Name: Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Keşfedin larva zebra balığı gonadal doku diseksiyonu yöntemini. Danio rerio cinsiyet farklılaşması ve gelişimsel biyoloji araştırmalarında moleküler analizler için erken evre dokuları izole edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz balık bakımı için C Zhang teşekkür ederim. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (GP için 31.171.074, 31.371.099 ve 31.571.067) tarafından ve Pujiang Talent Projesi (GP için 09PJ1401900) tarafından desteklenmiştir.

Zebra balığı deneyler Fudan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Balığı, standart prosedürlere 20&#39;ye göre yükseltilmiş ve yetiştirildi. 1. hazırlıklar <ol><li> larva zebrabalıkları dpf 17 dpf ve 25 yetiştirmek <ol><li> geçiş gününden önce geç öğleden sonra bir geçiş tankına Transferi 2 erkek ve 2 dişi yetişkin zebra balığı (sağlıklı, eski 3 ila 6 ay, laboratuvar AB strain). Bir bariyer kadın ve erkeklerden ayırın. Ertesi sabah, tank suyu yenilemek ve onları çiftleşmeye izin engeli kaldırın. 100 mm Petri tabaklarda döllenmeden sonra 1 ila 2 saat içerisinde yumurta toplayın. </li><li> Erken gelişim döneminde (4 gün) boyunca 28.5 ° C&#39;de 40 ml embriyo ortamı (EM) ile bir 100 mm&#39;lik plaka 40 embriyolar tutun ve günde iki kez EM yenileyin. 1 L tankları (300 ml sistem suyuna 40 larva) Larvalar aktarın ve 5 dpf sonra canlı rotifer (tam temini, günde iki kez) ile beslenirler.10 dpf&#39;e sonra yerine rotiferin diyetin canlı tuzlu su karidesi besleyin. 21 dpf 14 yaşında yeniden dolaşan su sistemi içine balık aktarın. </li><li> 17 dpf veya 25 dpf kadar yeniden dolaşan su sistemindeki larva zebrafish kaldırın. aydınlık / karanlık döngüsü sağlamak sistem su 14/10 saat ve pH değeri yaklaşık 7.2 olan. 17 dpf (5.5 mm 6.8) ve 25 dpf larvaları 22 (8 mm ila 11) arasında vücut uzunluğu ölçülür. </li></ol></li><li> diseksiyon için% 2 agar hazırlayın. <ol><li> 200 ml steril su 4 g agar ekleyin. saydam olana kadar bir mikrodalga fırınında karışım ısıtılır. </li><li> daha sonra, 60 mm çapında Petri tabağı (plakanın yaklaşık 1/3 hacim) içine dökün, yaklaşık 15 dakika boyunca agar soğutun. 4 ° C&#39;de katılaşmış Agar plakaları saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Protokol 1: Larva dpf Gonadal 17 Doku ve 25 teşrih <ol><li> 17 dpf larvaları uyutmak için tanka kırılmış buz ekleyin. Transferi30 ml soğuk Ringer solüsyonu ile Petri kabı soğutulmuş 100 mm anestezi larva. Tamamen larvaları uyutmak için en az 15 dakika boyunca soğutulmuş Ringer çözeltisinde kuluçkaya balık tutun. </li><li> Küçük bir plastik kaşıkla önceden soğutulmuş bir agar plaka larvalarını aktarın. Ringer çözeltisi soğutulmuş 10 mL tüm balık vücut daldırın ve yavaşça yan koyun. </li><li> 25X Stereo mikroskop görüş alanının altında aşağıdaki işlemleri yapın. stabilizasyon cımbız ile balık sandığı Kelepçe. cımbız bir çift kalp anusdan uzunlamasına karın Rip. Yavaşça iç organları açığa çıkarmak için vücudun bir tarafında cilt ve kasların kaldırın. </li><li> dikkatle yüzmek mesaneye ventral organlarının kütlesini çıkarın. yüzme mesaneye bağlı gonad zarar kaçının. </li><li> yüzmek mesane ve ön vücut arasındaki bağlantıyı kesin. Tüm yüzmek mesane ve yavaşça gonadal doku çekin. NOT: En durumdas, 17 dpf gonadal doku epitel doku ve protonephridium çevreleyen içerir. Bunlar kolayca birbirinden ayrıldı değildir, ancak 25 ° C&#39;de kolayca ayrılabilir dpf. erbezi ayrıca anüs bağlanır. anüs birbirine bağlı sol ve sağ gonad olan bir bağlantı açıkça görülebilir. </li><li> dikkatli bir şekilde yüzme mesaneden gonadal doku ayırmak ve çevresindeki yağ dokuları temizlemek için cımbız kullanarak. </li><li> Hemen 200 uL Ringer çözeltisi ihtiva eden önceden soğutulmuş bir 1.5 mL santrifüj tüpüne izole gonadal doku aktarın. Tüm gonadal dokular larva ayrılır kadar buz üzerinde tüp tutun. </li><li> 2.7 - adımlarda 2.1 anlatıldığı gibi dpf larvaları 25 gonadlar parçalara ayır. </li></ol> 3. Protokol 2: İzole Gonadal Dokuların Gen İfade analiz <ol><li> larva gonadal dokulardan toplam RNA ekstrakte edilir. <ol><li> Yeni RNazsız 1&#39;e izole gonadal dokuları aktarın.5 ml tüp Ringer çözeltisi kaldırıp. 100 uL lizis çözeltisi ilave edin. dokuların kadar Vorteks tamamen parçalanır. </li><li> üreticinin talimatlarına göre toplam RNA ekstraksiyon prosedürü uygulayın. </li><li> I tampon 10x DNase 1/10 hacmi ve RNA çözeltisine DNase I 1 uL ekleyin ve yavaşça karıştırın. 37 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> RNA çözeltisine 1/10 hacim DNaz inaktivasyon reaktif ekleyin. 70 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. bir spektrofotometre kullanılarak toplam RNA konsantrasyonu ölçümü. -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Birinci-şerit cDNA sentezi gerçekleştirme <ol><li> üreticinin protokolünü birinci tür cDNA sentezi gerçekleştirmek için bir oligo (dT) -bağlayıcı primeri kullanarak. 20 uL bir toplam reaksiyon hacmi 1 RNA ug 2 ekle. </li><li> 45 ° C&#39;de 90 dakika boyunca reaksiyon çözeltisi inkübe edin. 5 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtma ile reaksiyonu bitirin. </li><li> cDNA 1 mL RNaz H ekleme yüzdenDevriminin kalıntı RNA&#39;nın çıkması için. ~ 13,000 x g&#39;de 10 saniye boyunca hafifçe ve santrifüj karıştırın. 37 ° C&#39;de 20 dakika süreyle inkübe edilir. 20 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin. -70 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Floresan kantitatif PCR gerçekleştirme <ol><li> bir floresan boya ile bir döngü sisteminde qPCR gerçekleştirin. 15 s, 30 s için 68 ° C, 15 sn için 95 ° C &#39;de Tm-5 ° C ile 35 döngü: Aşağıdaki PCR döngü koşulları kullanarak. (: GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV: fwd CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG), cyp19a1a:;: AMH (GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG fwd: rev GTGGATGGCAGCAGTACGAC) aşağıdaki gibi primer dizileri kullanarak, nanos3 (FWD: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC), vasa (FWD: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV: CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC) ve β-aktin (FWD: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rEV: GCACTTCCTGTGGACGATGGA) 19. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+sex+in+zebrafish%3A+loss+of+the+natural+sex+determinant+in+domesticated+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains.</a> Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).</li>
<li>Liew, W. C., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+sex%3A+a+complicated+affair%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish sex: a complicated affair.</a> Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).</li>
<li>Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+winding+roads%3A+Testis+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).</li>
<li>Blaser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+non-motile+behaviour+to+directed+migration+during+early+PGC+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish.</a> J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).</li>
<li>Wang, X. G., Orban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-M%C3%BCllerian+hormone+and+11+%CE%B2-hydroxylase+show+reciprocal+expression+to+that+of+aromatase+in+the+transforming+gonad+of+zebrafish+males%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males.</a> Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).</li>
<li>Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+control+of+female+sex+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line control of female sex determination in zebrafish.</a> Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).</li>
<li>Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+apoptosis+during+the+transition+from+ovary-like+tissue+to+testes+during+sex+differentiation+of+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish.</a> J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).</li>
<li>Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+expression+in+zebrafish+during+gonad+differentiation+by+targeted+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocr%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics.</a> Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).</li>
<li>Siegfried, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+determinants%3A+gene+expression+during+gonadal+sex+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation.</a> J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).</li>
<li>Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray+analysis+of+sex-+and+gonad-biased+gene+expression+in+the+zebrafish%3A+evidence+for+masculinization+of+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome.</a> BMC Genomics. 10, 579(2009).</li>
<li>Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11264405">Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain.</a> Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).</li>
<li>Kishida, M., Callard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cytochrome+P450+aromatase+isoforms+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+brain+and+ovary+are+differentially+programmed+and+estrogen+regulated+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development.</a> Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).</li>
<li>Rodríguez-Marí, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+expression+pattern+of+zebrafish+anti-M%C3%BCllerian+hormone+%28amh%29+relative+to+sox9a%2C+sox9b%2C+and+cyp19a1a%2C+during+gonad+development%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr.Patterns%22%5BJournal%5D)">Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development.</a> Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+vas%3A%3AEGFP+transgene+in+primordial+germ+cells+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish.</a> Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).</li>
<li>Krovel, A. V., Olsen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphic+expression+pattern+of+a+splice+variant+of+zebrafish+vasa+during+gonadal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development.</a> Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).</li>
<li>Tzung, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+depletion+of+primordial+germ+cells+in+zebrafish+promotes+testis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).</li>
<li>Hsiao, C., Tsai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+with+fluorescent+germ+cell%3A+a+useful+tool+to+visualize+germ+cell+proliferation+and+juvenile+hermaphroditism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo.</a> Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).</li>
<li>Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+gonads+from+juvenile+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish.</a> Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).</li>
<li>Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nr0b1+%28DAX1%29+mutation+in+zebrafish+causes+female-to-male+sex+reversal+through+abnormal+gonadal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+The+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).</li>
<li>Liew, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polygenic+sex+determination+system+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Polygenic sex determination system in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (4), e34397(2012).</li>
<li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Organs+from+the+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of Organs from the Adult Zebrafish.</a> J. Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+Adult+Zebrafish+Hearts+for+High-throughput+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications.</a> J. Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Adult+Zebrafish+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li>
<li>Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+line+development+in+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ line development in fishes.</a> Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).</li>
<li>Huang, H. Y., Ketting, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+zebrafish+gonads+for+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation.</a> Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Zebra balığı güçlü bir model haline gelmiştir ve yoğun gelişme ve hastalıkla ilgili araştırmalarda kullanılır. Örneğin beyin, kalp, gonad ve böbrek gibi yetişkin zebrabalıkları organların izole edilmesi için yöntemler, iyi 23, 24, 25 belgelenmiştir. Nedeniyle küçük boyutu ve larva zebrabalıkları gonadal dokuların dinamik yeniden yapılanmasına bağlı gonadal dokuların izolasyonu zor bir iştir. Larva gonadlar 26<...

Vahşi Zebra balığı kromozomu 4&#39;te önemli kadın seks belirleyici 1 (yani ortak laboratuar suşları) kaybolması veya evcil zebrabalıkları değiştirilir. Bunun yerine, sıcaklık, hipoksi, gıda temini ve nüfus yoğunluğu gibi çevresel faktörlerin eşliğinde polıgenık eşey tayini sistemi var. zebra balığı seks gelişme ayrıntılı mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. Birincil cinsiyet tespiti sinyal (ler) i / ne tür zebra balığı cinsiyet tespiti oluştuğunda gibi temel soru vardır ve genler gonad dönüşümün ilk adım, 3 2 cevaplanması gereken kalır düzenleyen. Zebra balığı seks gelişim sürecinde, birçok önemli aşamalar kabul edilmiştir. gelişiminin erken safhasında, 4 HPF (saat sonra döllenme) primordiyal üreme hücreleri (PGC) özellikleri tabi başlanarak genital s göç veçoğalma. PGC sayıları ve germ hücreleri ve somatik hücreler arasındaki karşılıklı etkileşimler gonad farklılaşma 4 için çok önemlidir. 13 dpf (gün sonra döllenme) &#39;de, gonadlar farklılaşmamış aşamasındadır. 17 dpf&#39;e olarak, gonadlar gelecek hem kadın hem erkeklerin de iki potansiyel yumurtalıkların içine gelişir. yumurtalık apoptozise bağımlı bir geçiş testise 21 ila 25 dpf başlar ve birçok hafta boyunca devam edebilir. 35 dpf ile, gonadal cinsiyet tespit edilmiştir ve cinsiyete spesifik gamet üretimi, 7 her iki yumurtalıkta devam etmektedir ve 6, 5 testisler. Bugüne kadar, çeşitli aday genleri ve cinsiyet tespiti mekanizmaları önerilmiştir. Proteomik ve transkriptomik analizi, dimorfik ifade bulunan pek çok gen izole ettik ve bu genler zebrabalıkları 8 seks farklılaşma çalışma kullanılmıştır </sup&gt; 9, 10. Örneğin, larva zebrabalıkları, cyp19a1a gen özel olarak fakat testis 11, 12 yumurtalık olarak ifade edilir. Buna ek olarak, AMH geni zayıf yumurtalık folikül granüloza hücrelerinde eksprese edilir, ancak güçlü bir testis Sertoli hücreleri 13 edilmektedir. Bunun aksine, vasa geni sürekli olarak uygun bir gonad işaretleyici 14, 15 yaparak, dişi ve erkek zebrabalıkları germ hücrelerinde ifade edilir. Gonadal gen ekspresyon düzeyleri incelenmesi, özellikle iki potansiyel yumurtalık aşama 3, 9, cinsiyet tespiti ve diferansiyasyonuna ait moleküler mekanizmanın anlaşılması önemlidir. Bununla birlikte, larva zebrabalıkları ve mukabil ölçüde küçük gonad küçük boyutu gonada izolasyonunu karmaşıkDaha fazla moleküler analiz l dokusu. Kullanılan önceki çalışmalar opercula ve anal gözenek 16 arasındaki bütün gövde bölgesini disseke. Bu preparat içeren gonadlar, ancak birden fazla doku ve organların oluşur. Seçenek olarak ise, bu tür vas olarak gonad-spesifik GFP ekspresyonu ile transgenik hayvanları: EGFP flüoresan aktif hücre ayrıştırma (FACS) ve lazer yakalama mikro diseksiyon 17, 18 üzerinden gonadal doku izolasyonu için kullanılmıştır. Ama onların yaygın uygulama sınırlıdır. Burada, 17 dpf ve 25 dpf&#39;e larva zebrafish gonadal doku izole etmek için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Diğer organlarda göre gonad konumunu göstermekte ve çevre dokulardan morfolojik olarak bozulmamış gonadlar izole eder. Biz daha yüksek kantitatif PCR ile gövde dokusu (karşılaştırıldığında izole gonadlar olarak ifade edilmiştir, örneğin vaz ve cyp19a1a olarak gonad-spesifik genleri göstermektedirqPCR) analizi. Bu protokol, böylece gonad doku 19 daha sonra moleküler analiz sağlayarak, tanımlanmasını, izolasyonunu RNA saflaştırma ve larva zebrafish gonadal spesifik genlerin amplifikasyonuna olanak tanır.

<table><tbody><tr><td>Hücre kültürü kabı 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Embriyo inkübasyonu için</td></tr><tr><td>20x EM</td><td></td><td></td><td>1 L için gerekli: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl ve 2.9 g CaCl&#183 ekleyin; 2H<alt>2</alt>O; daha sonra 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 susuz ve 4.9 g MgSO4&#183; 7H<alt>2</alt>O.</td></tr><tr><td>1x EM</td><td></td><td></td><td>20x EM'yi damıtılmış suda seyreltin</td></tr><tr><td>AGAROSE G-10</td><td>Gen</td><td>121985</td><td>%2 agar plakalarını hazırlamak için</td></tr><tr><td>Trizol Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA izolasyonu için</td></tr><tr><td>Metre camı</td><td>Shen Bo</td><td>250 ml</td><td>%2 agar plakalarını hazırlamak için</td></tr><tr><td>Mikrodalga Fırın</td><td>Midea</td><td>M1-211A</td><td>AGAR'ı</td></tr> <tr><td>ısıtmak içinCımbız DUMONT # 5INOX</td><td>Dünya Hassas Alet</td><td>500341</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Motic</td><td>SMZ168</td><td>Diseksiyon için</td></tr><tr><td>Saf su ekipmanları</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer ' s çözeltisi</td><td></td><td></td><td>1 L için gerekli: 6.78 g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 ve 1.19 g Hepes ekleyin; sonra 1 L'ye kadar doldurun; PH'ı 7.2'ye ayarlayın. Süzülerek sterilize edin ve otoklavlanmış şeffaf polikarbonat bir kapta saklayın.</td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Metal banyosu</td><td>QiLinbeier</td><td></td><td>Model GL-150</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Fotomikrograf</td>Santrifüjü için <td>M205 FA</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Ölçekli RNA İzolasyon Kiti</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td>Gonad dokularından RNA izolasyonu için</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td>RNA çözeltisinde DNA sindirimi için</td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Sentez Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>#K1631</td><td>Birinci iplikli cDNA sentezi için</td></tr><tr><td>Rnase H</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EN0202</td><td>cDNA çözeltisindeki artık RNA'yı sindirmek için.</td></tr><tr><td>SYBR Green Realtime PCR Master Mix</td><td>TOYOBO</td><td>QPK-201</td><td>Bu ürün, gerçek zamanlı PCR için Taq DNA polimeraz bazlı 2x ana karışımdır ve&nbsp; SYBR Green I ile interkalasyon testi için geçerlidir.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Ne Drop</td><td>OD-2000+</td><td>Toplam RNA konsantrasyonunun ölçülmesi</td></tr><tr><td>Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>AG 22331 Hamburg</td><td>gen ekspresyon profili oluşturma</td></tr></tbody></table>

larva zebra balığı gonadal doku diseksiyon

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

vahşi Zebra balığı ZZ / ZW cinsiyet belirleme sistemine sahip olmasına rağmen, evcil Zebra balığı seks kromozomuna kaybetti. Bunlar genom topluca bireysel balık seks kimliklerini belirlemek boyunca çeşitli genler dağıtılan polıgenık eşey tayini sistemi kullanmaktadır. Şu anda, genler gonad gelişimini düzenleyen katılır ve nasıl çalışır zor kalır. Normal olarak, gonadal doku izole seks gelişim süreçleri incelemek için ilk adımdır. Burada, zebra balığı dpf larvaları 17 dpf (gün sonra döllenme) ve 25 ile gonadal doku izole etmek için bir prosedürdür. İzole gonadal doku daha sonra morfoloji ve gen ekspresyon profili ile incelenebilir.

Gonadların Diseksiyonlar AB strain larva zebrabalıkları uygulandı. Şekil 1, 17 dpf ve 25 dpf larva zebrabalıkları tipik gonadal doku gösterir. Birincisi, deri ve karın bir tarafında kaslarının iç organları açığa çıkarmak için kesilir. iç organların kütlesi çıkardıktan sonra, birlikte gonad ile yüzme kesesi gövde kalır. Yumurtalık ( &#39;Şekil 1 B&#39; de ok) kesesi ventral tarafında bağlanmıştır. 17 dpf&#39;e, g...

Burada, Zebra balığı seks farklılaşması ve bakım soruşturmaları kolaylaştıracaktır larva zebrabalıkları, gonadal doku izole etmek için bir protokol mevcut.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Bu prosedürün genel amacı, larva evresindeki zebra balıklarından gonadal dokuyu izole etmek ve izole edilen dokunun moleküler özelliklerini analiz etmektir. Bu yöntem, zebra balıklarının cinsiyet gelişimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, gonad gelişimini düzenleyen genlerin korunmuşluğu ve zebra balığı cinsiyet gelişiminin moleküler temelleri gibi. Bu tekniğin temel avantajı, döllenmeden sonra henüz 17 günlük olan zebra balığı larvalarından gonadal dokuların hücresel ve moleküler biyolojik durumları için diseke edilebilmesidir.Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler, larval zebrafish'teki gonadal dokuların küçük boyutu ve dinamik yeniden şekillenmesi nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Gonadal diseksiyon hazırlığı için, iki erkek ve iki dişi yetişkin zebrafish'i bölünmüş bir çiftleştirme tankının her iki yanına aktarın. Ertesi sabah tank suyunu tazeleyin ve çiftleşmeyi başlatmak için bariyeri kaldırın.Döllenmeden bir ila iki saat sonra, yaklaşık kırk yumurtayı toplayın ve 40 mililitre embriyo medyumuna (EM) sahip 100 milimetrelik bir plağa aktarın. Embriyoları 28,5 derece Celsius'ta dört gün boyunca inkübe edin ve EM'yi günde iki kez yenileyin. İnkübasyonun ardından larvaları bir litrelik tanklara aktarın. Döllenmeden sonraki beşinci günde (DPF), balıkları canlı rotiferlerle besleyin.Larvalar 10 DPF'ye ulaştığında, balıkları canlı tuzlu su karidesi ile besleyin. Ardından, 14 DPF'de balıkları yeniden sirküle eden bir su sistemine aktarın. Larval zebra balıklarını 17 veya 25 DPF'ye kadar büyütün.Ardından, larvaların vücut uzunluklarını 17 ve 25 DPF'de ölçün. 200 mililitre steril suya dört gram agar ekleyerek diseksiyon için yüzde iki'lik agar plakaları hazırlayın. Karışımı, şeffaf hale gelene kadar mikrodalga fırında ısıtın.Agarı 15 dakika boyunca soğutun, ardından 60 milimetre çapındaki petri kaplarına dökün. Katılaşmış agar plakalarını dört santigrat derecede saklayın. Anestezize edilmiş 17 DPF larvalarının bulunduğu tanka kırılmış buz ekleyin.Anestezize edilmiş larvaları, 30 mililitre soğuk Ringer çözeltisi içeren 100 milimetrelik soğutulmuş bir petri kabına aktarın. Larvaların tamamen anesteziye girmesi için balıkları soğutulmuş Ringer çözeltisi içinde en az 15 dakika bekletin. Plastik bir kaşıkla larvaları önceden soğutulmuş bir agar plakasına aktarın.Balık vücudunun tamamını on mililitre soğutulmuş Ringer Çözeltisi içine daldırın ve nazikçe yan tarafına yatırın. Stereomikroskop altında, 25x büyütmede, stabilizasyon için gövdeyi pensle sabitleyin. Ardından, başka bir pens kullanarak karın bölgesini anüsten kalbe doğru boylamsal olarak yırtın.Ardından, iç organları ortaya çıkarmak için vücudun bir tarafındaki deriyi ve kasları nazikçe temizleyin. Daha sonra, hava kesesinin ventralindeki büyük organları dikkatlice çıkarın. Hava kesesine bağlı olan gonada zarar vermekten kaçının.Hava kesesi ile vücudun iç kısmı arasındaki bağlantıyı kesin. Ardından, tüm hava kesesini ve gonadal dokuyu dikkatlice dışarı çıkarın. Cımbız yardımıyla, gonadal dokuyu hava kesesinden dikkatlice ayırın.Ve çevredeki adipoz dokuyu temizleyin. İzole edilen gonadal dokuyu, içinde 200 µL Ringer Solüsyonu bulunan, önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne hemen aktarın. Tüm gonadal dokular larvalardan ayrılana kadar tüpü buz üzerinde tutun.Larval gonadal dokudan toplam RNA ekstraksiyonu yapmak için, izole edilen gonadları yeni bir RNaz'dan arındırılmış 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve Ringer Solüsyonu'nu uzaklaştırın. Ardından, 100 mikrolitre lizis solüsyonu ekleyin. Doku tamamen lizis olana kadar tüpü vortekslleyin.Üretici talimatlarına göre toplam RNA ekstraksiyonunu gerçekleştirdikten sonra, RNA çözeltisine hacmin onda biri kadar DNase I tamponu ve bir mikrolitre DNase I ekleyin ve tüpün içeriğini nazikçe karıştırın. Örneği 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, RNA çözeltisine hacmin onda biri kadar DNase inaktivasyon reaktifi ekleyin.Numuneyi 70 °C'de on dakika boyunca inkübe edin. Ardından, toplam RNA konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Birinci zincir cDNA sentezini gerçekleştirmek için, üreticinin protokolünü takip ederek bir oligo-dT linker primer ve bir ila iki µg RNA kullanın.Reaksiyonu 45 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, örneği 70 °C'de beş dakika ısıtarak reaksiyonu sonlandırın. Kalan RNA'yı uzaklaştırmak için cDNA çözeltisine bir mikrolitre RNase H ekleyin.Tüpün içeriğini nazikçe karıştırın ve örneği yaklaşık 13,000 ×g hızda on saniye boyunca santrifüjleyin. Tüpü 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, örneğe 20 µL nükleaz içermeyen su ekleyin.Ve cDNA'yı -70 °C'de saklayın. Son olarak, metin protokolünde listelenen koşulları ve primerleri kullanarak floresan boya ile qPCR gerçekleştirin. Bu şekil, 17 DPF'deki larval zebra balıklarının tipik gonadal dokusunu göstermektedir.Burada görüldüğü gibi, gonat hava kesesinin ventral tarafına yapışıktır. 17 DPF'de larvalar, yarı saydam olan sol ve sağ gonadları içerir. Çoğu durumda gonadlar, epitelyal doku ve protonefridyum ile çevrilidir.25 DPF'de gonad genellikle adipoz doku ile çevrilidir ve büyük veya küçük gonadlar gözlemlenebilir. Son olarak, izole edilen gonadal dokunun moleküler özelliklerini analiz etmek için amh, cyp19a1a, nanos3 ve vasa gonadal markörlerinin ekspresyon seviyeleri QPCR ile incelenmiştir. Sonuçlar, markör genlerin gonad dokusundaki seviyelerinin kontrol dokusuna kıyasla anlamlı düzeyde arttığını göstermektedir.Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, uzmanlaşıldıktan sonra bir saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, beklenen sonuçların elde edilmesi için larva zebra balıkları için tutarlı yetiştirme koşulları sağlamanın kritik olduğunu unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, cinsiyet gelişimi alanındaki araştırmaların zebra balıklarının cinsiyet belirleyici mekanizmalarını keşfetmesinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, larva zebra balıklarından gonadal dokuların nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

dissection-of-larval-zebrafish-gonadal-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol, yetişkin zebrafish organların tanımlanması ve diseksiyon için bir prosedür açıklanmıştır.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Bu makalede, retina pigment epitel birini üç gün postfertilization embriyolar bağlı olan ve olmayan zebrafish retina microdissect bir yaklaşım açıklanmıştır.

Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon

Birden fazla gelişim evreleri zebrafish kalp diseksiyonu ve izolasyon için açık, standart bir yöntem açıklanmıştır. Annotation ve miktar teknikler de tartışılmaktadır.

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Standart embriyo mikroenjeksiyonu ve stereomikroskopi ekipmanları kullanılarak, zebrafish larvalarının mikrogavage işlemi için yeni bir yöntem sunuyoruz. Mikrogavage işleminin, çeşitli materyallerin kontrollü miktarlarda özellikle zebrafish larvalarının intestinal lümenine iletilmesi için kullanışlı, güvenli ve etkili bir teknik olduğunu gösteriyoruz.

Zebra balığı larvalarının Microgavage

Spinal Transeksiyon sonra, yetişkin zebrabalıkları altı hafta sonrası yaralanma ile fonksiyonel iyileşme var. Larva şeffaflık ve hızlı iyileşme yararlanmak için, larva omurilik transecting için bir yöntem mevcut. Transeksiyon sonra, 3 gün sonrası yaralanma ile 2 gün sonrası yaralanma başlayan duyusal iyileşme gözlemlemek, ve C-bend hareketi.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Burada, standart bir dizi protokol üstün oküler sulkus gözlemlemek için mevcut bir son zamanlarda tespit, evrimsel korunmuş yapısı omurgalı gözü önünde. Zebra balığı larva kullanarak, oluşumu ve üstün oküler sulkus kapatılması için katkıda faktörleri belirlemek için gerekli teknikleri göstermektedir.

Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Makale, retinal girdinin optik tektum büyümesini ve gelişimini nasıl etkilediğini araştırmaya yönelik ilk adım olarak canlı zebra balığı larvalarından gözlerin cerrahi olarak nasıl çıkarılacağını açıklamaktadır. Ek olarak, makale larva anesteziizasyonu, fiksasyon ve beyin diseksiyonu, ardından immünohistokimya ve konfokal görüntüleme hakkında bilgi vermektedir.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Keşfedin larva zebra balığı gonadal doku diseksiyonu yöntemini. Danio rerio cinsiyet farklılaşması ve gelişimsel biyoloji araştırmalarında moleküler analizler için erken evre dokuları izole edin.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Daha fazla video keşfet