Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

Epidermiste. İmmünohistokimya, spesifik proteinlerin ekspresyon bölmelerinin yerini belirlemek için etkili bir yöntemdir. Bu videoda, laboratuvarımızda rutin olarak kullandığımız, epidermisteki proteinlerin immün lokalizasyonu için güvenilir bir yöntemi gösteriyoruz.

Merhaba, ben Ottawa Sağlık Araştırma Enstitüsü'nün kronik hastalıklar programı kapsamındaki düşük binada bulunan Dr. Turin'in Laboratuvarı'ndan Tammy. Bugün sizlere, fare epidermisinin parafin gömülü doku kesitlerinde floresan antikorlar kullanılarak gerçekleştirilen bir immünohistokimya prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, BO'S ile fikse edilmiş dokuları kullanarak epidermal diferansiyasyon belirteçlerinin immün lokalizasyonu için protokoller optimize ettik.

Optimizasyonun bir parçası olarak, sabitlemeden önce deri kağıt havlu üzerine serilerek düz tutulur. Bu prosedür; epidermisin diseksiyonunu, sabitlemeyi,dehidrasyonu, parafin gömme işlemini ve kesit almayı, ardından mumun uzaklaştırılmasını, rehidrasyonu, antijen maskesinin kaldırılmasını, antikor işaretlemesini ve son olarak epi-floresan ile montaj ve görüntülemeyi içerir. Öyleyse başlayalım.

Neonatal fareler kullanıldığında sırt derisini tıraş etmeye gerek yoktur. Ancak, kürkleri olan daha yaşlı fareler kullandığınızda, kesitlerin alınmasına engel olmaması için sırt derisini tıraş etmeniz gerekir. Diseksiyon yaparken, forsepsleri assay için kullanacağınız deri bölgelerine yerleştirmemeye çok dikkat etmelisiniz.

Yapacağımız işlem, forsepsi keseceğimiz yerin kenarına yerleştirmek ve ardından çok dikkatli bir şekilde kaldırıp epidermisi kesmektir; burada deneyinizde kullanmak istediğiniz bölgeye dokunmamaya özen gösterin. Deriyi tespit ederken, derinin kıvrılıp tüpün içinde kalmasını istemiyoruz. Derinin düzgün ve düz bir şekilde durmasını istiyoruz.

Buna yardımcı olmak için yaptığımız işlem, deri fiksasyon işlemi sırasında düz kalması için bir kağıt havlu üzerine sermektir. Deriyi kağıt havlu üzerinde düz bir şekilde konumlandırdıktan sonra, pensle zarar vermiş olabileceğimiz kısımları temizlemek için kenarları kesiyoruz veya kırpıyoruz. Ardından, deriyi yaklaşık 2 mm x 2 mm boyutunda çok küçük parçalara ayırıyoruz.

Şimdi doku fikse edilecek. Deri yönetilebilir parçalara kesildikten sonra, boin çözeltisine daldırılır. Tüplerin kapaklarını kapatın, tüpleri parafilm ile sarın ve bir sallayıcıya yerleştirin.

Gece boyu inkübasyon için, boin çözeltisinde sadece 16 ila 18 saat inkübasyon yapılması önemlidir. Daha kısa veya daha uzun fiksasyon süreleri dokunuza zarar verecektir. İnkübasyon tamamlanmıştır.

Dokunuzu PBS ile duruladıktan sonra %30, %50 ve %70'lik alkol kullanarak bir dizi etanol yıkama işlemine tabi tutarsınız. BO'nun sarı renkte olduğunu ve yıkamaları gerçekleştirdikçe, BO seyreltildikçe yıkama sıvısının renginin giderek daha az sarılaştığını görebilirsiniz. Her biri 30 dakika sürecek şekilde iki kez yıkama yaparsınız.

Etanol ile yapılan son yıkamanın ardından örnekler taze %70 etanol içerisine yerleştirilir ve paraffin gömme işleminin devamına kadar dört derece Celsius sıcaklıkta saklanabilir. Dondurulmuş dokuların kullanımıyla doku bütünlüğü daha üstün olur ve örnekler uzun süreler boyunca saklanabilir. Genel olarak, merkezi tesisler daha tekrarlanabilir sonuçlar üretir.

Bununla birlikte, uygun tesisiniz ve gerekli uzmanlığa sahip özel bir operatörünüz varsa, kesitler kurum içinde alınabilir. İyi kesitler almayı öğrenmek bir nevi sanat formudur. Bu nedenle, biz merkezi bir tesis kullanıyoruz.

Slaytları Merkez tesisten geri aldıktan sonra, slaytlar üzerinde parafin olduğunu görebilirsiniz. İnce bir film tabakası halindeki slaytlar, tıpkı fırınlanmış bir patates gibi alüminyum folyoya sarılmış bir rafa yerleştirilir ve 55 °C'de beş dakika boyunca inkübe edilir. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, slaytların sarılı olan folyoyu hızlıca açın ve slaytları beşer dakikalık üç yıkama için toluene yerleştirin.

Bu beş dakikalık yıkamaların zamanlamasının çok önemli olduğunu, inkübasyon süresinin çok uzun tutulmasının ve toluen kullanımının numuneleriniz için uygun olmayacağını unutmamak gerekir. Üç yıkama ve toluen işleminin ardından, %100 etanol ile hızlı bir durulama yapın. Etanol ve toluen, deneyinizi etkileyecek bir çökelek oluşturduğundan, bu hatırlanması gereken çok önemli bir adımdır.

Ardından, lamların beş dakika %95 etanolde, beş dakika %70 etanolde ve sonrasında iki kez beş dakika suda inkübe edilmesiyle örnekler yeniden hidrate edilir. Bu noktada, dokular H ve E ile boyama işlemi için hazırlanabilir. Bu amaçla merkez laboratuvar imkanlarından da yararlanmaktayız.

Antijen maskesini kaldırmak için, bir litrelik plastik bir beherin içine 500 ml tek seferlik sitrat tamponu dökün ve lamlarınızı içine daldırın. Metal sapı çıkarmayı unutmayın ve beherinize mikrodalga fırına yerleştirin. Yüksek güçte iki kez beş dakika boyunca mikrodalgada ısıtın.

İki inkübasyon arasında mikrodalga fırının soğuması için kapağı açmayı unutmayın. Mikrodalgada ısıtma işlemi tamamlandıktan sonra, lamları kaynayan sitrat tamponundan çıkarın ve ılık su içeren bir boyama kabına yerleştirin. Burada sadece ılık musluk suyu kullanıyoruz ve bunun amacı, lamların kaynama noktasından oda sıcaklığına yavaşça soğumasını sağlamaktır.

Şimdi lamları üç kez beşer dakika PBS ile yıkayabilirsiniz ve immünohistokimya işlemine başlamaya hazırız. İmmün boyamaya başlamak için yapmamız gereken ilk şey, örneklerimizin etrafındaki alanı bir parça kağıt havlu ile kurutmaktır. Antikor çapraz kontaminasyonunu önlemek için, örneklerimizin etrafındaki alanı sıvı bir bloklayıcı ile sınırlandırırız.

Bir Petri kabına filtre kağıdı yerleştirerek nemlendirilmiş bir hazne hazırlayın. Kağıdı suyla ıslatın, fazla suyu uzaklaştırın ve lamlarınızı yerleştirin. Nemlendirilmiş hazne kullanmamızın nedeni, inkübasyon süreleri boyunca lamların kurumasını önlemektir.

Çizimlerin arka planı artıracağı için lamların kurumaması çok önemlidir. Lamlar bu aşamada 30 dakika boyunca inkübasyon tamponu ile bloke edilir. Bloklamadan sonra lamları tekrar lam rafına aktarın ve yıkama tamponu içerisinde inkübe edin.

Daha önce yaptığınız gibi fazla tamponu uzaklaştırın. Lamı tekrar nemlendirme haznesine yerleştirin ve oda sıcaklığında, bir saat boyunca primer antikor ile inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyon süresi dolduğunda, lamları tekrar lam rafına yerleştirin ve üç kez 10 dakika boyunca yıkama tamponu ile yıkayın. Yıkama işlemlerinden sonra, örneğin etrafındaki fazla yıkama tamponunu bir kağıt havlu ile alın. Lamları tekrar nemlendirilmiş hazneye yerleştirin ve sekonder antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; sekonder antikor ile inkübasyondan sonra, her biri 15 dakika sürecek şekilde üç kez taze yıkama tamponu ile yıkayın.

Ardından, beşer dakikalık üç yıkama işlemi gerçekleştirilir. PBS ile örneğin etrafındaki fazla sıvılar uzaklaştırılır ve lamın arkasındaki PBS silinerek lam üzerine lameller monte edilir. %2.5 DAB içeren mobil çözelti kullanıyoruz.

Solmayı azaltmak için, lamların üzerine damla damla 80 µL ekleyin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Ardından, bir lamellenin üzerine çok yavaşça indirin.

Herhangi bir hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Hava kabarcıkları istenmeyen durumlardır çünkü mobil cihazınız kuruduktan sonra görüntü almak istediğiniz tam noktada, yani örneğinizin üzerinde kalırlar. Artık hazırsınız; lamlarınızı inceleyin.

Burada FITC filtresi kullanılarak gerçekleştirilen başarılı bir boyamaya bakış yer almaktadır. 20 x objektifte, epidermisin tüm süper bazal tabakalarıyla ilişkili Clain six'ı görmekteyiz. Laboratuvarımız, epidermisteki claudinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ile yakından ilgilenmektedir.

Sıkı bağlantılar ve epidermal geçirgenlik bariyerinin oluşumu ile ilgili olarak, fare derisine nasıl immünohistokimya uygulanacağını size gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, doku kesitlerinizin düz olması gerektiğini ve inkübasyonlar arasında lamların kurumasını önlemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.