Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda potansiyel fosforilasyon bölgesini eş zamanlı olarak değerlendirmek ve fosforilasyon bölgesi mutantları ile yapılacak sonraki doğrulamalar için bölgeleri belirlemektir. Bu yöntem, biyokimya ve hücre biyolojisi alanlarında, post-translasyonel modifikasyonların hücre sinyalizasyonundaki rolüne ilişkin temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, ilgilenilen protein ve fosforilasyon bölgeleri için bütçe dostu ve kolay bir ön tarama imkanı sağlar.

Fosforilasyon, insan hastalıklarındaki sinyal yolaklarında önemli bir biyokimyasal olay olduğundan, bu tekniğin etkisi inflamasyon ve kanser dahil olmak üzere hastalıkların teşhis ve tedavisine kadar uzanmıştır. Uygulamaya, laboratuvarımdan siteye özgü mutajenez gerçekleştiren lisansüstü öğrencisi Sol-Bi Shin yardımcı olacaktır. Öncelikle; 50 nanogram plazmid pGEX JST NRF2, 125 nanogram ileri primer, 125 nanogram geri primer, bir mikrolitre DNTP karışımı, 2.5 ünite PFU DNA polimeraz ve 10x reaksiyon tamponunu buz üzerinde birleştirin.

Hacmi 50 µL'ye tamamlamak için steril distile su ekleyin. Mutant zinciri dahil etmek için PCR uygulayın ve ardından örneği buz üzerinde iki dakika boyunca soğutun. Soğutulmuş örneğe bir µL DPNI restriksiyon enzimi ekleyin.

Örneği hafifçe pipetleyerek karıştırın ve ardından örneği 13,000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Ebeveyn çift zincirli DNA'yı sindirmek için örneği 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Ardından endA1 ve RACA1 mutasyonlarına sahip süperkompetan E.coli hücrelerini buz üzerinde karıştırın. Soğutulmuş hücrelere 50 µL reaksiyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.

Bu sırada, bir ısıtma bloğunu 42 °C'ye önceden ısıtın. İnkübasyon tamamlandığında, karışımı 42 °C'de 90 saniye boyunca ısıtın ve ardından karışımı buz üzerinde iki dakika soğutun. Transforme edilmiş hücrelere önceden ısıtılmış Lysogeny broth ekleyin.

Karışımı, 180 RPM'de çalkalayarak 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Ardından hücreleri LB ampicillin agar plaklarına yayın ve plakları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Tek bir koloniyi beş ml ampicillin içeren Lysogeny broth içerisine aktarın.

Numuneleri 180 RPM'de çalkalayarak 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. DNA sekans analizi için standart bir mini prep kiti kullanarak numune DNA'sını ekstrakte edin. Mutant sekansını doğrulamak için bir DNA analizöründe en az 200 ng HDNA konstrüktunu çalıştırın.

Doğrulanmış mutant NRF2 proteinini eksprese edin ve saflaştırın. Kinaz assay'ine geçmeden önce üretilen mutasyona uğramış NRF2 miktarını belirleyin. Peptid kompetisyon assay'ine başlamak için, 500 micromolar adenozin monofosfat konsantrasyonuna sahip 5X kinaz tampon çözeltisi hazırlayın.

Ardından, dondurulmuş AMPK yabani tip insan NRF2 örneklerini ve NRF2'nin AMPK fosforilasyon bölgelerini taklit eden üç oligopeptidi çözdürün. Her bir peptit için, buz üzerinde olacak şekilde, 0,43 miligram peptiti 0,15 mikrogram AMPK, 0,4 mikrogram NRF2 ve altı mikrolitre 5X Kinaz Tamponu ile birleştirin. Nihai hacmi 30 mikrolitreye tamamlamak için steril distile su ekleyin.

Ardından, korumalı bir alanda, bir ısıtma bloğunu 30 °C'ye ayarlayın. Her tüpe bir mikroküri gama 32P ATP ekleyin ve her çözeltiyi pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Reaksiyon karışımlarını 30 °C'de 15 ila 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında %7,5'lik STS PAGE jeli hazırlayın. Ardından, kinaz reaksiyonunu durdurmak için her tüpe üç mikrolitre 10X STS örnek tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Örnekleri jelde 20 dakika boyunca 70 volt ve ardından bir saat boyunca 140 volt ile yürütün.

Jel elektroforezi tamamlandıktan sonra, bromofenol mavisi çizgisinin altında kalan yüksek radyoaktif jeli dikkatlice çıkarın. Jeli döküm kalıbından bir cam tüpe nazikçe aktarın. Jeli %50 metanol, %40 su ve %10 asetik asit içeren bir çözelti içinde 20 dakika boyunca sabitleyin.

Ardından jeli nazikçe filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve şeffaf streç filmle örtün. Jeli, vakumlu bir jel kurutucuda 80 °C'de bir saat boyunca kurutun. Kuruyan jeli, sırasıyla yaklaşık 16 saat boyunca bir fosfor ekrana veya bir x-ışını filmine maruz bırakın.

Ekranın yüksek çözünürlüklü bir TIFF veya Bitmap dosyasını oluşturmak için bir Fosforimager kullanın. AMPK aktivite analizine başlamak için AMPK ile mutant ve yabanıl tip GST NRF2 örneklerini buz üzerinde çözdürün. 0,4 µg mutant GST NRF2'yi, 0,15 µg AMPK ve altı µL 5X Kinaz tamponu ile birleştirin.

Hacmi 30 µL'ye tamamlamak için steril distile su ekleyin. Bu yöntemle, 0.4 µg vahşi tip GST NRF2 içeren başka bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Her bir reaksiyon tüpüne bir microcurie gamma 32P ATP ekleyin.

Karışımları pipetle birkaç kez yukarı-aşağı çekerek karıştırın ve ardından karışımları kısa süre santrifüjleyin. Karışımları korunaklı bir alanda 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından kinaz reaksiyonunu üç µL 10X STS örnek tamponu ile sonlandırın. Kompetitif kinaz analizi ile aynı koşulları kullanarak STS PAGE uygulayın, jeli sabitleyin ve jeli kurutun.

Jeli gece boyunca bir fosfor ekrana maruz bırakın ve ekranı Phosphorimager ile tarayın. İnsan NRF2 üzerindeki AMPK fosforilasyon bölgelerini taklit eden üç adet 10 kalıntılı oligopeptidin varlığında in vitro bir AMPK analizi gerçekleştirilmiştir. Serine 558 bölgesini taklit eden oligopeptit, AMPK fosforilasyonu için en yüksek kompetisyonu sağlamıştır.

Serin 558'in alanin ile değiştirildiği bir NRF2 mutantı sentezlenmiş ve bir in vitro aktivite testi ile değerlendirilmiştir. S558 A mutantının AMPK fosforilasyonunun çok az olduğu gözlemlenmiş, bu durum AMPK'nın insan NRF2'yi doğrudan Serin 558 konumunda fosforile ettiğini göstermiştir. Peptitler proteinlere kompetitif olarak bağlandığından, bu yöntemin prensibi asetilasyon ve lizin kalıntıları gibi diğer post-translasyonel modifikasyonların ve protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesinde de uygulanabilir.

Radyoizotoplarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirmeden önce radyoizotop güvenlik eğitimi alınmış olmalıdır.