Kapsamlı Usulü değerlendirin

Bu prosedürün genel amacı, tümör taşıyan, immünokompetan farelerde kanser nanonomedisinlerinin sistemik, doku, tek hücre ve hücre altı düzeylerdeki in vivo davranışlarını değerlendirmektir. Bu yöntem, kanser nanomedisini alanındaki temel sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Nanomedisinler, canlı hayvanların farklı dokularında zaman içinde kantitatif olarak nasıl birikmektedir?

Bu tekniğin temel avantajı, bu çift etiketleme yaklaşımının nanovakum ilaçların in vivo karakterizasyonuna makroskobik düzeyden mikroskobik düzeye kadar olanak tanımasıdır. Prosedürümüzü göstermek için örnek olarak lipozomları seçtik çünkü lipozomlar şu an klinik kullanımda olan ve aynı zamanda deneysel nanovakum ilaçlar için yaygın bir platform teşkil eden yapılardır. Prosedüre başlamak için, %0,1 mol oranında lipofilik katyonik floresan boya içeren 20 miligram lipid karışımını, iki mililitre kloroform içerisinde çözün.

Ardından, lipidleri döner evaporatör ile kurutun. Kurutulmuş lipidlere 20 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Karışımı, işlem boyunca dört ile 20 derece santigrat arasında tutarak, 3,8 milimetrelik bir prob sonikatör ile buz üzerinde 30 watt gücünde 30 dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.

Elde edilen lipozomal nanoparçacık süspansiyonunu 4.000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti atın ve lipozomları, 4000 G'de 100 kilodalton MWCO santrifüj filtre ünitesi kullanarak PBS ile yıkayın. Konsantre edilen lipozomları üst hazneden yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Lipozomlar, buzdolabında PBS içerisinde bir haftaya kadar saklanabilir.

50 µL saflaştırılmış lipozom süspansiyonu ve 950 µL PBS karışımı üzerinde dinamik ışık saçılımı analizi gerçekleştirin. Parçacık boyutlarını ölçün ve boyut dağılımını belirleyin. Radyoetiketleme prosedürüne başlamak için, iki mg lipid elde edecek miktarda saflaştırılmış lipozom ve PBS'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.

Buna, final hacmi 100 µL ve pH değeri 6,9 ile 7,1 olacak şekilde bir millicurie zirconium-89 oksalat ekleyin. Karışımı 37 °C'de iki saat boyunca karıştırın. Ardından, serbest zirconium-89'u 100 kDa'lık bir filtre ünitesi kullanarak 4.000 G'de santrifüj filtrasyonu ile uzaklaştırın. Retentatı 4.000 G'de üç kez steril PBS ile yıkayın. Daha sonra, retentatı enjeksiyon için mikrolitre başına yaklaşık üç microcurie olacak şekilde seyreltin.

Radyoetiketli lipozomların radyokimyasal saflığını belirlemek için radyasyon detektörü ile eşleştirilmiş boyut dışlama HPLC'si kullanın. Radyokimyasal saflık %95'in altındaysa dozu yeniden formüle edin. Parçacık boyutu ve dağılım değerlerinin her ikisinin de radyoetiketlenmemiş lipozomlarınkine benzer olduğunu doğrulamak için dinamik ışık saçılımı kullanın.

Görüntüleme prosedürüne başlamak için, sabitlenmiş bir melanoma faresinin kuyruk venine yaklaşık 300 microcurie radyolojik olarak işaretlenmiş lipozom enjekte edin. Enjeksiyondan iki dakika sonra, farenin kuyruk veninden 10 ila 20 microliter kan toplamak için 28 gauge bir insülin şırıngası kullanın. Kan örneğini önceden tartılmış bir sayım tüpüne aktarın.

Kan örneğini tartın ve aktiviteyi gama sayıcı ile ölçün. Radyoaktivite konsantrasyonunu, gram başına enjekte edilen dozun yüzdesi olarak hesaplayın. Enjeksiyondan on beş dakika sonra, başka bir kan örneğini aynı şekilde toplayın ve ölçün.

Ardından, fareyi burun konisi aracılığıyla %2 isoflurane ve oksijen uygulayarak anesteziye alın. Enjeksiyondan bir saat sonra üçüncü bir kan örneği toplayın ve ölçün. Daha sonra, farenin normal hareket kabiliyeti geri kazanılana kadar bir iyileşme kafesinde dinlenmesine izin verin.

Enjeksiyondan dört, sekiz, 24 ve 48 saat sonra ek örnekler toplayın. Enjeksiyonlar arasında farenin tamamen toparlanmasına izin verin. Fareyi, radyoaktif maddeler uygulanmış hayvanlar için ayrılmış bir odada barındırın.

Lipozom enjeksiyonundan 24 veya 48 saat sonra, fareyi %2 isofluran ve oksijen ile anestezi edin. Fareyi küçük hayvan microPET-CT tarayıcı tablasına karnının üzerine gelecek şekilde yerleştirin. Burun konisi aracılığıyla %2 isofluran ve oksijen vermeye devam edin.

Gözlerin kurumasını önlemek için farenin gözlerine veteriner pomadı uygulayın. Ardından, tarayıcı tablasını cihazın içine yerleştirin. 250 ila 700 kiloelektron volt enerji ve altı nanosaniyelik bir çakışma zamanlama penceresi ile, en az 50 milyon çakışma olayı içeren 15 dakikalık tüm vücut PET statik tarama gerçekleştirin.

Ardından, 220 derece boyunca 120 rotasyonel adım ile, kare başına yaklaşık 145 milisaniye olacak şekilde beş dakikalık bir BT taraması gerçekleştirin. Tarama tamamlandıktan sonra, fareyi karbon dioksit asfiksisi ile derhal sakrifiye edin. Hayvanın patisini sıkarak ölümünü teyit edin ve ardından servikal dislokasyon uygulayın.

Kanı uzaklaştırmak için dokuları PBS ile perfüze edin ve ilgili doku örneklerini toplayın. Toplanan dokuları tartın ve aktivitelerini ölçün. Radyoetiketli lipozom birikimini, gram başına enjekte edilen dozun yüzdesi olarak hesaplayın.

Tümör dokusunu soğuk PBS içinde saklayın. Hücre popülasyonlarına göre birikimi ölçmek için hasat edilen tümör dokusu üzerinde ex vivo akış sitometrisi ve immünofloresan görüntüleme gerçekleştirin. Zirkonyum-89 ile işaretlenmiş nanopartiküller enjekte edilen tümör taşıyıcı farelerin PET/CT görüntülemesi, enjeksiyondan 24 saat sonra tümör dokusunda anlamlı nanopartikül birikimi olduğunu göstermiştir.

Nanopartiküllerin kan yarı ömrünün yaklaşık 10 saat olduğu belirlenmiştir. Enjeksiyondan 24 saat sonra yapılan ex vivo biyodağılım ölçümleri, in vivo PET/CT ölçümleri ile tutarlılık göstermiştir. Nanopartikül birikimi daha sonra immün boyama teknikleri kullanılarak tek hücre düzeyinde incelenmiştir.

Akış sitometrisi, nanoparçacıkların tercihen tümörle ilişkili makrofajlarda biriktiğini göstermiştir. Tümör örneklerinin immünofloresan görüntülemesi de nanoparçacıkların endotel hücrelerini spesifik olarak hedeflediğini ortaya koymuştur. Bu teknik, araştırmacıların klinik çeviri için gelecek vaat eden nanilaçları belirlemesine yardımcı olabilir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde yürütülürse üç günde tamamlanabilir. Nanilaçların radyolabellemesi yapılırken, yüksek kalite kontrol standartlarının uygulanması önemlidir. Bu prosedür takip edilerek, tümör taşıyan farelerdeki in vivo performanslarını ölçmek amacıyla nanoemülsiyonlar, polimerik nanoparçacıklar, miseller, antikorlar ve antikor fragmanları gibi diğer nanilaçlar da etiketlenebilir.