3D Mekansal Hücre Kültürleri için hücre yapı iskeleleri olarak biyo-uyumlu sıvı kristal Elastomer Köpüklerin sentezi

Bu prosedürün amacı, biyouyumlu yan zincirli sıvı kristal elastomerlere dayalı, biyolojik olarak parçalanabilen, üç boyutlu köpük benzeri hücre iskeleleri hazırlamaktır. Bu yöntem, sıvı kristal elastomer özelliklerinin hücre çoğalması ve hizalanması üzerindeki etkileri gibi sıvı kristal ve biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İki boyutlu hücre iskelelerinin bu yönteminin ana avantajı, 2D makro ortamlarda nadiren mümkün olan uzamsal hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine izin vermesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayanlar dokunsal sıkıştırma testleriyle mücadele edeceklerdir. Bu yöntem için ilk olarak, yüzlerce Petri kabında ortamı değiştirmek zorunda kaldıktan sonra aklımıza geldi. Sıvı kristal elastomerlerin, çok fazla Petri kabının kullanımını ortadan kaldırmak için 3D bir ağ üzerinde kas hücrelerini destekleyip destekleyemeyeceğini merak ettik.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü bazı adımlar kimyasalların dikkatli bir şekilde manipüle edilmesini gerektirir. Ayrıca, metal köpük şablonunu şekillendirmek zor olabilir. İlk olarak, 20 mililitrelik bir ampulü toluen içinde hacimce% 2'lik bir PFOTES çözeltisi ile doldurun.

Ampulün içini silanize etmek için solüsyonu ampulde 24 saat karıştırın. Sililanize ampulü izopropil alkolle durulayın ve 140 santigrat derecede 30 dakika kurutun. Kuru ampule 3.64 gram damıtılmış epsilon-kaprolakton, 0.5 gram alfa-kloro-epsilon-kaprolton ve 0.25 mililitre gliserol yerleştirin.

Karışımı bir dakika boyunca girdaplayın. Daha sonra, karışıma 4.90 gram DL-laktid ekleyin ve ampul atmosferini bir dakika boyunca nitrojen gazı ile temizleyin. Ampul açıklığını alüminyum folyo ile kapatın ve DL-laktidi eritmek için karışımı yaklaşık iki saat boyunca 120 santigrat derecede ısıtın.

Erimemiş katıları parçalamak için karışımı vorteksleyin ve ardından ampule 66 mikrolitre 10-2-etilheksanoat ekleyin ve tekrar girdap yapın. Ampulü alüminyum folyo ile kapatın ve DL-laktidi yeniden eritmek için karışımı 120 santigrat derecede 10 dakika ısıtın. DL-laktid tekrar eridiğinde, karışımı kuvvetlice girdap haline getirin ve ampul atmosferini nitrojen gazı ile temizleyin.

Ampulü kauçuk bir septum ile kapatın. Septumdan bir vakum hattına bağlı bir iğne sokun ve vakumu başlatın. Kauçuk tıpayı eritmemeye dikkat ederek ampulün boynunu alevle kapatın.

Boyun kapatıldıktan sonra, reaksiyon karışımını 48 saat boyunca 140 santigrat derecede ısıtın. Ardından karışımın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ampulü kırın ve viskoz reaksiyon karışımını 10 mililitre diklorometan içinde çözün.

Karışımı bir ayırma hunisine aktarın. Metanolü yaklaşık eksi 78 santigrat dereceye kadar soğutmak için kuru buz ve aseton banyosuna 100 mililitre metanol içeren bir şişe yerleştirin. Metanol soğuduktan sonra, ayırma hunisini şişenin üzerine sabitleyin.

Reaksiyon karışımını her saniye iki damla oranında soğuk metanole ekleyin. Elde edilen beyaz çökeltiyi filtre kağıdı üzerinde toplayın. Üç kollu alfa-kloro SBC ürününü elde etmek için çökeltiyi 50 ila 60 santigrat derece arasında bir vakumlu fırında kurutun.

Alfa kolesteril üç kollu SBC'yi hazırlamak için, asılı klor atomu bir azid ile değiştirilir. Kolesteril 5-heksinoat ile bir tıklama reaksiyonu, sıvı kristal kısım olarak bir kolye kolesteril ile sonuçlanır. Sıvı kristal elastomer iskeleyi hazırlamaya başlamak için, 0.75 gram alfa-kolesteril üç kollu SBC'yi 0.25 mililitre HDI ve 0.24 mililitre damıtılmış epsilon-kaprolakton ile birleştirin.

Buna 60 mikrolitre 10-2-etilheksanoat ekleyin ve karışımı girdaplayın. Ardından, bir santimetreye dört santimetrelik bir nikel metal köpük parçası kesin. Sıvı kristal elastomer köpük iskele için bir şablon oluşturmak üzere nikel köpüğü bir santimetre çapında ve bir santimetre yüksekliğinde bir silindire yuvarlayın.

Şablonu bir cam şişeye veya alüminyum folyo muhafazaya yerleştirin ve sıvı kristal elastomer karışımını tamamen kaplanana kadar şablonun üzerine dökün. Şablonun sıvı kristal elastomer karışımında iki dakika bekletin ve ardından fazlalığı bir pipetle alın. Karışımı ve şablonu gece boyunca 80 santigrat derecede ısıtın.

Ardından alüminyum folyoyu soyun veya camı kırın. Nikel metal şablonu ortaya çıkarmak için fazla sıvı kristal elastomeri çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Köpüğü bir şişeye yerleştirin ve 70 mililitre doymuş sulu demir üç klorür çözeltisi ekleyin.

Nikel şablonunu çözmek için köpüğü çözelti içinde oda sıcaklığında üç gün boyunca karıştırın. Her 24 saatte bir, köpüğü deiyonize suda 30 dakika karıştırın ve ardından taze demir üç klorür çözeltisinde karıştırmaya devam edin. Karıştırmanın ikinci gününden sonra, sıvı kristal elastomer köpük üzerinde dokunsal bir sıkıştırma testi yapın.

Dokunsal sıkıştırmaya karşı direnç, nikel şablonunun köpükte hala mevcut olduğunu gösterir. Üçüncü günden sonra, tüm nikel şablonu elimine edildi ve elde edilen köpük çok yumuşak ve tamamen sıkıştırılması kolay görünüyor. Nikel şablonu tamamen ortadan kaldırılmalıdır.

Dokunsal bir sıkıştırma testi yapıldığında sıvı kristal elastomer köpüğü demir klorür içinde dokunulamayacak kadar yumuşak olana kadar iyice durulamak önemlidir. Sıvı kristal elastomer köpük iskele artık karakterize edilmeye ve kullanılmaya hazırdır. Sıvı kristal elastomer köpük yumuşadığında, sterilize etmek için %70 etanol ile durulayın.

Tohumlama prosedürüne başlamak için, elastomer yüzeyleri sterilize etmek için sıvı kristal elastomer köpük iskeleleri bir mililitre %70 etanol içinde iki kez tekrar yıkayın. Ardından, iskeleleri 10 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın. İskeleleri bir mililitrelik başka bir %70 etanol ile yıkayın.

İskeleleri her biri bir mililitre steril su ve fosfat tamponlu tuzlu su ile durulayın. Sterilize edilmiş sıvı kristal elastomer iskeleleri 24 oyuklu kültür plakalarına yükleyin. Penisilin ve streptomisin ile uygun hücre büyüme ortamında ilgilenilen hücrelerin bir süspansiyonunu hazırlayın ve sayın.

Büyüme ortamı kullanarak hücre süspansiyonunu 1.5 kez, 100 mikrolitre başına beşinci hücreye kadar seyreltin. Her bir sıvı kristal elastomer iskelenin üzerine bir damla seyreltilmiş hücre süspansiyonu bırakın. Tohumlanmış sıvı kristal elastomer iskeleleri 37 santigrat derecede %5 CO2 atmosferinde iki saat inkübe edin.

Her iskeleye 0,5 mililitre daha büyüme ortamı ekleyin ve inkübasyona devam edin. Her 48 saatte bir, tohumlanmış iskeleleri bir mililitre PBS ile yıkayın ve taze büyüme ortamı ekleyin. Hücreler mikroskopi için hazır olana kadar iskeleleri inkübe etmeye devam edin.

Bu smetetik LC'ler, hücre büyümesini ve çoğalmasını teşvik ederken karmaşık doku yapılarının incelenmesini sağlar. Hücre canlılığını korumak için köpükler sterilize edilmeli ve kültürlerin temizliği her zaman korunmalıdır. Mikroskopiye hazırlanmak için, hücreleri PBS'de% 4'lük bir paraformaldehit çözeltisi ile 15 dakika boyunca iskelelere sabitleyin.

Numuneleri üç kez üç mililitre PBS'de beş dakika bekletin. Bir iskele örneğini bir Eppendorf tüpüne yerleştirin. Numuneyi 500 mikrolitre PBS'de 10 dakika boyunca% 0.1 DAPI çözeltisi ile boyayın.

Numuneyi iki kez bir mililitre PBS'de beş dakika bekletin. Ardından, numuneyi hemen konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Örneğe yayılan görüntü yığınlarını alın ve verileri bir görüntü işleme programında analiz edin.

Sıvı kristal kısımlara sahip üç kollu bir SBC, çapraz bağlayıcı olarak HDI ile bir nikel köpük şablon üzerine döküldü. Nikel şablon, sıvı kristal elastomer köpüğü elde etmek için aşındırma yoluyla çıkarıldı. Aşındırma işlemini izlemek için periyodik olarak sıkıştırma deformasyon testi yapılmıştır.

Nikel tamamen çözüldükten sonra, sıkıştırma deformasyon testi, sıkıştırıldığında boyutta %70'lik bir azalma gösterdi. Sıkıştırmayı serbest bıraktıktan sonra, sıvı kristal elastomer köpük sürekli olarak orijinal boyutunu ve şeklini geri kazandı. Bu davranış, kolesterol epsilon-kaprolakton kısmından yoksun benzer elastomer köpükler sıkıştırmadan kurtulmadığından, sıvı kristal kısımlara atfedilir.

İç köpük morfolojisinin SCM'si, birbirine bağlı içi boş köpük payandalar ağı gösterdi. Düzenli morfoloji, nikel köpüğün yapısına atfedildi, bu da gözenek boyutunun ve genel şeklin uygun bir metal şablonun seçilmesiyle kontrol edilebileceğini gösteriyor. Köpük, iki gün içinde ağın duvarlarına bağlanan nöroblastom hücreleri ile tohumlandı.

Tohumlamadan 30 gün sonra, konfokal mikroskopi, hücrelerin sıvı kristal elastomer ağı boyunca uzandığını ve elastomer köpük boyunca dağılmış çok sayıda katman oluşturduğunu ortaya çıkardı. Hücre çekirdeğinin uzaması gözlendi ve hücre hizalaması ile ilişkilendirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç ila dört hafta içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, belirli gözenek boyutları ve morfolojileri ile sıvı kristal elastomer hücre iskelelerinin nasıl tasarlanacağını ve hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, her bir ürünü tam olarak karakterize etmek ve hücre canlılığını ve genişlemesini izlemek önemlidir. Ayrıca, konfokal mikroskopi görüntülerini kolayca elde etmek için uygun boyama tekniği önemlidir.

Bu prosedürü takiben, sıvı kristal elastomerler, sıvı kristal elastomerlerin anizotropik moleküler sıralamasının hücre tepkisini nasıl etkilediğine dair ek soruları yanıtlamak için stres veya manyetik ve elektrik alanlar gibi dış uyaranlara da maruz bırakılabilir. Bu tekniğin sonuçları, dış ajanların simüle edilmiş hastalık aktivitesi ve sonraki onarım süreçleri üzerindeki etkilerini dinamik olarak incelemek için bir platform sağladığından, hastalık süreçlerinin incelenmesi için geçerlidir. Bu smektik sıvı kristal elastomer köpük, hücre-hücre etkileşimleri hakkında bilgi sağlayabilse de, yarı iletken veya metal nanoyapılar gibi diğer malzemelerle de kullanılabilirler.

Bu teknik, geliştirilmesinin ardından biyomedikal alanlardaki araştırmacıların canlı sistemleri yansıtan uzun vadeli deneysel platformlar tasarlamasının önünü açtı.