Hücre kültür manken direnç arter

Bu tekniğin genel amacı, küçük çaplı dirençli arterlerde meydana gelen miyoendotelyal bağlantılar oluşturmak için endotel ve düz kas hücrelerini in vitro olarak birlikte kültürlemektir. Bu yöntem, protein lokalizasyonu ve arter duvarındaki sinyal kaskadlarının aktivasyonu gibi kardiyovasküler alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, miyoendotelyal bileşke fraksiyonlarını endotel ve düz kastan spesifik olarak izole edebilmenizdir, bu da gerçek bir arter kullanarak yapılması imkansızdır.

Bir parafin gömmenin görsel gösterimi özellikle kritiktir, çünkü gömme adımlarının süreci görmeden öğrenilmesi zor olabilir. 150 milimetre petri kaplarına ve kapaklarına dezenfektan püskürterek ve ardından bir kağıt havlu veya tüy bırakmayan mendillerle silerek vasküler hücre ko-kültürünün veya VCCC'nin yapımına başlayın. Ardından, petri kaplarına %70 etanol püskürtün ve kuruması için davlumbazın içine yerleştirin.

Steril koşullar altında filtre eklerinin plakasını açın. Filtrelerin alt tarafını, yan yarıklardan plakanın dibine bir mililitreye kadar fiberaktin çözeltisi pipetleyerek fiberaktin çözeltisi ile kaplayın. Filtrenin alt yarısının kapatıldığından emin olun ve plaka kapağını koruyarak ekleri davlumbazda bırakın.

Fiberaction solüsyonu ile 30 dakikalık işlemden sonra, filtre eklerini bozmadan fazla solüsyonu vakumlayın. Ardından, filtreleri temiz petri kabının alt yarısına yerleştirerek plakayı ters çevirin. 225 santimetre karelik bir düz kas hücresi şişesini üç mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA çözeltisi ile tripsine edin.

Hücreler kalktıktan sonra, tripsini nötralize etmek için dokuz mililitre SMC ortamı ekleyin. Konik bir tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Ardından, hücre sayısını belirlemek için 10 mikrolitreyi bir hemositometreye pipetleyin.

Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, her bir filtrenin alt tarafına yaklaşık 75.000 düz kas hücresi içeren 750 mikrolitre hücre süspansiyonunu dikkatlice kaplayın. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci günde, temiz altı kuyulu bir plakanın her bir kuyusunu iki mililitre taze önceden ısıtılmış SMC ortamı ile doldurun.

Ortamı emerek bir ek parçadan çıkarın ve SMC ortamı ile altı kuyulu plakaya aktarın. Eklerin üst tarafına bir mililitre %0,5 sığır jelatin çözeltisi ekleyin ve en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yerleştirin. 225 santimetrelik bir endotel hücresi şişesini üç mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA çözeltisi ile tripsinize edin.

Hücreleri plakadan kaldırmak için şişeye hafifçe vurarak. Hücreleri EC ortamında yeniden süspanse ettikten ve bir hücre sayımı yaptıktan sonra, jelatini filtreden çıkarın. Ardından, her bir filtre elemanının üst tarafına bir mililitre hacimde 360.000 EC plaka.

Hücrelerin 24 saat boyunca 37 santigrat derecede rahatsız edilmeden kuluçkaya yatırılmasına izin verin. Hücre kültürü davlumbazındaki altı oyuklu bir ek plakadan ortamı emerek fraksiyonlamaya başlayın ve ardından buz üzerinde soğuk bir odaya taşıyın. Soğuk odada, eklerin SMC tarafına 10 mikrolitre PBS pipetleyin.

SMC'leri kazımak için hücre kaldırıcıyı kullanın. Daha sonra, hücreleri sıyırıcıdan lizis tamponu içeren etiketli bir petri kabına aktarın. Hücre sıyırıcı lizis tamponuna dokunduktan sonra, kağıt havlu üzerinde tamamen silinip kuruyana kadar ek filtreye dokunmasına izin vermeyin.

Kalan SMC hücresi kalıntılarını tamamen temizlemek için SMC filtresinin hurdaya çıkarma işlemini bir veya iki kez daha tekrarlayın. Ardından, 10 mikrolitre PBS'yi ek filtrenin endotel hücre tarafına pipetleyin. Hücreleri, az önce gösterildiği gibi, uygun şekilde etiketlenmiş bir lizis tamponu petri kabına kazıyın.

Pipet ile filtrenin EC tarafından hücre bulamacını toplayın ve uygun şekilde etiketlenmiş bir petri kabına aktarın. Miyoendotelyal bağlantı fraksiyonunda minimum hücre kontaminasyonunu sağlamak için filtreleri her iki tarafından hücreleri sıyırma konusunda çok dikkatli olun. Ardından, filtreleri plastik parçadan kesmek için neşteri dikkatlice kullanın.

Bunu, plastikten %70 ila 80'ini keserek ve filtreyi plastik ek yapıdan tamamen çekmek için forseps kullanarak yapın. Her filtreyi, lizis tamponu içeren etiketli 50 mililitrelik konik bir tüpe yönlendirin. Filtrelerin tampona daldırıldığından ve ıslak kaldığından emin olun.

Tüm hücreler filtrelerden toplandıktan sonra, 50 mililitrelik MEJ tüpünü 15 saniye boyunca veya iyice karışana kadar tam güçte girdaplayın. Filtreleri forseps ile MEJ konikinden çıkarın, tüpte maksimum miktarda protein ve sıvı bırakacak şekilde tüpün yan duvarları boyunca sürükleyin. Tüm filtreler MEJ konik tüpten çıkarıldıktan sonra, tüm sıvıyı ve proteinleri tüpün dibine çekmek için bir santrifüjde hızlı bir dönüş yapın.

Sıkma işleminden sonra, MEJ tüpünün içeriğini ve SMC ve EC petri kaplarını ayrı daha küçük santrifüj tüplerine aktarın. Ardından, tüpleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 16.000 x G'ye yakın bir sıcaklıkta santrifüjleyin. Süpernatanları çıkarın.

Daha sonra, bir bizçinkolik tahlil kullanarak protein içeriği için tahlil hücresi lizatları. VCCC inkübasyonunun beşinci gününde, durulanmış bir filtre eki içeren her bir oyuklara% 4 PFA ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Yaklaşık 24 saat sonra, ekleri en az 24 saat boyunca %70 etanole aktarın.

Filtreleri otomatik bir doku işlemcisinde uzun süre işleyin. Çalıştırmadan sonra, filtreyi kenarda tutmak için forseps kullanarak bir filtreyi kasetinden çıkarın ve ardından filtreyi makasla ikiye bölün. İki yarının her birini soğuk bir tabağa koyun ve gömme kalıbını sıvı parafin ile doldurun.

Doldurulmuş gömme kalıbına soğuk plakaya çok kısa bir süre dokunun, ardından filtrenin merkezden kesitli olduğundan emin olmak için filtrenin her iki yarısını kesik tarafı aşağı bakacak şekilde gömme kalıbına gömün. Parafin tek başına duracak kadar soğuyana kadar yarımların birbirine düşmesini önlemek için filtreyi yerinde tutmak için forseps kullanın. Ardından, gömme kalıbını tamamen katılaşana kadar soğuk bir tabağa taşıyın.

Filtrelenmiş eki dikey yönde gömün ve bölümlere ayırın. Kesitten sonra, VCCC transvers immünofloresan için immün boyalanabilir. Bu immünotransmisyon elektron mikroskobu görüntüsü, siyah noktalar olarak görünen altın boncuklarla etiketlenmiş MEJ'de alfa globin ekspresyonu olan bir fare arterini göstermektedir.

Bu western blot, plazminojen aktivatör inhibitörü bir ekspresyonun, EC veya SMC fraksiyonlarına karşı MEJ fraksiyonunda zenginleştirildiğini göstermektedir. Plastik EC, MEJ oluşturmayan plastik bir tabak üzerinde yetiştirilen EC'leri gösterir. İmmün boyama, VCCC modelinin sıkı bölümlere ayrılmasını ortaya koymaktadır.

Alfa-1 adrenerjik reseptör sadece düz kas hücre tabakasında görülür, bradikinin reseptörü sadece endotel hücre tabakasında görülür. F aktin boyama, beyaz okla gösterildiği gibi in vitro MEJ'de her iki hücre tipi boyunca da görülür. Bu prosedürü denerken, hasat zamanına kadar her şeyi steril tutmayı, hücreleri dikkatlice kaplamayı ve filtreleri iyice kazımayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, protein lokalizasyonu, ekspresyon seviyeleri veya aktivasyon gibi ek soruları yanıtlamak için western blotlama veya immünofloresan gibi diğer yöntemler uygulanabilir.