DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Bu prosedürün genel amacı, tercih edilen bir hücrenin genom çapında replikasyon zamanlama programını haritalamaktır. Bu yöntem, çoğaltma alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, genomik replikasyon programının sağlık ve hastalıkta nasıl değiştiği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, çeşitli hücrelerde ve koşullarda replikasyon zamanlamasını haritalamanın hızlı ve basit bir yolu olmasıdır. Faks prosedürünü yazan kişi, Tıp Fakültesi'nde faks uzmanı olan Dan Lehmann olacaktır. Bu prosedür genellikle en az bir ila iki kez, on ila altıncı hızlı büyüyen senkronize edilmemiş hücrelerle başlar.

Yapışık hücreler için, her plakayı magnezyum kalsiyumu olmadan üç mililitre PBS ile aspire edin ve yıkayın. PBS'yi atın ve her plakaya bir mililitre ticari Tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri, ayrılana kadar 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Tripsin'i nötralize etmek için üç mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik bir konik tüpte veya beş mililitrelik bir polistiren tüpte toplayın. Hücreleri buz üzerinde tutun. Başlamak içinprosedür, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x G'de santrifüjleyin.

Hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile aspire edin ve yıkayın. Ardından, hücreleri aşağı doğru döndürün. İkinci yıkamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve hücreleri 250 mikrolitre soğuk PBS'de yeniden süspanse edin.

Tüpü nazikçe girdaplarken, yavaşça 800 mikrolitre eksi 20 santigrat derece, yüzde 100 yüksek saflıkta etanol ekleyin. Bu, nihai etanol konsantrasyonumuzu yüzde 70 ila 80'e götürür. Hücreleri 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Bu prosedüre, sabit hücreleri 500 x G'de 4 santigrat derecede on dakika santrifüjleyerek başlayın. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri bir mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkamadan sonra aşağı doğru döndürün.

İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı aspire edin ve her hücreyi aşağıdaki PI karışımı ile yeniden süspanse edin. Mililitre RNAas başına beş mikrolitre on miligram ve mililitre propidyum iyodür başına 50 mikrolitre bir miligram içeren bir mililitre PBS. Numuneyi 35 mikrometrelik bir ağdan 5 mililitrelik bir polistiren tüpe süzün.

Tüpü parafilm ile kapatın. Oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin. Promidyum iyodür ışığa duyarlı olduğu için numuneleri karanlıkta tutun.

Hücreler bir faks makinesi kullanılarak sıralanacaktır. Hücreleri propidyum iyodür yoğunluğuna göre ayırt etmek için 561 nanometre lazeri kullanın. En iyi sonuçlar için, belirli hücre boyutu için önerilen en küçük nozulu kullanın.

Çoğu hücre için 85 mikrometredir. Sabit, yavaş bir akış kullanın. Genellikle saniyede 300 ila 500 olaya kadar.

Geçit kullanarak, FCS'yi SSC'ye karşı çizerek ölü hücreleri ve hücre altı kalıntıları ayırt edin. Canlı hücrelerden, SSC genişliğine karşı SSC yüksekliğini, ardından bir FFC genişliğine karşı FFC yükseklik grafiğini ve bir propidyum iyodür genişliğine karşı propidyum iyodür yükseklik grafiğini çizerek çiftleri ayırt edin. Canlı sinyal hücreleri için, hücrelerin DNA içeriğini temsil eden propidyum iyodür alan yoğunluğunun bir histogramını çizin.

Soğuk koşullardaki hücreleri G1 ve S fazlarına ayırın. S için geçit geniş olmalı ve G1 ve G2 fazlarına girmelidir. G1 kapısı ise dar ve S'den mümkün olduğunca uzak olmalıdır.

Gelecek hücre tipleri için, güzel bir hücre döngüsü dağılımı elde etmek zor olabilir. G1 fazını S fazı hücreleri olmadan almak çok kritiktir. Sıralanmış hücrelere sahip tüpleri faks makinesinden çıkarın.

Sıralamayı takiben tüpleri buz üzerinde tutun. Hücre tasnifinin ardından, her numune için DNA, üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır. Daha sonra, odaklanmış bir ultrasonicator ile DNA'yı 250 baz çiftinin ortalama hedef tepe boyutuna getirin.

Elektroforez ile saf DNA'nın boyutunu doğrulayın. Önerilen boyut dağılımı 200 ila 700 baz çiftidir ve tepe noktası yaklaşık 250 baz çiftidir. Daha sonra, kitaplık metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanır, sıralanır ve analiz edilir.

Fare embriyonik fibroblastlarından alınan tüm kromozom için bir replikasyon zamanı haritası gösterilmiştir. Yaklaşık 50 megabazlık bir bölgeye daha yakından bakarak. Noktalar, tek tek pencereler için normalleştirilmiş S - G1 oranını temsil eder ve düz çizgi, kübik düzgün ve enterpolasyondan elde edilen sonuçları temsil eder.

Yüksek S ila G1 değerleri erken replikasyona karşılık gelirken, düşük değerler geç replikasyona karşılık gelir. Kırmızı oklar, çoğaltma bölgelerinin sabit zamanlı örneklerini, yeşil oklar ise zamansal geçiş bölgelerini gösterir. Bu şekil, fare embriyonik fibroblastlarının üçlüleri arasındaki replikasyon haritalarının zamanının tekrarlanabilirliğini, fare kromozomu üzerindeki aynı 18 megabaz bölgesindeki fare pre-B hücrelerinin üçlülerine kıyasla göstermektedir.

Turuncu oklar, hücre çizgileri arasındaki diferansiyel bölgelerin örneklerine işaret eder. Altı örnek arasındaki mızrakçı korelasyonlarının bir ısı haritası, sonuçları daha da doğrulamaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, hücrelerin toplanmasından haritaların oluşturulmasına kadar olan bu teknik, uygun şekilde uygulanırsa bir hafta içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, büyüyen hücreler için replikasyon zamanı genomik haritalarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.