İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Bu prosedürün genel amacı, birden çok proteinin eş zamanlı olarak eksprese edilmesi için indüklenebilir bir T7 RNA polimeraz kontrolü altında çok genli sentetik operonlar oluşturmaktır. Bu yöntem, sentetik biyoloji ve biyokimya alanındaki araştırmacıların çok proteinli yolaklar kurmalarına veya çoklu ekspresyon yaklaşımlarına bağımlı olan protein komplekslerini incelemelerine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, Escherichia coli bünyesinde birden fazla genin tek bir plazmitten eş zamanlı olarak eksprese edilmesine olanak tanımasıdır.

Laboratuvarımdaki prosedürü, doktora öğrencisi Mohamed Hassan ve stajyer öğrenci Angela Thompson uygulamalı olarak gösterecekler. Metin protokolüne uygun olarak ilgilenilen genler elde edilip amplifiye edildikten sonra, ilk ilgilenilen gen ve pMGX faktörü için sindirim reaksiyonlarını hazırlayın. İndel enzimi içerisine, 0.5 ile 1.5 µg DNA içeren 40 µL'lik bir reaksiyon kullanın.

Reaksiyonları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından EcoRI ekleyin ve sindirimin bir saat daha sürmesine izin verin. Etkili bir sindirim sağlandığından emin olmak için EcoRI'dan önce NdeI eklenir.

NdeI, restriksiyon bölgesinin her iki yanındaki çift zincirli DNA uzunluğuna karşı duyarlıdır. Önce bunun eklenmesi, tam uzunluktaki dairesel plazmidin kesilmesini sağlar. Sindirim reaksiyonlarını %0,7'lik agaroz jeli üzerine yükleyin ve örnekleri 100 volt üzerinde 55 dakika boyunca elektroforezleyin.

Ardından, temiz bir skapel veya jilet yardımıyla insert ve vektör bantlarını kesin ve kesilen jel segmentlerini 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. DNA'yı saflaştırmak için metot protokolüne uygun olarak bir jel ekstraksiyon kiti kullanın. 0,15 ile 0,5 mikrogram arasında vektör DNA'sı, genin boyutuna göre uygun miktarda insert ve bir mikrolitre T4 DNA ligaz içeren 20 mikrolitrelik bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın.

Aseptik koşullar altında, kimyasal olarak kompetan XL1-Blue E.coli hücrelerinin 100 µL'lik alikotlarını buz üzerinde beş dakika boyunca çözünürün. Ardından, hücrelere ilgilenilen bir geni içeren ligasyon reaksiyonlarından beş µL ekleyin. Transformasyonları buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, hücreleri 42 °C'lik bir su banyosunda 45 saniye boyunca ısı şokuna tabi tutun. Daha sonra, transformasyonları buz üzerine yerleştirin ve 200 µL soğuk LB besiyeri ekleyin. Hücreleri iki dakika boyunca inkübe edin.

Hücreleri 37 °C'de, dakikada 220 rotasyonla bir saat boyunca inkübe edin ve 100 µL'yi uygun bir seçilebilir marker içeren LB agar plaklarına yayın. Olası transformantlar için kolonileri taramak amacıyla, negatif kontrol plaklarındaki koloni sayısını ligasyon plaklarındakilerle karşılaştırın. Bir e iki oranında bir koloni sayımı oranı istenir.

Her bir ligasyon reaksiyonundan, uygun antibiyotikli 4 mililitre LB besiyerini inoküle etmek için dört ila sekiz adet tekil koloni seçin. Kültürleri 37 °C'de ve dakikada 220 rotasyon hızında gece boyunca inkübe edin. Plazmid DNA izolasyon kiti ile plazmid DNA'yı metin protokolüne göre saflaştırın ve birer mikrolitre NdeI ve EcoRI kullanarak, 150 ila 500 nanogram DNA içeren 20 mikrolitrelik sindirim reaksiyonları hazırlayın.

Sindirimi reaksiyonlarını 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Gen bir'i içeren pMGX vektörüne gen iki'yi yerleştirmek için; ilgilenilen ilk geni içeren 0.5 ile 1.5 µg vektör DNA'sı ve 1 µL AVR2 içeren 40 µL'lik bir sindirim reaksiyonu hazırlayın. Reaksiyonu, 1.5 µL Calf-intestinal phosphatase eklemeden önce 37 °C'de 1.5 saat boyunca inkübe edin.

30 dakika daha inkübe edin. Ardından, ilgi duyulan ikinci geni içeren 0,5 ila 1,5 µg pMGX vektörü içeren 40 µL'lik bir sindirim reaksiyonu hazırlayın. Bunun için 1 µL AVR2 ve xpol kullanın.

Reaksiyonu 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Restriksiyon sindirimlerini %0,7'lik agaroz jelde elektroforez yapın. Daha önce gösterildiği gibi, insert ve vektör bantlarını kesip çıkarmak için temiz bir skalpel veya jilet kullanın.

Plazmid DNA'yı ekstre edip örneği metin protokolüne göre nicelleştirdikten sonra, gen 2 ve pMGX-yfg1 için 3:1 insert/vektör oranında bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Sadece pMGX-yfg1 içeren bir negatif kontrol ekleyin. Daha önce gösterildiği gibi, her reaksiyondan beş mikrolitreyi XL1-Blue hücrelerine transforme edin.

Ardından negatif kontrol ve ligasyon plaklarındaki koloni sayılarını karşılaştırın. Negatif kontrol plağında çok sayıda koloni varsa, CIP işlemini gözden geçirin. Ligasyon reaksiyonundan dört ila sekiz adet münferit koloni seçin ve her bir koloniyi dört mikrolitre LB artı uygun antibiyotik ile inoküle etmek için kullanın.

37 °C'de ve dakikada 220 devirle gece boyunca büyütün. Plazmid DNA'yı daha önce olduğu gibi izole edip miktarını belirledikten sonra, 150 ila 500 ng DNA ve 1 µL EcoRI içeren bir sindirim reaksiyonu kurarak ikinci genin etkili şekilde insersiyonu için tarama yapın. Reaksiyonları 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Tarama amaçları için EcoRI önerilir ancak bazı durumlarda EcoRI, jel üzerinde ayırt edilmesi zor olan ve boyutları benzer iki veya daha fazla insert oluşturabilir. Başarıyı garanti altına almak için NdeI gibi alternatif bir restriksiyon sindirim enzimi kullanılmalıdır. Sindirim reaksiyonlarını bir agaroz jel üzerinde ayırarak, yerleştirilen gen 2'nin boyutuna karşılık gelen bir bant arayınız.

Metin protokolüne göre plazmide ek genler klonlayın. Policistronik plazmidi oluşturmak için, beş gen önce uygun bir plazmit olan pMGX A'ya klonlanmıştır. Bu şekil; pCR-Blunt-yfg1 ve pCR-Blunt-yfg2'nin pMGX A plazmitini ile indel ve EcoRI ile sindirilmiş pMGX A'yı göstermektedir. İlk iki geni pMGX A'ya klonlamak için, plazmit indel ve EcoRI ile sindirilmiştir.

Klonlamadan sonra, başarılı klonların elde edildiğini doğrulamak için pMGX-yfg1 ve pMGX-yfg2, AVR2 ve xpol ile sindirildi. Bu şekil, AVR2 ile sindirilmiş pMGXyfg1 vektörünü ve ikinci ilgi odağı genini izole etmek için AVR2 ve xpol ile sindirilmiş pMGX-yfg2 vektörünü göstermektedir. Elde edilen insert, pMGX-yfg1 iki vektörünü oluşturmak için pMGX-yfg1'e klonlandı.

Burada görüldüğü gibi, pMGX-yfg1'in EcoRI ile sindirimi, iki numaralı ilgi çekici genin pMGX-yfg1'e başarılı bir şekilde klonlandığını doğrulamıştır. Bu jel görüntüsü, ekini doğru yönde veya ters yönde taşıyan sindirilmiş plazmidler arasındaki farkı göstermektedir. Ters yöndeki bir ek, birbirine yakın konumda iki EcoRI bölgesi oluşturarak, sonuç olarak ortaya çıkan 50 baz çiftlik fragmanların jelde saptanamamasına ve omurganın daha büyük görünmesine neden olur.

Son olarak, beş genli polisistronik bir ekspresyon vektörü oluşturulduktan sonra, eksprese edilen proteinlerin western blot analizi, beş proteinin de tek bir vektörden eksprese edildiğini doğrular. yfg5 tarafından üretilen proteinin yfg1 ile aynı boyutta olduğuna ve jel üzerinde ayrılmadığına dikkat edin. Bu teknikte uzmanlaşıldığında ve işlem doğru şekilde yürütüldüğünde, pMGX iskeletine yerleştirilen her bir gen için süreç üç veya dört günde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, vektörü beşli vektörü defosforile etmek için Calf-intestinal phosphatase gibi bir fosfataz ile işlemenin ve lineerleştirmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, doğal ürünlerin üretimi için biyosentetik yolları karakterize etmek ve kullanmak veya protein-protein komplekslerini incelemek amacıyla in vivo çoklu gen ekspresyonu gibi ileri deneyler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, sentetik biyoloji alanındaki araştırmacıların karmaşık karbonhidratlar ve genetik olarak mühendisliği yapılmış E.Coli üretmelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, E.coli'de çoklu gen ekspresyon sisteminin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.