Buharlaşma azaltıcı Kültür Durumu Mikrotiter Tabaklar Multisellüler Sfero Oluşumunun Tekrarlanabilirlik artırır

Bu prosedürün genel amacı, 384 kuyucuklu plakada bir sıvı kaplama tekniği kullanarak tek tip küresel oluşumun ölçeklenebilirliğini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmektir. Bu tekniğin ana avantajı, çoklu plakalardan aşırı ortam yeniden işlemini azaltması ve böylece sferoid oluşumunun tekrarlanabilirliğini iyileştirmesidir. Laboratuvarımızda eklembacaklı tarama testleri için 3D sferoidlerin kültüre alma yöntemini geliştirdik ve doğruladık ve çalışmamız çok hücreli kültürlerin plakalarındaki kenar etkisinin ne olduğunu değerlendirmekti.

Bugün, laboratuvardan bir poster olan Sona ile birlikte prosedürü göstereceğim. Bu prosedüre sıfır nokta yedi, beş gram düşük erime noktalı agarozu ağırlıklandırarak başlayın ve fenol kırmızısı ve serumu olsun veya olmasın 100 mililitre mccoy's 5a ortamına ekleyin. Çözeltiyi bir mikrodalgada ısıtın ve agarozu tamamen çözmek için her bir ila iki dakikada bir döndürün.

Daha sonra sterilize etmek için çözeltiyi otoklavlayın. Otoklavlanmış agarozun yaklaşık 70 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verdikten sonra, laminer bir akış kutusunda 500 mililitrelik sıfır nokta iki iki mikrometre şişe üstü filtreden süzün. Daha sonra, çözümün tamamı bir kerede kullanılmayacaksa, alikot.

Bu kullanıma hazır agaroz solüsyonunu aseptik olarak soğuk bir odada veya dört santigrat derece buzdolabında dört haftaya kadar saklayın. Bir akış kutusunda çalışırken, bir kombi reaktif dağıtıcısına plastik veya metal uçlu bir dağıtım kaseti takın. Boru ağırlığını yüzde 70 etanol içeren bir kaba yerleştirin ve ardından kaseti astarlayın.

Ardından, boru ağırlığını bir PBS kabına taşıyın ve tekrar astarlayın. Daha sonra, eritmek için mikrodalgada depolanmış filtrelenmiş agaroz çözeltisinin bir alikotunu ısıtın. Dağıtım kasetini agaroz çözeltisi ile astarlayın ve ardından 384 kuyu doku kültürü ile muamele edilmiş mikro plakayı 15 mikrolitre filtrelenmiş agaroz çözeltisi ile kaplamak için protokolü başlatın.

Hücreyi videonun bir sonraki bölümünde anlatıldığı gibi tohumlamadan veya dört santigrat derecede ve doğrudan ışıktan uzakta saklamadan önce plakadaki agarozun 15 ila 20 dakika soğumasını bekleyin. Son olarak, dağıtım kasetini temizlemek için, boru ağırlığını 70 ila 80 santigrat derece steril suya koyun ve dağıtıcı üzerindeki ana düğmeye basın. Bu, kaset uçlarında ve tüplerde kalan agarozu çıkaracaktır.

Aşağıdaki hücre tohumlama işlemi steril koşullar altında ve laminer akış kutusunda yapılmalıdır. Gerekli sayıda agaroz kaplı 384 kuyulu doku kültürü uygulanmış mikroplakayı soğuk hava deposundan çıkararak ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmelerini sağlayarak başlayın. Bu arada, standart bir tüp dağıtım kasetini yüzde 70 etanol ve steril PBS ile doldurarak kombi reaktif dağıtıcısını hücre görmesi için hazırlayın.

Ardından, dağıtıcı üzerindeki manuel ayar düğmelerini kullanarak, görme hacmini gerekli mikrolitreye ve dağıtım hızını orta seviyeye ayarlayın. Yapışık insan kolorektal karsinomu HCT116 hücrelerini bir doku kültürü şişesinden çıkarmak için rekombinant hücre ayrışma enzimi kullanın. Steril bir beherde, 50 mikrolitre tam büyüme ortamında oyuk başına mililitre başına 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda 2.5 kat yoğunlukta hücreler içeren bir hücre süspansiyon stoğu yapın.

Birden fazla 384 kuyulu plaka tohumlanacaksa, bunların beherin dibine çökmesini önlemek için manyetik bir karıştırıcı kullanın. Bir dağıtıcı kullanarak, 25 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 384 yüz hücreyi ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında 30 dakika dinlendirin.

Bu arada, buharlaşmayı azaltan bir çevresel mikroplaka kapağı alın ve beş mililitrelik bir pipet kullanarak, dört mililitre yüzde beş dimetilsülfoksiti sol taraftaki oluğa dağıtın, yavaşça yukarı ve aşağı süpürün. Bu işlemi sağ taraftaki olukla tekrarlayın. Yan oluklara eklenen sıvının kapağın ortasında birleşmediğinden ve gaz değişimi için boşluk bırakmadığından emin olun.

Çok fazla sıvı eklenirse, kapağın dışına sızacak ve ardından 384 doku kültürü plakasının dış kuyucuğuna girecektir. 30 dakika geçtikten sonra hücreleri mikroskop altında inceleyin. Plakaların 30 dakika dinlendirilmesi, hücrelerin kuyu dibine tamamen yerleşmesini ve birbirine yakın olmasını sağlar, bu da kuyu başına tek sferoidlerin oluşumu için önemlidir.

Tohumlanmış plakaları dört kez G'de 15 dakika santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, 384 doku kültürü plakasının sıvı haznesini steril su ile doldurun ve normal plaka kapaklarını sıvı dolu çevresel kapaklarla değiştirin. Plakaları yüzde 95 nem, yüzde beş CO2 ve yüzde 20 oksijen içeren 37 derece santigrat derece döner inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin dört gün boyunca çok hücreli tümör sferoidlerine veya MCTS'lere toplanmasına izin verin. Nem seviyesinin aniden düşmemesi için sonraki günlerde kuluçka makinesinin kapısını çok uzun süre açmaktan kaçının.

NCTS oluşumunu takip eden dördüncü günde, her bir oyuğa 30 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam eklemek için otomatik bir mikro plaka yıkama dağıtıcısı kullanın. MCTS'leri inkübatöre geri yerleştirin ve MCTS'lerin deney için istenen boyuta ulaşana kadar büyümesine izin verin. Her üç günde bir, ortamı değiştirmek için, yıkayıcı manifoldunun Z yüksekliğini ampirik olarak ayarlayın ve kuyulardaki türbülansı en aza indirmek için dağıtım hızını ve yıkama manifoldunun kuyulara en düşük hızda inme hızını ayarlayın.

Oyuk başına 30 mikrolitre ortam aspire edin ve 30 mikrolitre taze, önceden ısıtılmış ortamla değiştirin. Ardından hücreleri inkübatöre geri koyun. MCTS'leri, 16 sayısal diyafram açıklığına sahip dört X hava nesnesini kullanarak yüksek içerikli otomatik bir görüntüleme sisteminde görüntüleyin.

Görüntüleme yazılımını kullanarak pozlama süresini 11 milisaniyeye ve gruplamayı dörde dört olarak ayarlayın. Deneyin her bir bölmedeki MCTS'nin tamamını yakalaması için z yığınlarının sayısını ve aralığını ve piksel gruplamasını istediğiniz gibi ayarlayın. MCTS alanını, ana ve küçük ekseni, çevreyi ve sağlamlığı ölçmek için 2D görüntüleri adım adım işleyin.

Lütfen ekteki m koduna ve metin beni oku dosyalarına özel talimatlar için bakın. Rutinin potansiyel uygulanabilirliğini belirlemek için, yedi günlük MCTS'ler, anti-kanser ilaçları, Paklitaksel, PTX, Vincristine, VCR, Oxalyplatin, OXA, Doxyrubicin, DOX ve beş flurouracil, 5-FU ile farklı konsantrasyonlarda tedavi edildi. MCTS'lerin görüntüleri burada gösterilmektedir.

Bu görüntüler, ilaçla tedavi edilen MCTS'lerin alanını, majör ve minör eksenlerini, çevresini ve katılığını kontrollere, CTL'lere kıyasla belirlemek için analiz edildi. Geometrik hacmi hesaplamak için ana ve küçük eksenler kullanıldı. İlaç tedavisinden sonra MCTS alanında ve hacminde konsantrasyona bağlı bir azalma oldu.

Sıfır noktası mililitre başına bir mikrogram Vincrystine ve sıfır noktası mililitre başına dört mikrogram Doxyrubicin ve beş Fluorourasil, MCTS alanında bir artışa neden olmasına rağmen, hacim sadece mililitre Vincrystine'de sıfır sıfır bir mikrogramı takiben önemli ölçüde artmıştır. MCTS çevresi, yalnızca MCTS boyutunu tamamen etkileyen en yüksek Packlitaxel, Doxyrubicin ve Five Fleurourasil konsantrasyonlarında önemli ölçüde farklıydı. Sıfır noktasında mililitrede iki beş mikrogram ve sıfır noktasında sıfır sıfır altı mikrogramda Packlitaxel ve Vincrystine ile yapılan işlem mililitre başına 100 mikrogramda Doxyrubicin ve Five Fleurourasil ile yapılan işlem, katılıkta önemli bir azalmaya neden oldu ve bu da MCTS'lerin tamamen ila kısmen parçalandığını gösteriyor.

Birlikte ele alındığında, bu veriler potansiyel anti kanser ilaçlarının araştırılmasında bu yöntemin faydasını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tüm hücre hatlarının belirli bir 3D kültür yöntemi için uygun olmadığını ve farklı hücre hatlarının sferoid şekiller, boyut, histoloji ve büyüme kinetiğinde farklılıklar gösteren sferoidler oluşturduğunu not etmek önemlidir.

Geliştirdiğimiz stimülatör rutin, özellikle kesit alanının ölçümü için açıkça tanımlanmış bir sınırı olmayan, kısmen parçalanmış ilaçla tedavi edilmiş sferoidlerde, sferoid boyutunun etkili bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, burada bulunan modifikasyonun herhangi bir ek ekipman veya sarf malzemesi gerektirmediğini ve eklembacaklı tarama laboratuvarınızda rutin olarak uygulanabileceğini iyi anlamış olmalısınız.