Name: Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin fare iskelet kası fiber türlerini yarı otomatik algoritma ile hızlı analiz yöntemini. Myosin ağır zincir izoformları için immünohistokimya kullanarak morfoloji ve kompozisyonu değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Boettcher Vakfı ve amyotrofik Lateral skleroz Derneği (#17-II-344) bu araştırma verdikleri destek için minnettarız.

fareler içeren tüm yordamları Colorado Üniversitesi-Anschutz tıbbi kampüs kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi (91813(05)1D).
 1. gün 1: İlköğretim (1°) sığır Serum Albumin (BSA) engelleme ile Immunostaining fare hindlimb kas (örneğin, tibialis anterior, soleus) <ol><li>Air-dry donmuş bölümlerini monte için şarj edilmiş slaytlarda ~ 30 dk 11. bir hidrofobik bariyer PAP kalem kullanma bölümlerine bir kenarlık çiz.</li>
	<li>Yer ~ 250 µL % 5 BSA/fosfat tamponlu tuz (BSA/PBS) non-spesifik antikor bağlama engellemek için her bir slayt. Slaytlar, oda sıcaklığında 1 h. için kuluçkaya</li>
	<li>Engelleme iken, 1:50 hazırlamak dilutions 1° antikor süpernatant % 5'in BSA/PBS (tüm fare monoklonal antikorlar; bkz. Tablo 1 6 , 12); in 250 µL hazırlamak çözüm slayt başına. 1 ° antikor stokları ve dilutions buz üzerinde tutmak</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> Tablo 1: birincil MyHCs ayırt etmek için kullanılan antikorlar.
<ol start="4"> <li>% 5 BSA/PBS engelleme çözüm aspirasyon 1 ° antikor seyreltme 250 µL uygun slaytlara ekleyin. 250 eklemek µL % 5'lik BSA/PBS ikincil (2°) salt antikor negatif kontrol için slaytlar.</li>
	<li>Incubate için 24-48 h nemli bir ortamda 4 ° C'de. 
	Not: Alüminyum folyo nemlendirilmiş filtre kağıdı ile kaplı bir petri uygun kuluçka odası hizmet verebilir.</li>
</ol> 2. Gün 2:2 ° floresan antikor ile Immunostaining <ol><li>Aspire 1° antikor çözüm ya da %5 BSA/PBS çözüm kontrol. Yıkama tüm slaytlar üç kez, 10 min %5 BSA ile.</li>
	<li>Yıkama sırasında arıtılmış, fluorophore Birleşik 2 ° antikorlar % 5, 1: 200 dilutions hazırlamak BSA/PBS (bkz. Tablo 2, tüm keçi Anti-fare vardır). Çözüm slayt başına 250 µL hazırlayın. Buz üzerinde 2 ° fluorophore Birleşik antikorlar anlatmamanı</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> Tablo 2: Fluorophore Birleşik ikincil görselleştirmek birincil antikor tanıma, MyHCs için kullanılan antikorlar.
<ol start="3"> <li>üçüncü uygulama %5 BSA/PBS engelleme çözümün aspirasyon 2 ° antikor seyreltme 250 µL tüm slaytlara ekleyin. Karanlık, nemli bir ortamda oda sıcaklığında 90 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Aspire edin 2° antikor çözüm. Yıkama tüm slaytlar üç kez, % 5 ile 10 dk BSA/PBS.</li>
	PBS ile <li>durulama. 10 dakika süreyle kuru</li>
	<li>Coverglass bir kalıcı olmayan, düşük viskozite sulu montaj orta ile mount.</li>
	<li>Zaman kuru, slayt kenarları oje ile kapatın. Kuru ve mağaza içinde karanlık bir slidebox.</li>
</ol> 3. Epifluorescence mikroskobu ile slaytlar Imaging <ol><li>temiz bir bezle küçük, % 70 etanol bulanmış laboratuvar-slaytlar.</li>
	<li>İmmunostained kas bölümlerin (Tablo reçetesi görmek) bir fotoğraf cihazları ile donatılmış bir epifluorescence mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edilir.
	<ol><li>Yaklaşık 1 mm 2 (10 X amaç, 1.4 NA) alanı seçin.</li>
		<li>View 2° Alexa 488 Birleşik antikor floresan bir 505 üzerinden nm uzun geçiren Filtre. Uyarma 595 nm uzun geçiren Filtre üzerinden 2 ° Alexa 594 Birleşik antikorların tarafından oluşturulan Floresans görüntüleyin. Görüntüleri dijital ortama uyumlu bir görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar ile. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı daha sonraki analizler için ölçek çubuğu içerir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Fiji görüntülerle analizi Not: analizi ile devam etmeden önce Fiji (serbestçe Ulusal Sağlık enstitüleri, Bethesda, MD kullanılabilir) https://imagej.net/Fiji/Downloads yüklenmesi gerekir. Bu süreç içinde kullanılan makro içinde belgili tanımlık Ek dosya mevcuttur. Makro dosyasını kolayca erişilebilir bir dizine yerleştirin.
Seçilen kısımda Fiji <ol><li>yük bir aydınlık alan görüntüsü. Eklentileri gidin &#8594; segmentasyon &#8594; öğretilebilir Weka segmentasyon.</li>
	Bölüm, hücresel alanlarında şart için <li>bir kumaş üzerinde bir çizgi çizin ve'ı tıklatın &#34; class 1 Ekle &#34;. O zaman, uzay lifler arasında bir çizgi çizin ve'ı tıklatın &#34; class 2 Ekle &#34; ekstrasellüler etki alanları işaretlemek için. Her sınıfta 5-10 etiketleri kadar yineleyin.
	<ol><li>Tıklayın tren Sınıflandırıcısı. Elde edilen kırmızı ve yeşil yerleşim üzerinde daha fazla etiket el ile eklemek (bkz. Adım 4.2) görüntü, gerekirse yanlış kesimli bölümlerine. Lifleri (kırmızı) uygun şekilde lifleri (yeşil) arasındaki boşluğu ayrılır kadar yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>'I tıklatın &#34; olasılık almak &#34; ve görüntü yeni etiketli bir klasöre kaydedin.</li>
	<li>İle aynı alandan alınan floresan görüntü (Adım 4.2-4.3) Yukarıdaki yordamı yineleyin. Etiket immunostained lifleri olarak &#34; sınıf 1 &#34; ve tüm sigara floresan bölgeleri olarak &#34; sınıf 2 &#34;. Elde edilen olasılık harita işlenmiş aydınlık alan görüntünün depolandığı klasöre kaydedin.</li>
	<li>Önceden kaydedilmiş olasılık haritalardan biri Fiji'de açın. Düşsel bilgisayar yazılımı tarafından sağlanan ölçek çubuğu üzerinde düz bir çizgi çizin. Analiz gitmek &#8594; ayarla ölçek. Ölçek çubuğu tarafından verilen uygun değerlerine (Yani, bilinen mesafesi, uzunluk birimi) parametreleri değiştirmek sonra kontrol &#34; Global &#34; kutusunu her görüntü için ölçek standartlaştırmak için.</li>
	<li>Eklentileri gidin &#8594; makroları &#8594; çalıştırmak &#8594; Tyagi'yi vd. fiber miktar macro.ijm (Ek dosya bakın). Hemen, bir gezinti bölmesi görünür. Açık belgili tanımlık imge &#39; s ana klasör; bir iletişim kutusu görüntülenir. Her iletişim kutusu için değiştirmek &#34; arka plan &#34; açılan değerine &#34; ışık. &#34; Not: klasörü şimdi görüntüler fiber özetliyor ve elektronik yazılım dosyaları (CSA ve Feret çapı için en uygun sonuçları ile doldurulur lif morfolojisi miktarının; ölçülen parametreler analiz ayarla ölçümlerde ayarlanabilir). Fiji gözenek analiz işlevi kullanılarak oluşturulan lif morfolojisi veri otomatik olarak her iki floresan ve parlak alan görüntüler için elektronik tablo yazılımı dosyalar için transfer.</li>
	<li>Lifleri floresan lifleri alanındaki sayıya karşılık gelen parlak alan resimdeki toplam liflerinin sayısı bölerek bir alanda belirli bir MyHC ifade kısmını hesaplamak.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li>
<li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li>
<li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li>
<li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="https://skeletalmusclejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13395-014-0027-1">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li>
<li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li>
<li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li>
<li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li>
<li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/228866300_Skeletal_muscle_fiber_types_in_C57BL6J_mice">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.

Burada, bizim iskelet kas lif türleri tanımlanması için yararlı yön vermişlerdir. Bunu yaparken, biz veri analizi için yeni bir algoritma tanımlamak.
Bizim sonuçları büyük ölçüde bu önceki raporlar5,8,10 onaylayın ve bizim kendi el ile ölçümleri yansıtmak beri algoritma doğru gibi görünüyor. Yine de, yapı kesit sonucu belirsiz fiber Kenarlıklar dahil olmak üzere bazı nadir deneysel tuzaklar ile karşıl...

Kas iskelet birçok türleri1tek liflerinin oluşan bir süredir bilinmektedir. Başlangıçta, iki grup liflerinin contractile özelliklerine göre karakterize ve adli, uygun şekilde, yavaş seğirme (tip ı) ve hızlı-seğirme (tip II). Bu kategoriler daha fazla lif metabolizma temelinde ayırt edildi. Beri tip ı lifleri mitokondri içinde zengin ve oksidatif metabolizma güvenen, onlar sağlam olumlu Nikotinamid adenin dinükleotit-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) diaphorase2 ya da süksinat dehidrogenaz (SDH)3 ile aydınlatılmamıştır boyama. Buna karşılık, tip II lifleri daha az sergilenen ve değişken derece NADH-TR diaphorase veya SDH boyama ve iki fast twitch alt gruplar ayrıldı (IIA ve IIB yazın) biraz kabaca göreli oksidatif kapasite üzerinde dayalı. Bu ayrımlar lifler arasında-var daha etkili bir şekilde görselleştirildiği myosin-ATPaz boyama tarafından nerede tip ı lifleri leke karanlık pH 4.0 öncesi bir kuluçka sonra ve tip IIB lifleri absorbe pH 10.0 tip IIA lifleri ile acele aşağıdaki ön kuluçka ayda4boyama.
Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama lif tipi5ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA yazın ve tip IIB lifleri tüm hassasiyetle onların MyHC profiline göre belirlenebilir. Ayrıca, başka bir fast twitch metabolik olarak orta fiber türü, IIX, yazın tanımlanan6oldu. Birden fazla MyHC ifade karma lifler de teyit edilen5,7,8olmuştur. Kedi ve maymun gibi bazı türler değil hızlı Tip IIb MyHCs6için bilinir. MyHC immunostaining Kas kompozisyonu state-of--art değerlendirilmesi şu anda olsa da, bu tekniği ile elde edilen verilerin analizi hantal ve zaman alıcı otomatik yardımı olmadan. Bu amaçla, bu verileri çözümlemek için yarı otomatik yöntemleri bir avuç gelişmiş5,9,10olmuştur. Burada, kas lif tipi5,7,8,10, immunohistokimyasal tanımlanması için nispeten standart bir protokol ile birlikte bir roman yarı otomatik mevcut fiber türü ve lif morfolojisi analizini hassasiyetle hızlandırır algoritması.

<table><tbody><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418-100G</td><td>PBS'de %5</td></tr><tr><td>Hidrofobik Bariyer Pap Kalem</td><td>Bilimsel Cihaz Laboratuvarı</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-E</td><td></td></tr><tr><td>Bağışıklık Kazandırma</td><td>Termo Bilimsel</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Oje</td><td>L'Oreal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE-200 Ters Floresan ve Parlak Alan Mikroskobu Durdurulan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPOT RT/KE</td><td>Spot Görüntüleme Çözümleri</td><td>RT940</td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BA-F8 Birincil Antikor</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası</td> monoklonal fare IgG2b;<td></td><td> 1:50</td></tr><tr><td>SC-71 Primer Antikor</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası</td><td>monklonal fare IgG1; 1:50</td>BF-F3 Primer Antikor Gelişimsel Çalışmalar: Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası, monoklonal fare IgGM; 1:50 6H1 Primer Antikor Gelişimsel Çalışmalar: Iowa Üniversitesi'ndeki Hibridoma Bankası, monoklonal fare IgGM; 1:50 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td><td>Invitrogen</td><td>A21145</td><td>keçi anti-fare; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>keçi anti-fare; 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td><td>Invitrogen</td><td>A21044</td><td>keçi anti-fare; 1:200</td></tr><tr><td>EKİM</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>izopentan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td>sıvı nitrojen PBS ile soğutun</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP665-1</td><td>10x, 1x'e seyreltin</td></tr><tr><td>Kim mendil</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666A</td><td></td></tr></tbody></table>

fare kas iskelet morfoloji ve fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Yıllardır, iskelet kas lif türleri arasında ayrım en iyi myosin-ATPaz boyama tarafından görüntülenmiştir. Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama fiber türü daha ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA, IIX yazın yazın ve tip IIB lifleri şimdi onların MyHC profiline dayalı hassasiyetle tespit edilebilir; Ancak, bu verilerin el ile analiz yavaş ve aşağı doğru olabilir sıkıcı. Bu bağlamda, hızlı, doğru değerlendirme fiber türü kompozisyon ve Morfoloji çok arzu edilen bir araçtır. Burada, MyHCs fare hindlimb kas fiber türü ve lif morfolojisi analizini hızlandırır roman yarı otomatik bir algoritma ile uyum içinde elde edilen donmuş bölümlerinde, state-of--art immunohistokimyasal boyama için bir iletişim kuralı mevcut. Beklendiği gibi görüntülenen soleus kas-için boyama tip ı ve tip IIA lifleri, ama türü IIX ya da tip IIB lifleri için değil. Öte yandan, tibialis anterior kas türü IIX ve tip IIB liflerinin, tip IIA lifleri küçük bir kısmını ağırlıklı olarak bestelendi ve az veya hiç tip ı lifleri. Birkaç görüntü dönüşümleri lif morfolojisi (Yani, kesit alanı (CSA), maksimum ve minimum Feret çapı) farklı yönlerini ölçmek amacıyla olasılık haritalar oluşturmak için kullanılan. Bu parametreler sonra el ile elde edilen değerler ile karşılaştırıldı için elde edilen değerler. Hiçbir önemli farklılıklar analiz CSA, maksimum veya minimum Feret çapı açısından her iki mod arasında gözlendi (tüm p &#62; 0,05), bizim yöntem doğruluğunu gösteren. Böylece, bizim immunostaining Çözümleme Protokolü Kas kompozisyonu yaşlanma ve myopathy birçok model üzerinde etkileri incelenmesi için uygulanabilir.

Bilinmeyen yaş bir erkek C57BL/6 fareden kesmiştim Hindlimb kasları (Yani, tibialis anterior, soleus) sıvı azot soğutmalı isopentane bileşik kas Ekim içeren bir plastik kalıp batan tarafından dondurulmuş flaş. Sonra bir cryotome kullanarak, 8-10 µm seri bölümler-20 ° C'de kesmek ve farklı olumlu tahsil cam slayt12' ye transfer.
Bu kaslar ağırlıklı olarak hızlı ve yavaş-seğirme liflerinin, sırasıy...

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Bu protokolün genel amacı, iskelet kası lif tiplerini doğru ve hızlı bir şekilde tanımlamak için modern immünohistokimya yöntemini kullanmaktır. Bu yöntem, kas biyolojisi alanındaki lif tipi değişikliklerinin fonksiyonel protein kaybı nedeniyle tetiklenip tetiklenmediği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem pek çok kas hastalığı modeline dair içgörü sağlayabildiği gibi, tek bir molekülün temel kas fonksiyonu üzerindeki daha büyük etkisini ortaya çıkarmak için knock-in ve knock-out modelleri gibi sistemlerde de kullanılabilir.Başlangıç olarak, şarjlı lamlar üzerindeki dondurulmuş fare kası kesitlerini yaklaşık yarım saat boyunca havada kurutun. Kuruma gerçekleştikten sonra, her lamdaki kesitlerin etrafını hidrofobik bariyer PAP kalem kullanarak çevreleyin. Ardından, spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için çizilen sınırların içine yaklaşık 250 µL %5 BSA içeren PBS ekleyin ve lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Bu sırada, primer antikoru %5 BSA PBS içerisinde 1/50 oranında dilüe ederek hazırlayın. Her lam için yaklaşık 250 µL hazırlayın ve antikor dilüsyonunu buz üzerinde saklayın. Bloklama süresinin ardından, bloklama solüsyonunu lamlardan aspire edin ve 250 µL'lik antikor dilüsyonu alıkotları ekleyin.Negatif kontrol için, primer antikor içermeyen PBS içinde %5 BSA uygulayın. Ardından, Petri kabına nemlendirilmiş filtre kağıdı yerleştirin ve inkübasyon odası oluşturmak için üzerine alüminyum folyo ile kapatın. Sonrasında slaytları, bu oda içerisinde veya aynı nem düzeyine sahip benzer bir ortamda, 4 °C'de 24 ila 48 saat boyunca inkübe edin.Primer antikor inkübasyonunun ardından, solüsyonu lamlar üzerinden aspire edin ve lamları üç kez yıkayın. Her yıkama için, yaklaşık 10 dakika boyunca PBS içinde %5 BSA'dan yaklaşık 250 µL uygulayın. Lamlar yıkanırken, saflaştırılmış florofor konjugatlı sekonder antikorların 1/200'lük dilüsyasyonlarını hazırlayın.Slayt başına en az 250 µL hazırlayın ve çözeltiyi karanlıkta, buz üzerinde muhafaza edin. Üçüncü yıkamadan sonra, slaytlara 250 µL sekonder antikor dilüsyonu ekleyin. Ardından slaytları oda sıcaklığında, karanlık ve nemli bir ortamda 90 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından, antikor solüsyonunu aspire edin ve lamları daha önce olduğu gibi üç kez yıkayın. Tüm fazla sekonder antikoru yıkadıktan sonra, lamları PBS ile durulayın ve 10 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Son olarak, lamları kalıcı olmayan, düşük viskoziteli sulu bir montaj ortamı kullanarak kapatın.Besiyeri kuruduktan sonra, lamelin kenarlarını oje ile mühürleyin ve lamları opak bir saklama kutusuna aktarın. Bir lamın görüntüsünü almadan önce, lameli %70 ethanol ile temizleyin. Ardından, bir epifloresan mikroskop kullanarak dijital görüntüler elde edin.Düşük büyütme altında, bir kare milimetrelik bir ilgi alanı seçin. Alexa 488 konjuge antikorları görüntülemek için 505 nanometre uzun geçiren filtre kullanın. Alexa 594 konjuge antikorları görüntülemek için 595 nanometre uzun geçiren filtre kullanın.Filtreler uygun şekilde ayarlandıktan sonra dijital görüntüleri toplamaya başlayın. Sonraki analizler için ölçek çubuğu eklediğinizden emin olun. Analiz için, bu yayınla birlikte sağlanan makroyu Fiji'ye yükleyin.Makro dosyasını kolayca erişilebilen bir dizine kaydedin. Şimdi, seçilen bir kesitin brightfield görüntüsünü yükleyin ve eğitilebilir weka segmentasyonu seçeneğine gidin. Kesitteki hücresel alanları belirlemek için bir fiber üzerine bir çizgi çizin ve sınıf birine ekle seçeneğine tıklayın.Ardından hücre dışı bölgeleri işaretlemek için lifler arasındaki boşluğa bir çizgi çizin ve ikinci sınıfa ekle seçeneğine tıklayın. Her sınıftan 5 ila 10 etiket tanımlanana kadar bu işlemi tekrarlayın. İnterstisyel sınırları işaretlemek zor olabilir.Yakınlaştırma fonksiyonunu kullanmak, bu sınırların daha yüksek hassasiyetle işaretlenmesini sağlar. Ardından, sınıflandırıcıyı eğit (train classifier) seçeneğini belirleyin. Ortaya çıkan kırmızı ve yeşil katman üzerinde, otomatik işlem tarafından yanlış bölütlenmiş olan görüntü kısımlarına manuel olarak daha fazla etiket ekleyin.Kırmızıyla işaretli fiberler, yeşil ile işaretli ara boşluklardan uygun şekilde ayrılana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından "get probability" seçeneğine tıklayın ve görüntüyü yeni bir dosya klasörüne kaydedin. Şimdi, aynı alandan alınan floresan görüntüsünü kullanarak tüm süreci tekrarlayın.İmmün boyalı lifleri birinci sınıf ve tüm floresan olmayan bölgeleri ikinci sınıf olarak etiketleyin. Son olarak, elde edilen olasılık haritasını, işlenmiş parlak alan görüntüsünün saklandığı klasöre kaydedin. Şimdi, daha önce kaydedilen olasılık haritalarından birini Fiji programında açın.Görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan ölçek çubuğu üzerine düz bir çizgi çizin. Ölçeği ayarla (set scale) seçeneğini belirleyin ve ölçek çubuğuna göre doğru değerleri girin. Ardından, ölçeği her görüntüye standart hale getirmek için genel (global) seçeneğini etkinleştirin.Şimdi, fiber miktar belirleme için Tyagi makrosunu çalıştırın; böylece navigasyon paneli görünecektir. Ardından görüntülerin bulunduğu ana klasörü açın. İlgili iletişim kutusunda, arka plan açılır menü değerini "light" (açık) olarak değiştirin.Ölçümler set etme işlevi, hangi parametrelerin ölçülmesi gerektiğini tanımlamak için kullanılabilir. CSA ve ayak çapı, fiber morfolojisini nicelleştirmek için en uygun ölçümlerdir. Makro çalıştırıldıktan sonra, klasör fiber dış hatlarının görüntüleri ve analiz işlevi tarafından yapılan ölçümlerin yer aldığı hesap tabloları ile doldurulacaktır.Tibialis anterior ve soleus kasları, çoğunlukla ya hızlı seyirme veya yavaş seyirme liflerinden oluştukları için açıklanan yöntemler kullanılarak analiz edilmiştir. Spesifik antikorlar kullanılarak birkaç farklı miyozin ağır zinciri tanımlanmıştır. Soleus kas liflerinin önemli bir kısmı tip bir ve tip iki A miyozin ağır zincirlerini eksprese etmiş ve geri kalan liflerin hatırı sayılır bir kısmı tip iki X için pozitif çıkmıştır. Buna karşılık, neredeyse hiç tip iki B lifine rastlanmamıştır.Kıyaslama yapıldığında, boyanmış tibialis anterior kaslarının çoğunlukla tip iki B ve tip iki X miyozin ağır zincir liflerinden oluştuğu, tip iki A zincirlerini eksprese eden liflerin katkısının daha az olduğu ve tip bir zincirleri eksprese eden liflerin neredeyse hiç bulunmadığı görülmüştür. Tip iki A miyozin ağır zincirine yönelik SC-71 antikorları ile problanan bir tibialis anterior kasının morfometrik analizi, olasılık haritaları oluşturmak için kullanılan çeşitli görüntü dönüşümleri sağlamıştır. Bu kolay otomatik analiz sayesinde elde edilen verilerin, çok daha zahmetli manuel hesaplamalar kullanılarak üretilen verilerle tamamen karşılaştırılabilir olduğu kanıtlanmıştır.Toplamda, analiz yaklaşık 6.000 bireysel fiberden veri sağlamıştır. Yüksek veri çıktısı, istatistiksel analizi çok daha uygulanabilir kılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, kas kesitlerinin immün boyamasının nasıl yapılacağı ve kas fiber tipinin ve kompozisyonunun analizini kolaylaştırmak için sağlanan yarı otomatik yazılımın nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, kasın bölgesel olarak heterojen olabileceği ve kas lif tipi ile kompozisyonunun titiz bir şekilde değerlendirilmesi için birçok kas alanının analiz edilmesinin gerektiği unutulmamalıdır. Bu prosedürle birlikte, lif tipi kompozisyonundaki değişikliklerle paralel olarak fibrozis gelişip gelişmediği gibi ek sorulara yanıt bulmak amacıyla Trichrome boyama gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Bu protokol, dondurularak kurutulmuş insan iskelet kasından tek lif izolasyonunu ve nokta lekeleme tekniği kullanılarak Miyozin ağır zincir (MHC) izoformuna göre lif tipi sınıflandırmayı gösterir. Tanımlanan MHC I ve II lif örnekleri daha sonra western blotlama kullanılarak protein ekspresyonunda lif tipine özgü farklılıklar için daha fazla analiz edilebilir.

İnsan İskelet Kasının Lif Tipi Tanımlaması

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

, Izole ve en bol bulunan proteinlerin iskelet kası ifade kimliğini belirlemek için yöntemler ileri düz bir set. Yaklaşık 800 noktalar 10 mg kas iki boyutlu bir jel üzerinde ayırt bu cinsiyete özgü protein ifade belirlenmesi için olanak sağlar. Bu yöntemler çoğu dokularda eşdeğer sonuçlar verecektir.

İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Keşfedin fare iskelet kası fiber türlerini yarı otomatik algoritma ile hızlı analiz yöntemini. Myosin ağır zincir izoformları için immünohistokimya kullanarak morfoloji ve kompozisyonu değerlendirin.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

Daha fazla video keşfet