hücreleri ve G1 faz hücreleri arasındaki kopya sayısı farklılıklara dayanmaktadır. CNR-tor yöntemi 6 adımda gerçekleştirilir: propidyum iyodür (PI) hücre ve boyama hazırlanması 1.; 2. Sorting G1 ve sıralama floresan aktive hücre kullanılarak S fazı hücreleri (FACS); 3. DNA saflaştırılması; 4. Sonication; 5. Kütüphane hazırlık ve sıralama; ve 6. Biyoinformatik analizi. CNR-Şartname yöntemi ayrıntılı çoğaltma haritalarda sonuçlanan hızlı ve kolay bir yaklaşımdır.

Tipik Tanımı harita fare embriyonik fibroblastlar için Şekil 3 (MEF&#39;ler) &#39;de gösterilmiştir. gösterir çünkü bu rakam analiz sürecini gösteren bireysel pencereler (adım 8.3) için normalize S / G1 oranı olan noktalar, yanı sıra kübik yumuşatma ve enterpolasyon (adım 8.5) sonucunda oluşan çizgidir. i) erken aynı anda (TO = sabit Tanımı bölgeler) çoğaltmak bir megabase sırasına göre büyük bölgeler (), orta...

Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Bu prosedürün genel amacı, seçilen bir hücrenin genom çapındaki replikasyon zamanlama programını haritalandırmaktır. Bu yöntem, replikasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, genomik replikasyon programının sağlıklı durumlarda ve hastalıklarda nasıl değiştiği gibi.Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli hücrelerde ve koşullarda replikasyon zamanlamasını haritalamak için hızlı ve basit bir yol sunmasıdır. Protokolü yazan kişi, Tıp Fakültesi'nde bir FACS uzmanı olan Dan Lehmann'dır. Bu prosedür genellikle en az 1-2 × 10⁶ hızlı büyüyen senkronize edilmemiş hücre ile başlar.Adheran hücreler için, her plakayı kalsiyum ve magnezyum içermeyen üç mililitre PBS ile aspire edin ve yıkayın. PBS'yi dökün ve her plakaya bir mililitre ticari Trypsin-EDTA ekleyin. Hücreler ayrılana kadar 37 °C'de beş dakika inkübe edin.Tripsini nötralize etmek için üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe veya beş mililitrelik polistiren tüpe toplayın. Hücreleri buz üzerinde tutun. Bu prosedüre başlamak için, hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 300 x G'de santrifüjleyin.Hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile aspire edin ve yıkayın. Ardından hücreleri santrifüjleyin. İkinci yıkamanın ardından PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri 250 mikrolitre soğuk PBS içinde yeniden süspande edin.Tüpü hafifçe vortekslerken, -20 °C sıcaklıktaki %100 yüksek saflıktaki etanolden 800 µL yavaşça damla damla ekleyin. Bu işlem, nihai etanol konsantrasyonunun %70 ila %80 olmasını sağlar. Hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Bu prosedüre, fikse edilmiş hücreleri 4 °C'de on dakika boyunca 500 x G'de santrifüj ederek başlayın. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama sonrası çöktürme işlemi yapın.İkinci yıkamadan sonra süpernatanı aspire edin ve her hücreyi şu PI karışımı ile yeniden süspande edin: beş mikrolitre on miligram/mililitre RNAaz ve 50 mikrolitre bir miligram/mililitre propidyum iyodür içeren bir mililitre PBS. Örneği 35 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek 5 mililitrelik bir polistiren tüpe filtreleyin.Tüpü parafilm ile mühürleyin. Oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin. Propidyum iyodür ışığa duyarlı olduğu için örnekleri karanlıkta tutun.Hücreler bir FACS cihazı kullanılarak ayrılacaktır. Hücreleri propidyum iyodür yoğunluklarına göre ayırt etmek için 561 nanometre lazeri kullanın. En iyi sonuçlar için, ilgili hücre boyutu için önerilen en küçük nozulu kullanın.Çoğu hücre için bu değer 85 micrometers'dır. Sabit ve yavaş bir akış kullanın. Genellikle saniyede 300 ile 500 olaya kadar olan değerler kullanılır.Gating kullanarak, FCS'ye karşı SSC çizerek ölü hücreleri ve hücre altı kalıntıları ayırt edin. Canlı hücreler arasından, önce SSC genişliğine karşı SSC yüksekliğini, ardından FFC genişliğine karşı FFC yüksekliğini ve propidium iodide genişliğine karşı propidium iodide yüksekliğini çizerek dubletleri ayırt edin. Canlı sinyal hücreleri için, hücrelerin DNA içeriğini temsil eden propidium iodide alan yoğunluğunun bir histogramını çizin.Hücreleri soğuk koşullar altında G1 ve S fazlarına göre ayırın. S fazı için kapılama geniş olmalı ve G1 ile G2 fazlarına taşmalıdır. G1 kapılaması ise dar olmalı ve S fazından mümkün olduğunca uzak tutulmalıdır.Bazı hücre tipleri için, uygun bir hücre döngüsü dağılımı elde etmek zor olabilir. S fazı hücreleri olmadan G1 fazını almak en kritik noktadır. Sıralanmış hücrelerin bulunduğu tüpleri fax makinesinden çıkarın.Sıralama işleminden sonra tüpleri buz üzerinde tutun. Hücre sıralamasını takiben, her örneğe ait DNA, üreticinin talimatları doğrultusunda ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır. Ardından, DNA'yı odaklanmış bir ultrasonikatör ile ortalama 250 baz çifti hedef pik boyutuna gelecek şekilde parçalayın.Fragmente DNA'nın boyutunu elektroforez ile doğrulayın. Önerilen boyut dağılımı, yaklaşık 250 baz çiftinde bir pik ile 200 ila 700 baz çifti arasındadır. Ardından, kütüphane metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanır, dizilenir ve analiz edilir.Fare embriyonik fibroblastlarından alınan tüm birinci kromozom için bir replikasyon zamanı haritası gösterilmektedir. Yaklaşık 50 megabaslık bir bölgeye daha yakından bakıldığında; noktalar, bireysel pencereler için normalize edilmiş S/G1 oranını, düz çizgi ise kübik yumuşatma ve interpolasyon sonuçlarını temsil etmektedir.Yüksek S/G1 değerleri erken replikasyona karşılık gelirken, düşük değerler geç replikasyona karşılık gelir. Kırmızı oklar sabit replikasyon zamanı bölgelerine, yeşil oklar ise zamansal geçiş bölgelerine işaret etmektedir. Bu şekil, fare kromozom birindeki aynı 18 megabazlık bölgede, fare pre-B hücrelerinin triplikalarıyla karşılaştırıldığında, fare embriyonik fibroblastlarının triplikaları arasındaki replikasyon zamanı haritalarının tekrarlanabilirliğini göstermektedir.Turuncu oklar, hücre hatları arasındaki diferansiyel bölgelere örnekleri göstermektedir. Altı örnek arasındaki spearman korelasyonlarının ısı haritası sonuçları daha da doğrulamaktadır. Hücrelerin toplanmasından haritaların oluşturulmasına kadar olan bu teknik, bir kez uzmanlaşıldığında ve doğru şekilde uygulandığında bir hafta içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, büyüyen hücreler için replikasyon zamanlaması genomik haritalarının nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

genome-wide-determination-mammalian-replication-timing-dna-content

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Akış Sitometresi ve yüksek işlem hacmi sıralama genom kopyası geç kopyalayan bölgeleri tanımlamak için birleştirme tekniği tarif.

G2-seq: geç genom bölgelerinde çoğaltma tanımlamak için bir yüksek işlem hacmi-dayandırılmış tekniği

İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

Metodoloji, nanopartiküllerin varlığında DNA replikasyon dinamiklerindeki varyasyonun analizine yardımcı olur. İlgilenilen malzemenin sitotoksisite seviyesine bağlı olarak farklı metodolojiler benimsenebilir. Ek olarak, DNA lifi analizine yardımcı olmak için görüntü analizinin bir açıklaması sağlanmıştır.

DNA Hasarını Araştırmak ve Nanopartiküllerin İndüklediği Onarım Dinamiklerini Araştırmak için DNA Fiber Testinin Gösterilmesi

Proteinle ilişkili yeni başlayan DNA'nın zenginlenmesi ve dizilenmesi (eSPAN), iki çoğalan DNA zincirinde kromatin ilişkili proteinin göreceli bolluğunu tespit etmek için geliştirildi ve böylece kromatin replikasyonu ve bağlı süreçler hakkında moleküler içgörüler ortaya çıktı. Bu protokol, maya ve fare embriyonik kök (ES) hücrelerinde eSPAN prosedürlerini tanımlar.

Proteinle İlgili Yeni DNA Zincirlerinin Zenginleştirilmesi ve Dizilenmesi Yoluyla Proteinlerin Zincire Özgü Analizi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Keşfedin, memeli hücrelerde genom çapında replikasyon zamanlaması haritalarını hızlı ve basit bir şekilde oluşturmak için CNR-ToR yöntemini. FACS ile S ve G1 faz hücrelerini ayırarak DNA içeriği farklarını analiz edin.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Daha fazla video keşfet