Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, vazoaktif uyaranlara karşı damar reaktivitesini test etmek için izole edilmiş direnç arterlerini kullanmaktır. Ayrıca düz kas kontrol mekanizmalarındaki ve pasif mekanik özelliklerdeki değişikliklerin nasıl değerlendirileceğini de gösterecektir. Bu yöntem, çeşitli durumlar sırasında küçük dirençli arterlerde endotelyal ve vasküler düz kas kontrol mekanizmaları ile ilgili vasküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, küçük dirençli arterlerin parankimal hücre ortamından izole edilebilmesi ve vazoaktif uyaranlara verilen yanıtlar test edilirken normal basınçlarında tutulabilmesidir. Bu tekniğin etkileri, vasküler disfonksiyonun tedavisine ve teşhisine kadar uzanır. Bu tür bir manipülasyon in vivo olarak mümkün değildir.

Bu yöntem periferik vasküler hastalık hakkında bilgi verebilse de, koroner arter hastalığına da uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü prosedürün inceliği ve artere zarar vermekten kaçınma ihtiyacı nedeniyle mikrokanülasyon adımlarının öğrenilmesi zordur. Deney gününde, iki litrelik bir Erlenmeyer şişesinde iki litre fizyolojik tuz çözeltisi hazırlayın.

20X tampon stoğunu eklerken, çözeltinin gaz karışımı ile sürekli olarak dengelendiğinden ve manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırıldığından emin olun. Ardından, karışıma 0.28 gram monosodyum fosfat eklerken pH'ı izleyin. Gerekirse, pH 7,4'te kalacak şekilde bir Pasteur pipetinden altı normal hidroklorik asit veya 6,5 normal sodyum hidroksit çözeltisi damlatarak pH'ı tozlayın.

Daha sonra fizyolojik tuz çözeltisine 1.98 gram glikoz ekleyin. Daha sonra, 20X stok çözeltisini deiyonize suda seyrelterek 500 mililitre kalsiyum içermeyen fizyolojik tuz çözeltisi hazırlayın. Ardından, bir Erlenmeyer şişesine 25 mililitre 20X tampon stoğu ekleyin ve çözeltinin pH'ını izlerken ve ayarlarken çözeltiye 0.07 gram monosodyum fosfat ekleyin.

Uygun gaz karışımını içeren bir gaz tankını organ banyosuna bağlamak için tetrafloroetilen boru kullanın. Çözeltiyi, kap haznesine akan çözeltinin sürekli, ancak türbülanslı olmayan köpürmesini sağlamak için yeterli bir oranda sürekli olarak köpürtün. Ayrıca, fizyolojik tuz çözeltisinin gaz bileşiminin korunmasına yardımcı olmak için kap haznesine dengeleme gazı karışımına bağlı küçük bir hava taşı yerleştirin.

Fizyolojik tuz çözeltisini iki litrelik bir Mariotte şişesine koyun. Fizyolojik tuz çözeltisini, çözeltiyi damar odasına sağlayan farmakolojik organ banyosuna sürekli olarak iletecek bir rezervuar görevi görmesi için bir durdurucuya merkezi bir cam tüp ekleyin. Merkezi cam tüpün ağzını Mariotte şişesine, organ banyosundaki fizyolojik tuz çözeltisinin üst kısmı ile aynı seviyeye yerleştirin.

Bu, fizyolojik tuz çözeltisinin organ banyosuna verilmesi için sabit hidrostatik basınç kafası sağlayacaktır. Fizyolojik tuz çözeltisini Mariotte şişesinden organ banyosuna vermek için J şeklinde bir cam tüpe bağlı bir polietilen tüp kullanın. Lümen bolluğu için, giriş pipetini, istenen giriş basıncını koruyan bir konuma yükseltilmiş 66 CC'lik bir plastik şırıngadan oluşan fizyolojik bir tuz çözeltisi rezervuarına bağlamak için polietilen boru kullanın.

Bir vana aracılığıyla sisteme bir basınç dönüştürücü bağlayarak basıncı izleyin. Ardından, fizyolojik tuz çözeltisinin bir basınç gradyanına yanıt olarak kaptan akmasına izin vermek için çıkış pipetini bir polietilen tüpe, giriş rezervuarına benzer bir rezervuara bağlayın. Ayrıca, çıkış basıncını izlemek için benzer bir vana ve basınç dönüştürücü bağlantısı kullanın.

Bir Sprague Dawley sıçanının beynini çıkarın ve buz gibi soğuk fizyolojik tuz çözeltisi ile doldurulmuş bir cam Petri kabına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ardından, çanağı bir stereoskopun altına yerleştirin. Orta serebral arterleri beyinden çıkarmak için bir çift Vannas makası ve bir Dumont numarası beş ince uçlu forseps kullanın.

Ardından, forseps kullanarak orta serebral arterden kalan beyin dokusunu temizleyin. Arteri, eksize edilen segmentin ucundan nazikçe tutarak damar odasına aktarın ve dikkatlice odaya yerleştirin. Daha sonra serebral arteri, uç arterin lümenine ilerleyene kadar pipet tabanına doğru çekerek giriş mikropipetine geçirin.

Daha önce arter etrafındaki 10-0 dikişlerden alınan tek iplikli bir elyaftan hazırlanan bir ilmeği bağlayarak arteri giriş pipetine sabitleyin. Ardından, orta serebral arterin karşı ucunu, damarın etrafına ikinci bir dikiş halkası sıkarak çıkış pipetine sabitleyin ve arteri yerinde uzunluğuna kadar germek için giriş pipeti tutucusuna bağlı mikrometreyi kullanın. Arterde sabit bir basınç sağlamak için 10-0 dikişlerden alınan tek iplikçikleri kullanarak tüm yan dalları bağlayın.

Daha sonra, bir video mikrometreye ve bir televizyon monitörüne bağlı bir diseksiyon mikroskobuna bağlı bir video kameradan oluşan bir video mikroskobu kurun. Arterin iç çapını ölçmek için bu kurulumu kullanın. Deneyden önce arterin uygun bir aktif ton seviyesi sergilediğinden emin olarak miyojenik tonu ve vazodilatör uyaranlara damar tepkilerini değerlendirin.

Normalde aktif dinlenme tonu göstermeyen küçük mezenterik arterler gibi damarlar hariç, istirahatte aktif tonusu olmayan arterleri atın. Daha sonra, damar odasına artan konsantrasyonlarda asetilkolin ekleyin ve kanüllü direnç arterinin endotel bağımlı reaktivitesini test etmek için damar çaplarını ölçün. Bu örnekte, arter, asetilkoline yanıt olarak dilate edememesi ile gösterildiği gibi endotel disfonksiyonu sergiler.

Deneyin sonunda, perfüzat ve süperfüzyona kalsiyum içermeyen fizyolojik tuz çözeltisi ekleyerek arterin maksimum çapını belirleyin. Aktif dinlenme tonu yüzdesini hesaplamak için bu ölçümü kullanın. Kalsiyum içermeyen fizyolojik tuz çözeltisinde maksimum genişlemenin gösterilmesi, asetilkoline yanıt olarak arterin genişleme başarısızlığının, damarın yapısal olarak yeniden şekillenmesi nedeniyle arterin gevşeyememesinden değil, endotel disfonksiyonundan kaynaklandığını doğrular.

Bu şekil, üç daralmış konjenik suştaki erkek Dahl Tuzuna Duyarlı sıçanlardan izole edilmiş orta serebral arterlerde endotel bağımlı vazodilatör asetilkoline verilen yanıtları göstermektedir. Bu, asetilkoline endotel bağımlı genişlemenin, tuza duyarlı ebeveyn suşunda ve tuza duyarlı Renan alelini tutan her iki konjenik suşta da olmadığını göstermektedir. Tuza duyarlı genetik arka planda kahverengi Norveç Renan alelini taşıyan konjenik suşta normal genişleme restore edildi ve SS sıçanlarında endotel disfonksiyonunun Renan geninin bozulmuş regülasyonuna bağlı olduğu hipotezini destekledi.

Bu deneyde, yüksek tuzlu diyetin, belirli bir sıçan suşunda asetilkoline endotel bağımlı genişlemeyi ortadan kaldırmadaki başarısızlığı, diyetle tuz alımındaki yükselmeler sırasında vasküler oksidan strese ve endotel disfonksiyonuna katkıda bulunanlarla ilgili bulgular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç ila 3 1/2 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, düz kaslara ve özellikle endotelyuma zarar vermemek için izole edilmiş arteri çok dikkatli bir şekilde kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, farklı maddelere karşı vasküler reaktiviteyi etkileyen mekanizmalar ve kan damarları üzerindeki ilaç etki mekanizmaları gibi soruları yanıtlamak için vazokonstriktör ve vazodilatör agonistlerinin veya reseptör antagonistlerinin eklenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, vasküler biyoloji ve mikrodolaşım fizyolojisi alanlarındaki araştırmacıların, deney hayvanlarının ve insanların farklı vasküler yataklarından alınan direnç arterlerinde düz kas ve endotel fonksiyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farklı vasküler yataklardan küçük dirençli arterlerde endotel ve vasküler düz kas kontrol mekanizmalarını değerlendirmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.