Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Epidermiste. İmmünohistokimya, spesifik proteinleri ekspresyon bölmelerine lokalize etmenin etkili bir yoludur. Bu videoda, laboratuvarımızda rutin olarak kullandığımız epidermisteki proteinin immünolokalizasyonu için güvenilir bir yöntem gösteriyoruz.

Merhaba, ben Tammy, kronik hastalık programındaki Ottawa Sağlık Araştırma Enstitüsü'nün alçak binasındaki Dr.Turin'in Laboratuvarı'ndan. Bugün size fare epidermisinin parafine gömülü doku bölümlerinde floresan antikorlar kullanarak immünohistokimya için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, BO'nun sabit dokusunu kullanarak epidermal farklılaşma belirteçlerini immünolokalize etmek için protokolleri optimize ettik.

Optimizasyonun bir parçası olarak, düzeltmeden önce cildi kağıt havlu üzerine sererek düz tutuyoruz. Bu prosedür, epidermisin diseksiyonunu, fiksasyonunu, dehidrasyonu, parafin gömülmesini ve kesit kesmeyi, de mumlamayı, rehidrasyonu, antijeni, maskelemeyi, antikor, etiketlemeyi ve son olarak epi floresan ile montaj ve görselleştirmeyi içerir. Öyleyse başlayalım.

Yenidoğan fareleri kullanırken, sırt derisini tıraş etmeye gerek yoktur. Bununla birlikte, kürkü olan daha yaşlı fareleriniz olduğunda, bölümleri kesmenin önüne geçmemesi için arka deriyi tıraş etmeniz gerekir. Diseksiyonunuzu yaparken, forsepslerinizi tahliliniz için kullanmak istediğiniz cilt bölgelerine koymamak için çok dikkatli olmak istersiniz.

Yaptığımız şey şu, forsepsleri keseceğimiz yerin kenarına koyuyoruz, ve sonra çok dikkatli bir şekilde kaldırıyorsunuz, epidermisi kesiyorsunuz, deneyiniz için kullanmak istediğiniz alana dokunmamayı unutmayın. Cildi düzeltirken, cildin kıvrılmasını ve tüpün içinde olmasını istemeyiz. Güzel ve düz olmasını istiyoruz.

Bu yüzden buna yardımcı olmak için yaptığımız şey, cildi bir kağıt havlunun üzerine sermektir, böylece sabitlenirken düz kalır. Artık cildi kağıt havlu üzerinde güzel ve düz bir şekilde elde ettiğimize göre, forseps ile zarar vermiş olabileceğimiz parçaları çıkarmak için kenarları kesmek veya budamak. Ve sonra cildi çok küçük parçalara bölersiniz, yaklaşık iki milimetreye iki milimetre.

Şimdi doku düzeltilecek. Cildi yönetilebilir parçalar halinde kestikten sonra, onu boin solüsyonuna batırın. Tüpleri kapatın, tüpleri perfil ile sarın ve bir külbütöre koyun.

gecelik inkübasyon için, boin solüsyonunda sadece 16 ila 18 saat inkübe etmek önemlidir. Fiksasyon sürelerinin daha kısa veya daha uzun olması dokunun zarar göreceği anlamına gelir. Kuluçka bitti.

Dokunuzu PBS ile durulayın ve ardından %30, %50 ve %70 alkol kullanarak bir dizi etanol yıkama işleminden geçirin. BO'nun renginin sarı olduğunu ve yıkamaları yaptıkça, nimetler seyreltildikçe, yıkamanın renginin giderek daha az sarı hale geldiğini görebilirsiniz. Her seferinde 30 dakika olmak üzere iki kez yıkarsınız.

Etanoldeki son yıkamanın ardından, numuneler taze% 70 etanol içine yerleştirilir ve birkaç parafin deliği daha fazla işlenene kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Katıştırma. Donmuş dokuların aşırı kullanımı, doku bütünlüğünün üstün olması ve örneklerin uzun süre saklanabilmesidir. Genel olarak, çekirdek tesisler daha tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Bununla birlikte, tesisiniz ve uzmanlığa sahip özel bir operatörünüz varsa, bölümler şirket içinde kesilebilir. İyi bölümleri kesmeyi öğrenmek daha çok bir sanattır. Bu nedenle, bir çekirdek tesis kullanıyoruz.

Slaytları Core tesisinden geri aldıktan sonra, slaytların üzerinde parafinin bulunduğunu görebilirsiniz. İnce bir film olarak slaytlar, tıpkı fırınlanmış patates gibi alüminyum folyo ile sarılmış bir rafa yerleştirilir ve 55 derecede beş dakika inkübe edilir. Kuluçka işleminiz bittikten sonra, slaytları hızlı bir şekilde açın ve slaytları beş dakikalık üç yıkama için toluene yerleştirin.

Bu beş dakikalık yıkayıcıların iyi zamanlanmış olması, çok uzun süre kuluçkaya yatırılması gerektiğini ve toluenin numuneleriniz için iyi olmayacağını hatırlamak çok önemlidir. Üç yıkamadan ve toluenden sonra, yüzde yüz etanolde hızlı bir durulama yapın. Etanol ve toluen, deneyinize müdahale edecek bir çökelti oluşturduğundan, bu hatırlanması gereken çok önemli bir adımdır.

Daha sonra, numuneler, slaytlar,% 95 etanol içinde beş dakika,% 70 etanol içinde beş dakika ve daha sonra iki kez beş dakika su içinde inkübe edilerek yeniden sulandırılır. Bu noktada, dokular h ve e ile boyama için işlenebilir. Çekirdek tesisi de bu amaçla kullanıyoruz.

Antijenin maskesini çıkarmak için, zayıf 500 mil bir kerelik sitrat tamponunu bir litrelik plastik behere daldırın ve slaytlarınızı daldırın. Metal sapı çıkarmayı ve beherinizi mikrodalgaya koymayı unutmayın. İki kere beş dakika yüksek güçte mikrodalga.

İki kuluçka döneminiz arasında mikrodalgayı soğutmak için kapıyı açmayı unutmayın. Mikrodalga fırınlama işleminiz bittikten sonra, slaytları kaynar sitrat tamponundan çıkarın ve ılık su içeren bir boyama kabına koyun. Sadece ılık musluk suyu kullanıyoruz ve bunun amacı slaytlarınızı kaynama noktasından oda sıcaklığına yavaşça soğutmaktır.

Artık slaytları PBS'de üç kere beş dakika yıkayabilirsiniz ve immünohistokimya ile başlamaya hazırız. İmmüno-boyamaya başlamak için yapmamız gereken ilk şey, örneklerimizin etrafındaki alanı bir parça kağıt mendil ile kurutmaktır. Antikor çapraz kontaminasyonunu önlemek için, örneklerimizin etrafındaki alanı bir sıvı engelleyici ile sınırlandırıyoruz.

Bir Petri kabına bir filtre kağıdı koyarak nemlendirilmiş bir oda hazırlayın. Su ile ıslatın, fazla suyu alın ve slaytlarınızı yerleştirin. Nemlendirilmiş bir oda kullanmamızın nedeni, kuluçka dönemlerimiz sırasında slaytlarımızın kurumamasını sağlamaktır.

Slaytların kurumaması çok önemlidir çünkü çizim yapmak arka planınızı artıracaktır. Slaytlar bu sırada inkübasyon tamponu ile 30 dakika boyunca bloke edilir. Engelledikten sonra, slaytlarınızı sürgülü rafa geri aktarın ve yıkama tamponunda inkübe edin.

Daha önce yaptığınız gibi fazla arabelleği çıkarın. Slaytı nemlendirilmiş odaya geri koyun ve bir saat boyunca birincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında.

Bir saatlik inkübasyonunuz sona erdiğinde, slaytları tekrar sürgülü rafa koyun ve üç kez 10 dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkamalarınızdan sonra, numunenizin etrafındaki fazla yıkama tamponunu bir kağıt mendil ile çıkarın. Slaytları nemlendirilmiş odaya geri koyun ve ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin İkincil antikor ile inkübe ettikten sonra, her biri 15 dakika olmak üzere üç yıkama tamponu değişikliğinde yıkayın.

Sonra, üç kez beş dakika içinde yıkarız. PBS'de, numuneyi çevreleyen fazla sıvıları çıkarın ve lam kapaklarını lam üzerine monte etmek için PBS'yi slaytın arkasından silerek silin. %2,5 DAB co ile mobil kullanıyoruz.

Solmayı azaltmak için, slaytlara 80 mikrolitre damla damla ekleyin. Herhangi bir baloncuk sokmamaya dikkat edin. Sonra bir kapak kızağı üzerinde çok yavaş bir şekilde indirin.

Geride baloncuk bırakmamaya özen gösterin. Baloncuklar kötüdür çünkü genellikle numunenizin üzerine, cep telefonunuz kuruduktan sonra fotoğraflarınızı çekmek istediğiniz yere inerler. Artık gitmeye hazırsınız Slaytlarınıza bakın.

İşte bir FITC filtresi kullanarak başarılı bir Boyamaya bir bakış. 20 x'lik bir hedefte, Clain altı'yı epidermisin tüm süper bazal katmanlarıyla ilişkili görüyoruz. Laboratuvarımız, epidermisteki claudinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ile çok ilgilenmektedir.

Sıkı bağlantılar ve epidermal geçirgenlik bariyerinin oluşumu ile ilgili olarak, size fare derisi üzerinde İmmünohistokimyanın nasıl gerçekleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürü yaparken, doku bölümlerinizin düz olmasını istediğinizi ve slaytlarınızın inkübasyonlar arasında kurumadığından emin olmak istediğinizi hatırlamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.