Name: Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin fare epidermisinde floresan antikorlarla immünohistokimya yöntemini. Parafin gömülü dokularda protein lokalizasyonu için optimize edilmiş bu teknik, epidermal farklılaşma belirteçlerinin görselleştirilmesinde güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu deneysel bir yaklaşım için tam metin protokolü mevcuttur <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1385/1-59259-241-4:229">Springer Protokolleri</a> .

Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

floresan antikorlar fare epidermis parafin bölüm İmmünohistokimya

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Epidermis, immünhistokimya onların göreceli ifade bölmesi spesifik proteinlerin yerelleştirilmesi verimli bir anlamı; yani, bazal suprabasal ve stratum korneum katmanları. Belirli bir protein epidermis içinde kesin lokalizasyonu epidermis içinde fonksiyonel rolü doğru ipuçları katıyor. Bu bölümde, biz, bizim laboratuar çok rutin kullanımı hem de dondurulmuş ve parafin bölümleri için modifiye epidermis içinde immunolocalization için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Parafin kesitleri genellikle çok daha iyi bir morfoloji, bu nedenle, üstün sonuçlar ve fotoğraflar sağlar, ancak tüm antikorlar ve işleme katılan sert tespiti ve tedavisi ile birlikte çalışacaktır. Bu nedenle, dondurulmuş kesit için protokol de dahildir. Parafin kesit içinde, iki sabitleme protokolleri tanımlanmıştır (Bouin Kullanıcı ve paraformaldehid) fiksatif seçimi doğrudan antikor özellikleri ile ilgili olacak ve başka bir sabitleme yöntemi gerekebilir.

Biz, bizim laboratuar çok rutin kullanımı hem de dondurulmuş ve parafin bölümleri için modifiye epidermis içinde immunolocalization için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Epidermiste immünohistokimya, spesifik proteinlerin göreli ekspresyon kompartmanlarını, yani bazal...

Epidermiste. İmmünohistokimya, spesifik proteinlerin ekspresyon bölmelerinin yerini belirlemek için etkili bir yöntemdir. Bu videoda, laboratuvarımızda rutin olarak kullandığımız, epidermisteki proteinlerin immün lokalizasyonu için güvenilir bir yöntemi gösteriyoruz.Merhaba, ben Ottawa Sağlık Araştırma Enstitüsü'nün kronik hastalıklar programı kapsamındaki düşük binada bulunan Dr. Turin'in Laboratuvarı'ndan Tammy. Bugün sizlere, fare epidermisinin parafin gömülü doku kesitlerinde floresan antikorlar kullanılarak gerçekleştirilen bir immünohistokimya prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, BO'S ile fikse edilmiş dokuları kullanarak epidermal diferansiyasyon belirteçlerinin immün lokalizasyonu için protokoller optimize ettik.Optimizasyonun bir parçası olarak, sabitlemeden önce deri kağıt havlu üzerine serilerek düz tutulur. Bu prosedür; epidermisin diseksiyonunu, sabitlemeyi,dehidrasyonu, parafin gömme işlemini ve kesit almayı, ardından mumun uzaklaştırılmasını, rehidrasyonu, antijen maskesinin kaldırılmasını, antikor işaretlemesini ve son olarak epi-floresan ile montaj ve görüntülemeyi içerir. Öyleyse başlayalım.Neonatal fareler kullanıldığında sırt derisini tıraş etmeye gerek yoktur. Ancak, kürkleri olan daha yaşlı fareler kullandığınızda, kesitlerin alınmasına engel olmaması için sırt derisini tıraş etmeniz gerekir. Diseksiyon yaparken, forsepsleri assay için kullanacağınız deri bölgelerine yerleştirmemeye çok dikkat etmelisiniz.Yapacağımız işlem, forsepsi keseceğimiz yerin kenarına yerleştirmek ve ardından çok dikkatli bir şekilde kaldırıp epidermisi kesmektir; burada deneyinizde kullanmak istediğiniz bölgeye dokunmamaya özen gösterin. Deriyi tespit ederken, derinin kıvrılıp tüpün içinde kalmasını istemiyoruz. Derinin düzgün ve düz bir şekilde durmasını istiyoruz.Buna yardımcı olmak için yaptığımız işlem, deri fiksasyon işlemi sırasında düz kalması için bir kağıt havlu üzerine sermektir. Deriyi kağıt havlu üzerinde düz bir şekilde konumlandırdıktan sonra, pensle zarar vermiş olabileceğimiz kısımları temizlemek için kenarları kesiyoruz veya kırpıyoruz. Ardından, deriyi yaklaşık 2 mm x 2 mm boyutunda çok küçük parçalara ayırıyoruz.Şimdi doku fikse edilecek. Deri yönetilebilir parçalara kesildikten sonra, boin çözeltisine daldırılır. Tüplerin kapaklarını kapatın, tüpleri parafilm ile sarın ve bir sallayıcıya yerleştirin.Gece boyu inkübasyon için, boin çözeltisinde sadece 16 ila 18 saat inkübasyon yapılması önemlidir. Daha kısa veya daha uzun fiksasyon süreleri dokunuza zarar verecektir. İnkübasyon tamamlanmıştır.Dokunuzu PBS ile duruladıktan sonra %30, %50 ve %70'lik alkol kullanarak bir dizi etanol yıkama işlemine tabi tutarsınız. BO'nun sarı renkte olduğunu ve yıkamaları gerçekleştirdikçe, BO seyreltildikçe yıkama sıvısının renginin giderek daha az sarılaştığını görebilirsiniz. Her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez yıkama yaparsınız.Etanol ile yapılan son yıkamanın ardından örnekler taze %70 etanol içerisine yerleştirilir ve paraffin gömme işleminin devamına kadar dört derece Celsius sıcaklıkta saklanabilir. Dondurulmuş dokuların kullanımıyla doku bütünlüğü daha üstün olur ve örnekler uzun süreler boyunca saklanabilir. Genel olarak, merkezi tesisler daha tekrarlanabilir sonuçlar üretir.Bununla birlikte, uygun tesisiniz ve gerekli uzmanlığa sahip özel bir operatörünüz varsa, kesitler kurum içinde alınabilir. İyi kesitler almayı öğrenmek bir nevi sanat formudur. Bu nedenle, biz merkezi bir tesis kullanıyoruz.Slaytları Merkez tesisten geri aldıktan sonra, slaytlar üzerinde parafin olduğunu görebilirsiniz. İnce bir film tabakası halindeki slaytlar, tıpkı fırınlanmış bir patates gibi alüminyum folyoya sarılmış bir rafa yerleştirilir ve 55 °C'de beş dakika boyunca inkübe edilir. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, slaytların sarılı olan folyoyu hızlıca açın ve slaytları beşer dakikalık üç yıkama için toluene yerleştirin.Bu beş dakikalık yıkamaların zamanlamasının çok önemli olduğunu, inkübasyon süresinin çok uzun tutulmasının ve toluen kullanımının numuneleriniz için uygun olmayacağını unutmamak gerekir. Üç yıkama ve toluen işleminin ardından, %100 etanol ile hızlı bir durulama yapın. Etanol ve toluen, deneyinizi etkileyecek bir çökelek oluşturduğundan, bu hatırlanması gereken çok önemli bir adımdır.Ardından, lamların beş dakika %95 etanolde, beş dakika %70 etanolde ve sonrasında iki kez beş dakika suda inkübe edilmesiyle örnekler yeniden hidrate edilir. Bu noktada, dokular H ve E ile boyama işlemi için hazırlanabilir. Bu amaçla merkez laboratuvar imkanlarından da yararlanmaktayız.Antijen maskesini kaldırmak için, bir litrelik plastik bir beherin içine 500 ml tek seferlik sitrat tamponu dökün ve lamlarınızı içine daldırın. Metal sapı çıkarmayı unutmayın ve beherinize mikrodalga fırına yerleştirin. Yüksek güçte iki kez beş dakika boyunca mikrodalgada ısıtın.İki inkübasyon arasında mikrodalga fırının soğuması için kapağı açmayı unutmayın. Mikrodalgada ısıtma işlemi tamamlandıktan sonra, lamları kaynayan sitrat tamponundan çıkarın ve ılık su içeren bir boyama kabına yerleştirin. Burada sadece ılık musluk suyu kullanıyoruz ve bunun amacı, lamların kaynama noktasından oda sıcaklığına yavaşça soğumasını sağlamaktır.Şimdi lamları üç kez beşer dakika PBS ile yıkayabilirsiniz ve immünohistokimya işlemine başlamaya hazırız. İmmün boyamaya başlamak için yapmamız gereken ilk şey, örneklerimizin etrafındaki alanı bir parça kağıt havlu ile kurutmaktır. Antikor çapraz kontaminasyonunu önlemek için, örneklerimizin etrafındaki alanı sıvı bir bloklayıcı ile sınırlandırırız.Bir Petri kabına filtre kağıdı yerleştirerek nemlendirilmiş bir hazne hazırlayın. Kağıdı suyla ıslatın, fazla suyu uzaklaştırın ve lamlarınızı yerleştirin. Nemlendirilmiş hazne kullanmamızın nedeni, inkübasyon süreleri boyunca lamların kurumasını önlemektir.Çizimlerin arka planı artıracağı için lamların kurumaması çok önemlidir. Lamlar bu aşamada 30 dakika boyunca inkübasyon tamponu ile bloke edilir. Bloklamadan sonra lamları tekrar lam rafına aktarın ve yıkama tamponu içerisinde inkübe edin.Daha önce yaptığınız gibi fazla tamponu uzaklaştırın. Lamı tekrar nemlendirme haznesine yerleştirin ve oda sıcaklığında, bir saat boyunca primer antikor ile inkübe edin.Bir saatlik inkübasyon süresi dolduğunda, lamları tekrar lam rafına yerleştirin ve üç kez 10 dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkama işlemlerinden sonra, örneğin etrafındaki fazla yıkama tamponunu bir kağıt havlu ile alın. Lamları tekrar nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve sekonder antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; sekonder antikor ile inkübasyondan sonra, her biri 15 dakika sürecek şekilde üç kez taze yıkama tamponu ile yıkayın.Ardından, beşer dakikalık üç yıkama işlemi gerçekleştirilir. PBS ile örneğin etrafındaki fazla sıvılar uzaklaştırılır ve lamın arkasındaki PBS silinerek lam üzerine lameller monte edilir. %2.5 DAB içeren mobil çözelti kullanıyoruz.Solmayı azaltmak için, lamların üzerine damla damla 80 µL ekleyin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, bir lamellenin üzerine çok yavaşça indirin.Herhangi bir hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Hava kabarcıkları istenmeyen durumlardır çünkü mobil cihazınız kuruduktan sonra görüntü almak istediğiniz tam noktada, yani örneğinizin üzerinde kalırlar. Artık hazırsınız; lamlarınızı inceleyin.Burada FITC filtresi kullanılarak gerçekleştirilen başarılı bir boyamaya bakış yer almaktadır. 20 x objektifte, epidermisin tüm süper bazal tabakalarıyla ilişkili Clain six'ı görmekteyiz. Laboratuvarımız, epidermisteki claudinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ile yakından ilgilenmektedir.Sıkı bağlantılar ve epidermal geçirgenlik bariyerinin oluşumu ile ilgili olarak, fare derisine nasıl immünohistokimya uygulanacağını size gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, doku kesitlerinizin düz olması gerektiğini ve inkübasyonlar arasında lamların kurumasını önlemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

immunohistochemistry-on-paraffin-sections-mouse-epidermis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Bu video, meme kanserinin bir fare modelinde tümör hedefleme antikorlarının biyolojik dağılımını incelemek için in vivo immünofloresan lokalizasyon (IVIL) tekniğini göstermektedir. Farede tümöre özgü bir antikorun intravenöz enjeksiyonu üzerine, tümör cerrahi olarak izole edilir ve antikorun tümör dokusu içindeki lokalizasyonu ex vivo immün boyama yoluyla doğrulanır.

Antikor Biyodağılımını İncelemek için Bir İn Vivo İmmünofloresan Lokalizasyon Yöntemi

Bu tür saç folikülleri ve sinir uçları gibi - - mekansal organizasyon farklı desen sergileyen Memeli cilt yapıları çeşitli bir dizi içerir. Düz bir montaj olarak cilt analiz deri yapıları tam kalınlığı yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için bu doku 2-boyutlu geometri yararlanır.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Deri, insan patojeni herpes simpleks virüsü tip 1'in (HSV-1) hedef dokularından biridir. HSV-1'in dokuya invazyon yolunu araştırmak için, cildin en dış tabakasını temsil eden murin epidermal tabakalarının ex vivo bir enfeksiyon modeli oluşturduk.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır.

&quot;Acufection&quot; ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Burada, cilt segmentasyonu için ücretsiz bir ImageJ tabanlı makro olan SCAnED kullanarak cilt bölümlerindeki bağışıklık ve bağışıklık olmayan hücreleri tanımlamak ve ölçmek için yarı otomatik bir protokol sunuyoruz.

SCAnED - Epidermal ve Dermal Cilt Bölmelerinde Yarı Otomatik Hücre ve Çekirdek Tespiti için Açık Kaynaklı Bir Cilt Segmentasyon Makrosu

İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Öğrenin fare epidermisinde floresan antikorlarla immünohistokimya yöntemini. Parafin gömülü dokularda protein lokalizasyonu için optimize edilmiş bu teknik, epidermal farklılaşma belirteçlerinin görselleştirilmesinde güvenilir sonuçlar sunar.

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Daha fazla video keşfet