Kapsamlı Usulü değerlendirin İn Vivo Kanser Nanomedicines performans

Bu prosedürün genel amacı, tümör taşıyan, immün yetmezliği olan farelerde kanser nanoilaçlarının sistemik, doku, tek hücreli ve subselüler düzeylerde in vivo davranışını değerlendirmektir. Bu yöntem, kanser nanotıp alanındaki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Nanoilaçlar zaman içinde canlı hayvanların farklı dokularında kantitatif olarak nasıl birikir?

Bu tekniğin temel avantajı, bu çift etiketleme yaklaşımının, makroskobikten mikroskobik seviyeye kadar in vivo nanotıp karakterizasyonuna izin vermesidir. Prosedürümüzü tanımlamak için örnek olarak lipozomları seçiyoruz çünkü lipozomlar şu anda klinik kullanımda ve aynı zamanda deneysel nanoilaçlar için ortak bir platform. Prosedüre başlamak için, bir lipofilik katyonik floresan boya ve iki mililitre kloroformun molü% 0.1'ini içeren 20 miligram bir lipit karışımını çözün.

Ardından, lipitleri döner bir buharlaştırıcı ile kurutun. Kurutulmuş lipitlere 20 mililitre fosfat tamponlu salin ekleyin. Karışımı, 30 dakika boyunca 30 watt'ta 3.8 milimetre prob sonikatörü ile buz üzerinde sonikleştirin ve karışımı dört ila 20 santigrat derece arasında tutun.

Elde edilen lipozomal nanopartikül süspansiyonunu 10 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Peletleri atın ve 4000 G'de 100 kilodalton MWCO santrifüj filtre ünitesi kullanarak lipozomları PBS ile yıkayın. Lipozomlar PBS'de bir buzdolabında, bir haftaya kadar saklanabilir.

50 mikrolitre saflaştırılmış lipozom süspansiyonu ve 950 mikrolitre PBS karışımı üzerinde dinamik ışık saçılımı gerçekleştirin. Partikül boyutlarını ölçün ve boyut dağılımını belirleyin. Radyoetiketleme prosedürüne başlamak için, iki miligram lipit elde etmek için gerekli miktarda saflaştırılmış lipozom ve PBS olan 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Buna, 100 mikrolitrelik bir son hacim ve 6.9 ila 7.1 arasında bir pH için bir miliküri zurkonyum-89 oksalat ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede iki saat karıştırın. Daha sonra, 4.000 G'de 100 kilodaltonluk bir filtre ünitesi ile santrifüjlü filtrasyon ile serbest zirkonyum-89'u çıkarın.Retentate'i 4.000 G'de üç kez steril PBS ile yıkayın.

Radyoaktif işaretli lipozomların radyokimyasal saflığını belirlemek için bir radyasyon dedektörü ile eşleştirilmiş boyut dışlama HPLC'sini kullanın. Radyokimyasal saflık% 95'in altındaysa, dozu yeniden formüle edin. Parçacık boyutunun ve dağılım değerlerinin her ikisinin de radyoaktif işaretli olmayan lipozomlarınkine benzer olduğunu doğrulamak için dinamik ışık saçılımı kullanın.

Görüntüleme prosedürüne başlamak için, kısıtlanmış bir melanom faresinin kuyruk damarına yaklaşık 300 mikroküri radyoaktif işaretli lipozom enjekte edin. Enjeksiyondan iki dakika sonra, farenin kuyruk damarından 10 ila 20 mikrolitre kan toplamak için 28 gauge insülin şırıngası kullanın. Kan örneğini önceden tartılmış bir sayma tüpüne aktarın.

Kan örneğini tartın ve aktiviteyi bir gama sayacı ile ölçün. Radyoaktivite konsantrasyonunu gram başına enjekte edilen dozun yüzdesi olarak hesaplayın. Enjeksiyondan on beş dakika sonra, aynı şekilde başka bir kan örneği toplayın ve ölçün.

Daha sonra, bir burun konisi yoluyla% 2 izofluran ve oksijen uygulayarak fareyi uyuşturun. Enjeksiyondan bir saat sonra üçüncü bir kan örneği toplayın ve ölçün. Ardından, normal hareketlilik yeniden kazanılana kadar farenin bir kurtarma kafesinde iyileşmesine izin verin.

Enjeksiyondan dört, sekiz, 24 ve 48 saat sonra ek numuneler toplayın. Farenin enjeksiyonlar arasında tamamen iyileşmesine izin verin. Fareyi, radyoaktif maddelerin uygulandığı hayvanlar için ayrılmış bir odaya yerleştirin.

Lipozom enjeksiyonundan 24 veya 48 saat sonra, fareyi %2 izofluran ve oksijen ile uyuşturun. Fareyi küçük bir hayvan microPET-CT tarayıcı yatağına karnının üzerine yerleştirin. Bir burun konisi aracılığıyla% 2 izofluran ve oksijen vermeye devam edin.

Kurumasını önlemek için farenin gözlerine veteriner merhemi sürün. Ardından, tarayıcı yatağını cihazın içine taşıyın. En az 50 milyon çakışan olay, 250 ila 700 kiloelektron volt enerji ve altı nanosaniyelik bir çakışma zamanlama penceresi ile 15 dakikalık bir tüm vücut PET statik taraması gerçekleştirin.

Ardından, kare başına yaklaşık 145 milisaniye ile 220 derece üzerinde 120 dönme adımıyla beş dakikalık bir BT taraması gerçekleştirin. Tarama tamamlandıktan sonra, fareyi hemen karbondioksit boğulması ile feda edin. Hayvanın pençesini sıkıştırarak ölümü onaylayın ve ardından servikal çıkık yapın.

Kanı çıkarmak için dokuları PBS ile perfüze edin ve ilgili doku örneklerini toplayın. Toplanan dokuları tartın ve aktivitelerini ölçün. Dokudaki radyoaktif işaretli lipozom birikimini gram başına enjekte edilen dozun yüzdesi olarak hesaplayın.

Tümör dokusunu soğuk PBS'de saklayın. Hücre popülasyonlarına göre birikimi ölçmek için hasat edilen tümör dokusu üzerinde ex vivo akış sitometrisi ve immünoflurescence görüntüleme gerçekleştirin. Zirkonyum-89 ile işaretlenmiş nanopartiküller enjekte edilen tümör taşıyan farelerin PET/CT görüntülemesi, enjeksiyondan 24 saat sonra tümör dokusunda önemli napartikül birikimi gösterdi.

Nanopartiküllerin kan yarılanma ömrü yaklaşık 10 saat olarak belirlendi. Enjeksiyondan 24 saat sonra yapılan ex vivo biyodağılım ölçümleri, in vivo PET/CT ölçümleri ile tutarlıydı. Nanopartikül birikimi daha sonra immün boyama teknikleri ile tek hücre düzeyinde araştırıldı.

Akış sitometrisi, nanopartiküllerin tercihen tümör destekli makrofajlarda biriktiğini gösterdi. Tümör örneklerinin immünfluresence görüntülemesi, endotel hücrelerinin nanopartiküller tarafından spesifik olarak hedeflendiğini de göstermiştir. Bu teknik, araştırmacıların klinik çeviri için umut verici nanoilaçları belirlemelerine yardımcı olabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Nanoilaçları radyolinguistik olarak etiketlerken, yüksek kalite kontrol standartlarını uygulamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, nanoemülsiyonlar, polimerik nanopartiküller, miseller, antikorlar ve antikor fragmanları gibi diğer nanoilaçlar, tümör taşıyan farelerde in vivo performanslarını ölçmek için etiketlenebilir.