Name: İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Keşfedin, indüklenebilir T7 RNA polimeraz aracılı çok boyutlu ifade sistemini Escherichia coli'de çoklu gen eşzamanlı ifadesi için. Bu yöntem sentetik biyoloji ve biyokimya araştırmalarında protein komplekslerinin çalışılmasını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.

1. İlgi Genleri Almak <ol><li> Sentetik genleri tasarla. <ol><li> E. coli ekspresyonu için bir gen dizilimi optimize edin. </li><li> Seksten herhangi bir problemli kısıtlama yerini (AvrII, NdeI, EcoRI ve XbaI) çıkarın. </li><li> Klonlama için kısıtlama alanlarını ekleyin; Bir 5&#39;-NdeI bölgesi ve bir 3&#39;-EcoRI bölgesi önerilmektedir. Gerekirse başka siteler de kullanılabilir; Seçilen plazmitin çoklu klonlama bölgesine ( Şekil S1- S4 ) bakın. İsterseniz, Western blot algılaması için 5 &#39;veya 3&#39; kodlama etiketi ekleyin. </li><li> Tasarlanan geni ticari olarak sipariş edin. </li><li> Ya üreticinin talimatlarına göre geni kör bir klonlama kiti kullanarak künt bir vektöre köreltin; Geni yükseltmek için primerleri tasarımlayın (ardından Adım 1.2.2&#39;ye geçin); Veya bir pMGX plazmidine direkt klonlama için ek 5 &#39;ve 3&#39; uçları ekleyin ve Adım 2&#39;ye geçin.Temsilci sonuçlar ilgi genlerini kör bir klonlamaya dayanır. </li></ol></li><li> İstenilen geni (tasarımlanmış ve optimize edilmiş sentetik gen veya istenen geni içeren şablon DNA&#39;dan) amplifiye edin 15 . <ol><li> Klonlama için kısıtlama alanları olan tasarım primerleri; Bir 5&#39;-NdeI bölgesi ve bir 3&#39;-EcoRI bölgesi önerilmektedir. Gerekirse başka siteler de kullanılabilir; Seçilen plazmitin çoklu klonlama bölgesine ( Şekil S1- S4 ) bakın. İsterseniz, Western blot algılaması için 5 &#39;veya 3&#39; kodlama etiketi ekleyin. </li><li> PCR istenen geni çoğaltın 15 . </li><li> PCR&#39;ı agaroz jel elektroforezi ile analiz edin 16 . </li><li> Belirgin olmayan bir amplifikasyon varsa, genleştirilen geni jel özütleme ile temizleyin. Değilse, bir enzim temizleme kiti kullanın. </li><li> Bir spektrofotometre kullanarak DNA&#39;yı absorbanc&#39;ı kontrol ederek ölçünE 260 nm&#39;de; Elüsyon tamponlu boş 17 . </li></ol></li></ol> 2. İlgi Genleri Bir Multigen Ekspresyon Sistemi Vektörüne Klonlama, pMGX 18 <ol><li> Kısıtlama, elde edilen geni ve istenen vektör olan pMGX&#39;yi NdeI ve EcoRI ile sindirir. NOT: Çok miktarda tekrar sirkülale edilmiş plazmid elde edilirse, EcoRI eklemeden önce NdeI reaksiyonunun 1 saat devam etmesine izin verin. <ol><li> 0.5-1.5 μg DNA ve uygun olan 10x tamponun 4 μL&#39;si ile her bir enzimden 1 uL içeren 40 uL&#39;lik bir sindirim reaksiyonu kullanın. </li><li> NdeI ve EcoRI sindirimi için EcoRI tamponu kullanın ve önce NdeI endonükleaz ekleyin. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca özümleyin. Ardından EcoRI endonükleaz ekleyin ve sindirimin bir saat daha ilerlemesine izin verin. NdeI, DNA&#39;nın sonuna yakın bölünmelere duyarlıdır, bu yüzden EcoRI&#39;nin ilk sindirimi NdeI&#39;nin etkili sindirimini önleyebilir. </li></ol></li><li> ElektrOphorese agaroz jel üzerindeki kısıtlama sindirimini (1 kb&#39;lik bir gen için, 55 dakika için 110 V&#39;da% 0,7 agaroz jel kullanın; farklı gen boyutları için agaroz jel yüzdesini seçmek için, referans 16&#39;ya bakın. </li><li> Temiz bir neşter veya bıçak bıçağı kullanarak ek parça ve vektör bantları tüketim yapın ve kesilen jel segmanını 1.5 mL tüp içine yerleştirin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı agaroz jelden ayıklayın. </li><li> İlgili geni pMGX vektörüne, 3: 1 insert-vektör oranı kullanarak ligate edin; Eklemesiz sindirilmiş pMGX negatif bir ligasyon ayarlayın. <ol><li> 1 μL T4 DNA ligaz, 0.15-0.5 μg vektör DNA&#39;sı (~ 5 μL) ve insertin uygun bir miktarda 3: 1 insert-to-vektör oranına ve boyutuna dayalı 20 μL ligasyon reaksiyonu oluşturun Gen eklenir; PMGX omurgaları boyutu 5,312 ile 5,504 bp arasındadır. Her şeyi içeren olumsuz bir kontrol reaksiyonu ekleyin.Gen eklendi. Vektör DNA miktarının negatif kontrol ligasyonunda ve vektör artı ligasyon reaksiyonlarında eşdeğer olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Ligasyon reaksiyonlarını, XL1-Blue kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerine ve ligandlı plazmidler pMGX- yfg1 (ilgi geni içeren), pMGX- yfg2 (ilgi geni içeren) ... pMGX- yfgn (ilgilenilen geni içeren n). Aseptik tekniği kullanın (biyogüvenlik kabininde veya alev altında). <ol><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde kimyasal olarak yetkili XL1-Blue E. coli 100 mcL alikotları çözülmüş ve sonra ligasyon reaksiyonları 5 mcL ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C&#39;de tutulan su banyosunda 45 saniye boyunca hücrelere ısı ile çarpın ve daha sonra 200 μL soğuk LB ekleyin. 2 dk buzda inkübe edin. </li><li> Hücreleri 1 saat boyunca 37 ° C, 220 rpm&#39;de çalkalayın ve daha sonra bir plakayı içeren bir LB-agar plakasına 100 ulPriate seçilebilir markeri (ya ampisilin ya da kanamisin). </li></ol></li><li> Pozitif transformantlar için klonları tarayın. <ol><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayılarını karşılaştırın. 1: 2&#39;den büyük bir koloni sayımı aralığı istenir. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 2.1&#39;e dönün ve notu gözden geçirin. </li><li> Tarama için eklenen farklı genlerin (1 n) her ligasyon tepkimesinden 4-8 bireysel koloni (negatif kontrol bağlı olarak: ligasyon oranı) seçin ve 4 mL LB ve uygun antibiyotik gece kültür / bireysel koloni inoküle edin. Gece boyunca 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de sallayarak kültürleri büyütün. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin. </li><li> 150-500 ng DNA ve her bir enzimden 1 uL uygun 10x tampon ile 2 μL içeren 20 uL NdeI + EcoRI sindirim reaksiyonu oluşturun. InciDurumda, ilgili genin sınırlama siteleri arasında olması için NdeI ve EcoRI&#39;yi ekleyin. Boş pMGX vektörü ile negatif bir kontrol önerilir. 37 ° C&#39;de 2 saat su banyosunda sindirin. </li></ol></li></ol> 3. Gen 2&#39;yi Gen 1 içeren pMGX Vektörüne Ekleme , pMGX- yfg1 <ol><li> Restriksiyon, pMGX-yfg1&#39;i AvrII ile sindirecek ve buzağı bağırsak fosfatazı (CIP) ile muamele edecektir . <ol><li> 0.5-1.5 μg vektör DNA&#39;sını (izole edilmiş DNA ~ 5-10 uL) ve uygun 10x tampon maddenin 4 uL&#39;si ile 1 μL AvrII içeren bir 40 μL sindirim reaksiyonu kullanın. 37 ° C&#39;de 1.5 saat sindirin ve sonra 1.5 μL CIP ekleyin. 30 dakika daha 37 ° C&#39;de bırakın. </li></ol></li><li> İlgili geni serbest bırakmak için AvrII ve Xbal ile kısıtlama pMGX-yfg2 sindirin . <ol><li> 0.5-1.5 μg DNA ve 1 μ içeren bir 40 μL sindirim reaksiyonu kullanın; Her bir enzimin L&#39;si, uygun 10x tamponun 4 uL&#39;si ile. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca özümleyin. </li></ol></li><li> Uygun bir yüzde (% 0.7) agaroz jeli üzerinde elektroforez kısıtlaması sindirilir ve temiz bir neşter / bıçak bıçağı kullanarak ekleme ve vektör bantlarını çıkarır (bkz. Adımlar 2.2-2.3). </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı ayıklayın ve DNA 17&#39;yi ölçün. </li><li> 3: 1 insert-vektör oranı kullanarak gen 2&#39;yi pMGX- yfgl&#39;e ligate edin . Sindirilmiş pMGX- yfg1&#39;in negatif bir bağlanmasını ilave ek olmadan yapın. Yukarıdaki gibi Adım 2.5&#39;te ayarlayın. </li><li> Bağlama reaksiyonlarının 5 μL&#39;sini XL1-Blue kimyasal olarak yetkili E. coli hücrelerine, ligandlı plazmidler pMGX- yfg1,2&#39;ye (ilgilenilen geni içeren 1 ve 2 geni) ve negatif pMGX- yfg1 kontrolüne, Adım 2.6&#39;da görüldüğü gibi çevirin . </li><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayısını karşılaştırın. Bir koloni sayı oranı gReaktan 1: 2&#39;den daha arzu edilir. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 3.1&#39;e dönün ve CIP tedavisini gözden geçirin. </li><li> Ligasyon reaksiyonundan 4-8 bireysel koloniyi (negatif kontrol: bağlanma oranına bağlı olarak) seçin ve bireysel koloni başına 4 mL LB artı uygun antibiyotik aşılayın ve gece boyunca 37 ° C ve 220 rpm&#39;de büyütün. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin ve DNA 17&#39;yi ölçün. </li><li> EcoRI ile pMGX- yfg1,2&#39;nin bir kısıtlama sindirimini uygulayarak ikinci genin etkili bir şekilde eklenmesini ekranlayın . <ol><li> 150-500 ng DNA ve 1 μL EcoRI enzim içeren 2 uL EcoRI 10x tampon içeren 20 uL sindirim reaksiyonu kullanın. 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca özümleyin. </li></ol></li><li> Uygun bir yüzde agaroz jel üzerinde elektronforasyon kısıtlama sindirimi; Karşılık gelen bir grup arayınS gen 2 boyutuna (bkz. Adım 2.2). Bir gen vektör içine istenmeyen ters yönde yerleştirilebilir. </li></ol> 4. Genler 1 ve 2&#39;yi içeren pMGX Vektörüne Üçüncü Bir Genin Eklenmesi, pMGX- yfg1,2 <ol><li> Restriksiyon sindirimi pMGX- yfg1,2 , AvrII ile gerçekleştirin ve Adım 3.1&#39;de görüldüğü gibi CIP ile işleme sokun . </li><li> Adım 3.2&#39;de görüldüğü gibi AvrII ve XbaI ile kısıtlama sindirimi pMGX- yfg3 . </li><li> Elektroforez, uygun bir yüzde agaroz jelinde kısıtlama sindirerek temiz bir neşter / bıçak bıçağı kullanarak ekleme ve vektör bantları tüketmek; Adımlar 2.2-2.3&#39;e bakın. </li><li> Jel özütleme kiti kullanarak DNA&#39;yı agaroz jelden ayıklayın ve DNA&#39;yı nicelleştirin 17 . </li><li> 3: 1 insert-vektör oranı kullanılarak gen 3&#39;ü pMGX-yfgl.2&#39;ye bağlayın ve Adım 3.5&#39;te görüldüğü gibi ilave bir ekleme olmadan sindirilmiş pMGX- yfg1,2&#39;nin negatif bir ligasyonu oluşturun. </li><li> Ligasyon reaksiyonlarının 5 μL&#39;sini XL&#39;ye çevirinAdım 2.6&#39;da görüldüğü gibi, 1-Mavi kimyasal olarak yetkili E. coli hücreleri, ligand plasmid pMGX- yfg1,2,3 (1, 2 ve 3 ilgi genleri içerir) ve negatif pMGX- yfg1,2 kontrolü. </li><li> Negatif kontrol ve ligasyon plakaları üzerindeki koloni sayısını karşılaştırın. Negatif kontrol plakasında çok sayıda koloni varsa, Adım 4.1&#39;e dönün ve CIP tedavisini gözden geçirin. </li><li> Ligasyon reaksiyonundan 4-8 bireysel koloni seçin (negatif kontrol: bağlanma oranına bağlı olarak) ve her koloni için uygun antibiyotik artı 4 mL LB&#39;yi inoküle edin; Gece boyunca 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de büyür. </li><li> Üreticinin protokolüne göre bir plazmid DNA izolasyon kiti kullanarak plazmid DNA&#39;yı izole edin. </li><li> Adım 3.10&#39;da görüldüğü gibi EcoRI ile pMGX- yfg1,2,3&#39;ün bir kısıtlama sindirimini uygulayarak üçüncü genin etkin şekilde eklenmesini ekranlayın . </li><li> Uygun bir yüzde agaroz jel üzerinde elektronforasyon kısıtlama sindirimi; bakGen 2 ve gen 3 boyutlarına karşılık gelen bantlar için (bkz. Adım 2.2). Not: gen 3 vektör içine istenmeyen, ters yönde yerleştirilebilir. Genler 2 ve 3 aynı büyüklükte ise, tarama için başka bir uygun kısıtlama sindirim bölgesi seçilmelidir. NOT: Her bir yeni gen için gerektiği gibi tekrarlayın. </li></ol> 5. Çok Boyutlu Bir İfade Sistemi Kullanarak Proteinlerin Üretilmesi ve Üretimin Batı Lekeleme ile Değerlendirilmesi <ol><li> İlgili tüm genleri içeren pozitif klon, kimyasal olarak yetkin, protein üreten E. coli&#39;ye , örneğin BL21- (λDE3) dönüştürülür. <ol><li> 5 dakika süreyle kimyasal olarak yetkili BL21- (λDE3) E. coli&#39;nin 100 uL&#39;lik kısımlarını çözündükten sonra pozitif klonlanmış plazmid DNA&#39;sının 1 uL&#39;ini ekleyin; Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. </li><li> Isı hücrelerini, 42 ° C&#39;de tutulan bir su banyosu içinde 45 s boyunca şoklayın ve daha sonra 200 μL soğuk LB&#39;yi ekleyin. Buz üzerinde 2 dakika inkübe edin. </li><li>Hücreleri 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de 1 saat boyunca çalkalayın ve daha sonra uygun seçilebilir işaretleyiciyi (ya ampisilin ya da kanamisin) içeren bir LB agar plakasına 100 ul plakaya yayın. </li></ol></li><li> Proteini, izopropil-β-D-l-tiogalaktopiranosid (IPTG) indüksiyonu ile ifade edin. <ol><li> B21- (λDE3) transformasyon plakasından izole edilmiş bir koloni seçin ve 4 mL LB ve uygun antibiyotiği inoküle edin; Gece boyunca büyür, 37 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de çalkalama. </li><li> 100 mL&#39;lik bir LB&#39;yi ve 1 mL&#39;lik gece kültürü kullanılarak uygun antibiyotik kültürü inoküle edin. </li><li> 37 ° C&#39;de büyütün ve 220 rpm&#39;de çalkalayarak OD 600&#39;ü 0.6&#39;ya getirin. </li><li> Kültürü 100 uM IPTG ile indükleyin ve 25 ° C&#39;de ve 220 rpm&#39;de 15 saat büyütün. </li><li> Kültür 1 ml çıkarın ve 1 dakika için 13.000 xg de santrifüj; Süpernatanı atın. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre lizis çözeltisini kullanarak hücreleri LyseVe tüm proteinlerin başarılı bir şekilde üretilip üretilmediğini belirlemek için çözünebilir hücre lizatı için bir Western leke hazırlayın 19 . </li></ol>

<ol><li>Purnick, P. E. M., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+wave+of+synthetic+biology%3A+from+modules+to+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The second wave of synthetic biology: from modules to systems.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).</li>
<li>Bieniossek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li>
<li>Jochimsen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+phosphonate+operon+gene+products+as+components+of+a+multi-subunit+complex+of+the+carbon-phosphorus+lyase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).</li>
<li>Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+mevalonate+pathway+in+Escherichia+coli+for+production+of+terpenoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids.</a> Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).</li>
<li>Ajikumar, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoprenoid+pathway+optimization+for+Taxol+precursor+overproduction+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.</a> Science. 330 (6000), 70-74 (2010).</li>
<li>Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor-directed+biosynthesis+of+epothilone+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).</li>
<li>Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acid+and+N-acyl+sialic+acid+analog+production+by+fermentation+of+metabolically+and+genetically+engineered+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli.</a> Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).</li>
<li>Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/303559323_N-Acetylneuraminic_Acid_Production_in_Escherichia_coli_Lacking_N-Acetylglucosamine_Catabolic_Machinery">N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery.</a> Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).</li>
<li>Romier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+protein+complexes+in+prokaryotic+and+eukaryotic+hosts%3A+experimental+procedures%2C+database+tracking+and+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%2C+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies.</a> Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).</li>
<li>Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+protein+coexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for protein coexpression in Escherichia coli.</a> Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Kim, K. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-promoter+vector+is+highly+efficient+for+overproduction+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes.</a> Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).</li>
<li>Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pST44+polycistronic+expression+system+for+producing+protein+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).</li>
<li>Chen, X., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEV+protease-facilitated+stoichiometric+delivery+of+multiple+genes+using+a+single+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector.</a> Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), (2012).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (48), (2011).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning">https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning</a> (2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot">https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot</a> (2016).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> J. Vis. Exp. (27), (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birden fazla genin ortak ekspresyonu, özellikle karmaşık, multigenik metabolik yolları karakterize etme ve yeniden yapılandırmada 3 , 4 , 5 için giderek daha fazla önemlidir. PMGX sistemi E. coli rutininde 6 , 7 , 8 randevularında multijen ortak ekspresyonu yapar ve çeşitli araştırmacılar tarafından erişilebilir durumdadır. Bu...

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, özellikle sentetik biyoloji uygulamalarında, birden fazla fonksiyonel modülün ifade edilmesi gerektiği durumlarda giderek önemlidir; Protein-protein kompleksleri üzerinde çalışırken, ekspresyon ve fonksiyonun sık sık birlikte ifade etmesini gerektirir 2 , 3 ; Ve patolojideki her bir genin 4 , 5 , 6 , 7 , 8 olarak ifade edilmesi gereken biyosentetik yolları karakterize etme ve harekete geçirme. Özellikle konakçı organizma Escherichia coli , laboratuvar rekombinant protein ekspresyonu için çalışma atında, birlikte ifade için bir takım sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, farklı seçilebilir işaretleyicilere sahip birden fazla plazmid, farklı ex miktarları kullanılarak bireysel proteinleri ifade etmek için kullanılabilir<html> Baskı vektörleri 10 , 11 . Çoklu protein ekspresyonu için tekli plazmid sistemleri, her bir gen 10 , 12&#39;nin ekspresyonunu kontrol etmek için çoklu promotörleri kullandı; Sentetik operanlar, burada birden fazla gen tek bir kopyada kodlanmıştır 2 , 13 ; Veya, bazı durumlarda, nihai olarak proteolitik olarak işlenmiş, ilgilenilen istenen proteinleri üreten bir polipeptidi kodlayan tek bir gen. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55187/55187fig1.jpg" /> Şekil 1: Bir polisistronik vektörün yapımını gösteren pMGX iş akışı. PMGX sistemi, indüklenebilir bir T7 promoterinin kontrolü altındaki sentetik operonların oluşturulması için esnek ve kullanımı kolay bir strateji sağlar.E-posta: e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimeraz ( Şekil 1 ) kontrolü altında multijene sentetik operonların inşası için oldukça etkili bir sistemin kullanımı açıklanmaktadır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Başlangıçta pKH22 olarak adlandırılan, 6 , 7 , 8 numaralı farklı uygulamalar için başarıyla kullanılan bir plazmid sistemini temel alır. Burada, bu plazmid seti, dört ilgili vektörü içerecek şekilde genişletilir: pMGX-A, herhangi bir C veya N-terminal etiketi içermeyen bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-hisA, bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-K, bir ifade vektörüC veya N-terminal etiketlerini ve kanamisin direnç işaretleyicisini ölçmek; Ve bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve kanamisin dirençli markör olan pMGX-hisK. Bu çalışmada, pMGX sistemi, özellikle pMGX-A kullanılarak beş gen ihtiva eden bir polisistronik vektör üretme yöntemi, her bir proteinin Escherichia coli&#39;de başarılı bir şekilde üretilmesi ile birlikte gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Enzimler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Alkalin Fosfataz, Buzağı Bağırsağı (CIP)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Yeni İngiltere Biolabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Herculase II Füzyon DNA Polimeraz</td><td>Agilent Technologies</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA merdiveni</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>%4-20 Mini-PROTEAN TGX Lekesiz Protein Jelleri</td><td>Bio-Rad</td><td>456-8095</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE</td><td>Fisher Termo Bilimsel</td><td>BP1332-4</td><td></td></tr><tr>Agar <td>Fisher Termo Bilimsel</td><td>BP1423-500</td><td></td><td>Agaroz</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Termo Bilimsel</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) kimyasal olarak comeptent hücreleri</td><td></td><td></td><td>Evde hazırlanan comeptent hücresi</td></tr><tr><td>B-PER Bakteriyel Protein Ekstraksiyon Reaktifi</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>PI78243</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı</td><td>Polimeraz Jel Ekstraksiyon</td>Kiti <td></td> ile Birlikte Verilen Agilent Teknolojileri <td></td></tr><tr><td></td><td></td> VWR Cat 3 tarafından sağlanan Omega <td>D2500-02</td><td>E.Z.N.A Jel Ekstraksiyonu: CA101318-972</td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>His Tag Antikoru [HRP], mAb, Fare</td><td>GenScript</td><td>A00612</td><td></td></tr><tr><td>İmmobilon Batı Kemilüminesan HRP Substrat</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKLS0100</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Alrich</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>A411-20</td><td></td></tr><tr><td>Pastörize anında yağsız süt tozu</td><td>Yerel bakkal</td><td></td><td>İsimsiz bakkal sütü yeterli</td></tr><tr><td>Nitroselüloz membran</td><td>Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)</td><td>10600007</td><td>Membran PT 0.45 & mikro; m 200 mm x 4 m, VWR Cat # tarafından sağlanır: CA10061-086</td></tr><tr><td>Plazmid DNA İzolasyon Kiti</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td><td>E.Z.N.A Plazmid DNA MiniKit I, VWR Cat # tarafından sağlanır: CA101318-898</td></tr><tr><td>pMGX</td><td>Boddy Lab</td><td></td><td>Boddy Lab'den Talep İletişim cboddy@uottawa.ca</td></tr><tr><td>Primerler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>İstenilen gen için gerektiği gibi primerler tasarlayın</td></tr><tr><td>Sentetik Gen Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td><td>İhtiyaca göre tasarlayın ve optimize edin</td></tr><tr><td>Kalın Leke Filtre Kağıdı</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>BioShop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Alrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue kimyasal olarak yetkin hücreler</td><td></td><td></td><td>Evde hazırlanan comeptent hücresi</td></tr><tr><td>Name</td><td> Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>RK-83600-07</td><td></td></tr><tr><td>Jel kutusu - PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td>Mini-PROTEİN Tetra Dikey Elektroforez Hücre</td></tr><tr><td>Jel Görüntüleyici</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>AlphaImager EC</td></tr><tr><td>İnkübatör-fırın</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>İnkübatör-çalkalayıcı</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td>MaxQ 6000</td></tr><tr><td>Personna Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>S04615</td><td></td></tr><tr><td>Güç Paketi</td><td>Bio-Rad</td><td>S65533Q</td><td>FB300</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>VWR International</td><td>M-10E, 6W</td><td></td></tr><tr><td>Termosilker</td><td>Eppendorf</td><td>Z316091</td><td>Mastercycler Kişisel, Sigma</td></tr><tr><td>UV Face-Shield</td><td></td><td>tarafından sağlanır 18-999-4542</td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Banyosu Fisher Thermo Scientific</td><td>15-460-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Batı Transfer Aparatı</td><td>Bio-Rad</td><td>1703935</td><td>Mini-Trans Blot Hücresi</td></tr></tbody></table>

İndüklenebilir t7 rna polimeraz aracılı Çok boylu İfade sistemi, pmgx

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, sentetik biyoloji, protein-protein kompleksleri ve biyosentetik yolların belirlenmesi ve işlenmesi için gittikçe zorunludur. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimerazın kontrolü altında multigen sentetik operonların oluşturulması için oldukça etkili bir sistemin kullanımı anlatılmıştır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Burada, hem ampisilin hem de kanamisin direnci seçilebilir markeri (A ve K) olan ve ya bir N-terminal hekzahistidin&#39;e sahip olan ya da olmayan bir dizi dört ilgili vektör, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K ve pMGX-his Etiket (onun) ifşa edilmektedir. Bu vektör sistemi kullanılarak sentetik operonların inşası için ayrıntılı protokoller, beş gen ihtiva eden bir pMGX tabanlı sistemin Escherichia coli&#39;de beş şifrelenmiş proteinin her birinin üretilmesi için kolayca oluşturulabileceğini ve kullanılan olabileceğini gösteren karşılık gelen verilerle birlikte sağlanmaktadır. Bu sistEm ve protokolü, araştırmacıların E. coli&#39;deki karmaşık çok bileşenli modülleri ve yolakları rutin olarak ifade etmelerini sağlar.

Bu çalışmada, amaç, tek bir plazmitten beş proteinin birlikte ekspresyonu yapmaktı. N-veya C-terminalli hekzahistidin etiketlerini kodlayan beş kodon optimize edilmiş sentetik gen fragmanları ticari olarak satın alınmıştır. Sentetik genler PCR ile amplifiye edildi ve ayrı ayrı bir PCR-künt vektör içine klonlandı ve sekanslandı. Polisistronik plasmid üretmek için, ilgilenilen beş gen uygun bir pMGX plazmidi, pMGX-A&#39;ya klonlandı. Şekil 2 , NdeI + EcoRI ile...

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli&#39;de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Bu prosedürün genel amacı, birden çok proteinin eş zamanlı olarak eksprese edilmesi için indüklenebilir bir T7 RNA polimeraz kontrolü altında çok genli sentetik operonlar oluşturmaktır. Bu yöntem, sentetik biyoloji ve biyokimya alanındaki araştırmacıların çok proteinli yolaklar kurmalarına veya çoklu ekspresyon yaklaşımlarına bağımlı olan protein komplekslerini incelemelerine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, Escherichia coli bünyesinde birden fazla genin tek bir plazmitten eş zamanlı olarak eksprese edilmesine olanak tanımasıdır.Laboratuvarımdaki prosedürü, doktora öğrencisi Mohamed Hassan ve stajyer öğrenci Angela Thompson uygulamalı olarak gösterecekler. Metin protokolüne uygun olarak ilgilenilen genler elde edilip amplifiye edildikten sonra, ilk ilgilenilen gen ve pMGX faktörü için sindirim reaksiyonlarını hazırlayın. İndel enzimi içerisine, 0.5 ile 1.5 µg DNA içeren 40 µL'lik bir reaksiyon kullanın.Reaksiyonları 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından EcoRI ekleyin ve sindirimin bir saat daha sürmesine izin verin. Etkili bir sindirim sağlandığından emin olmak için EcoRI'dan önce NdeI eklenir.NdeI, restriksiyon bölgesinin her iki yanındaki çift zincirli DNA

inducible-t7-rna-polymerase-mediated-multigene-expression-system-pmgx

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kaynak: Berens, C. ve diğerleri. Bakteriyel virülans faktörlerinin hücre içi sinyal ile girişimini incelemek için indüklenebilir bir ifade sistemi uygulamak. J. Vis. Exp. (2015)Bu video, bakteriyel efektör protein CaeB'nin konak apoptotik kaskadını nerede bozduğunu belirlemek için indüklenebilir bir ekspresyon sisteminin kullanımını göstermektedir. Tetrasiklin-tepkili bir sistemle CaeB-eksprese eden hücrelerin transfekte edilmesi, pro-apoptotik gen ekspresyonunu indüke etmek ve zincir içindeki...

İndüklenebilir bir gen ifade sisteminin bakteriyel efektör proteini ifade eden hücrelere aktarılması

Bu video, bir fare modelinde tetrasiklin veya Tet-On gen ekspresyon sistemini göstermektedir. Bir tetrasiklin türevi olan doksisiklin varlığında, ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör proteinden oluşan Tet-On sistemi aktive olur ve ilgilenilen geni eksprese eder.

İndüklenebilir Tet-On Düzenlenebilir Sistem Tabanlı In Vivo: Fare Modelinde Hedef Gen Transkripsiyon Aktivasyonu için Tetrasiklin Kaynaklı Bir Gen Ekspresyon Sistemi

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem...

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Burada açıklanan yöntem, bir anti-apoptotik bakteriyel efektör proteinin aktivitesini incelemek için tanımlanmış adımlarda apoptotik sinyal kaskadını indüklemek için kullanılır. Bu yöntem aynı zamanda pro-apoptotik veya toksik proteinlerin indüklenebilir ekspresyonu için veya diğer sinyal yollarıyla etkileşimi incelemek için de kullanılabilir.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

Burada, bir protokol tarafından tebufenozide tedavi pEUI(+) tekil gen anahtarını kullanarak transgene ifade modülasyon için mevcut.

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Keşfedin, indüklenebilir T7 RNA polimeraz aracılı çok boyutlu ifade sistemini Escherichia coli'de çoklu gen eşzamanlı ifadesi için. Bu yöntem sentetik biyoloji ve biyokimya araştırmalarında protein komplekslerinin çalışılmasını kolaylaştırır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Daha fazla video keşfet