Name: Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Keşfedin endotel hücrelerinin antikoagülan özelliklerini, antikoagülan içermeyen tam kan kullanarak. Bu 3D hücre kültürü yöntemi, kardiyovasküler ve cerrahi araştırmalar için pahalıdır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından (SNSF, Grant No. 320030_156193) destek verdi. Yazarlar Dr Benoît Werlen Biosilon microcarrier boncuk verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Prof. Hans Peter Kohler ve Prof. André Haeberli microcarrier boncuk modelini oluşturan ayarlama konusunda yardım için teşekkür ederiz.

(yabani türü yetiştirilen yerel bir çiftlik ve transgenik yetiştirilmiş Enstitüsü moleküler hayvan ıslahı ve biyoteknoloji, Ludwig Maximilian Üniversitesi, Münih, Almanya) Alman Landrace domuzlar arasında 40 kg, 30 kg ağırlığında, içinde kullanılmıştır Bu çalışmada. Bütün hayvanlar su ve yiyecek ad lib ile standart koşullar altında muhafaza. Tüm hayvan deneyleri İsviçre hayvanları Koruma Kanunu gibi bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için İngiltere'de hayvanları Yasası (bilimsel yordamlar) ve NIH Rehberi uygun olarak yapıldı. Tüm hayvan çalışmaları varış kurallarına uyulması. Kanton veteriner hizmet (Canton, Bern, İsviçre) hayvan deney Komitesi Hayır tüm hayvan yordamları, izin onayladı. BE70/14. Deneysel protokol 3R ilkelerine göre rafine ve state-of--art anestezi ve ağrı yönetimi hayvan sayısını en aza indirmek ve deneyler sırasında stres ve ağrı hayvanların maruz azaltmak için kullanıldı.
 kan sağlıklı bireyler tarafından kapalı sistem iz Bern Üniversitesi Hastanesi İsviçre yargı ve etik kurallarına uygun olarak çizilmiş. Ifade &#34; sigara anticoagulated kan &#34; kan ile herhangi bir antikoagülan tedavi değil anlamına gelir.
 steril koşullar altında aşağıdaki adımlar gerçekleştirilir. Temel hücre kültür steril tekniği ile aşinalık gereklidir.
 1. PAEC yalıtım Not: torasik aortada kesimleri 6-10 cm euthanized Almanca Landrace domuzlar 3-6 ay yaş (diğer in vivo deneyler için kullanılan) ve hemen elde ulaşım aracını (DMEM + %1 penisilin/streptomisin) içeren bir 500 mL cam şişe içine transfer.
<ol><li>6-şey plaka fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer</li>
	<li>Önceden sıcak steril PBS 1 x ve hücre kültür orta (DMEM).</li>
	<li>Domuz aort taşıma ortamdan çıkar.</li>
	<li>Aort polistren bir tabağa yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça önceden sıcak PBS ile flush.</li>
	<li>Aort boyuna kesme ve iğnelerle düzeltebilirim.</li>
	<li>Sıcak hücre kültür orta iç damar yüzeyinde ekleyin.</li>
	<li>Aspire fibronektin-hücre kültür orta ve taze hücre kültür orta (%10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4 ile desteklenmiş DMEM) ekleyin.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamında bir pamuklu çubukla soak. Pamuk yün bud en iç gemi yüzeyi Tarih nazikçe ve yavaşça aynı yönde çubukla.</li>
	<li>6-şey plaka bir kuyu hücrelerde yuvarlak yuvarlak tarafından RUB'dir.</li>
	<li>Aynı şeyi kuyuları geri kalanı için.</li>
	<li>Kontrol hücreleri mikroskop altında ve kuluçka 37 ° c, % 5 CO 2 6-şey tabak yerleştirin.</li>
	<li>Orta ikinci gün değiştirin ve tekrar 2-3 günde değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri Konfluent olacak, hücreleri trypsinize ve onları T75 şişesi (PAEC P1) tohum.</li>
</ol> 2. PAEC karakterizasyonu <ol><li>8-şey chamberslide fibronektin 12,5 µg/mL PBS 1 ile önceden kat x ve 1 h için bir kuluçka-37 ° C'de yer</li>
	<li>5 x 10 4 hücreleri/iyi tohum ve gecede 37 kuluçka kuluçkaya ° C.</li>
	<li>PBS ++ (PBS) CaCl 2 ve MgCl 2, iki kere hücrelerle yıkama 300 μL/iyi.</li>
	<li>Tamir hücreleri % 3.7 paraformaldehyde 200 μL/iyi oda sıcaklığında 10 dakika ile.</li>
	<li>Yıkama hücreleri 3 kez PBS ++, 300 μL/iyi.</li>
	<li>PBS 1 x-3_% BSA (engelleme arabellek) 300 μL eklenir ve oda sıcaklığında 30 dakika bırakılır.</li>
	<li>Birincil antikorlar (anti-VE-cadherin, anti-CD31, anti-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi seyreltilmiş uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ++ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikorlar ve PBS 1x-1%BSA-0.05% deterjan 160 μL/iyi, seyreltilmiş DAPI uygulamak ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS ++ (200 μL/de) ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Dağ gliserol tabanlı montaj orta ile slaytlar ve endotel hücre işaretleri ifade bir floresan mikroskop altında doğrulayın. 
	Not: Kültür domuz kadar % 90 izdiham bir T175 şişesi (DMEM düşük glikoz orta + %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve endotel hücre büyüme orta ek Mix % 0,4) aort endotel hücrelerinde ulaşıldığında. (yoğunluğu 1 x 10 6 hücre tohum, % 90 izdiham karşılık yaklaşık 5 x 10 6 hücrelere).</li>
</ol> 3. Microcarrier boncuk kaplama <ol><li>microcarrier boncuk 7 mL 42 mL 50 mL tüp (100 μg / % 0,2 Asetik asit çözeltilerine seyreltilmiş mL,) kolajen çözeltisi ile karıştırıp oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama boncuk PBS pH 7.4 25 mL ile iki kez (PBS 25 mL ekleyin, karıştırın ile de damlalıklı ve boncuk sonra atma süpernatant ve tekrar düzenlenmiştir kadar bekleyin) ve bir kez DMEM Orta 25 mL.</li>
	<li>Kapak orta % 10 ile desteklenmiş 199 10mL ile 50 mL tüp boncuk FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve heparin (5000 IU/mL) 25 μL ve denge 10 min için izin daha fazla kullanımdan önce.</li>
</ol> 4. Hücre toplama <ol><li>hücre kültür orta PAEC içeren T175 balonun kaldır ve PBS pH 7.4 5 mL ekleyin.</li>
	<li>T175 balonun üzerinden kaldırmak PBS.</li>
	<li>5 mL Trypsin-0.05% EDTA de ekleyip 3-4 dk 37 için kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Hücreleri hücre kültür orta 15 mL ile balonun durulama tarafından toplamak ve bir 50 mL tüp süspansiyon transfer.</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi 1200 x g 8 dakika oda sıcaklığında hücreleri, fazla orta kaldırmak ve Pelet hücre kültür orta 5 mL resuspend.</li>
</ol> 5. Hücreleri karıştırıcı şişesi tohum <ol><li>hücre süspansiyon hücre kültür orta 20 mL ekleyin ve resuspend.</li>
	<li>20 mL hücre kültür orta (w/o hücreleri) 500 mL manyetik karıştırıcı şişesi eklemek.</li>
	<li>Hücreleri yıkanmış microcarrier boncuk 3.3 adımından ekleyip karıştırın dikkatle 25 mL serolojik pipet ile.</li>
	<li>Boncuk/hücre karışımı manyetik spinner şişeye transfer.</li>
	<li>50 mL tüp 10 mL kalan hücreleri toplamak için hücre kültür ortamının ile durulayın.</li>
	<li>Hücre kültür orta bir ek 85 mL spinner şişesi ekleyin ve kuluçka gecede 37 ° C'de üzerinde bir shaker içine yerleştirin (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).</li>
	<li>Hücre kültür orta 50 mL ekleyin (Toplam birim 200 mL) ve bir shaker olarak 37 ° C'de ek 24 h için karıştırmaya devam (100 x g, karıştırma aralığı: 3 dk her 45 min).</li>
	<li>Ekle renksiz RPMI orta (% 10 ile desteklenmiş FBS, % 1 penisilin/streptomisin, % 1'l-Glutamine, %0,4 endotel hücre büyüme orta ek mix ve Heparin 25 μL) toplam hacminin 320 mL ulaşılana kadar.</li>
	<li>Eski orta her 48 h: kaldırmak 100 mL orta yerine ve taze desteklenmiştir renksiz RPMI 100 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 5-7 gün boyunca kültür. Zaman cep kaplı boncuk izdiham durumuna bağlıdır.</li>
</ol> 6. İzdiham doğrulama <ol><li>bir pipet kullanarak cep kaplı boncuk 200 μL toplamak ve polipropilen tüp içine aktarmak.</li>
	<li>3 kez ile PBS 1 600 μL boncuk yıkama x (PBS, eklemek tüp ve karışımı yavaşça dekolmanı hücrelerin önlemek, boncuk beklemek için sakin, PBS atıp tekrar için eğimli).</li>
	<li>Parapicric asit 200 μL ekleyerek 10 min için boncuk düzeltmek.</li>
	<li>Yıkama 3 kez ile PBS 1 600 μL</li>
	<li>PBS 1 seyreltilmiş DAPI eklemek x ve 10 dk. için kuluçkaya</li>
	<li>Boncuk cam slayt üzerinde transfer ve gliserol dayalı montaj orta kullanarak bir coverslip uygulamak.</li>
	<li>Boncuk confocal mikroskop altında görselleştirmek.</li>
</ol> 7. Deneysel bir işlem <ol><li>10 mL serolojik pipet ile cep kaplı boncuk (yordamlar steril koşullarda yapılması zorunda değilsiniz) manyetik karıştırıcı balonun üzerinden Kaldır ve 12 mL yuvarlak alt polipropilen tüpler içine aktarmak.</li>
	<li>Boncuk (yaklaşık 1-2 dk) yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.</li>
	<li>Tam olarak 2 mL boncuk her tüp içerir kadar tüpler için daha fazla boncuk ekleyin.</li>
	<li>5 mL açık RPMI her tüp ve dikkatli bir 10 mL serolojik pipet kullanarak karıştırın.</li>
	<li>Boncuk yerleşmek ve aşırı orta kaldırmak edelim.</li>
	<li>RPMI ile bir kez daha çamaşır yordamı yineleyin ve tüm aşırı orta kaldırın.</li>
</ol> 8. Kuluçka sigara-anticoagulated kan <ol><li>dikkatli ve yavaş bir sağlıklı gönüllü kan ve 9 mL tarafsız polipropilen borular içinde (pıhtı önleyici) toplamak (ne jet ne de vacutainers kullanma).</li>
	<li>10 mL serolojik pipet ile kan 8 mL her hücre kaplı boncuk (Toplam birim-ecek var olmak 10 mL) 2 mL içeren polipropilen borular içine yavaş yavaş aktarın. Her zaman kan veya boncuk erken EC etkinleştirme önlemek için kaba işleme kaçının. 1-2 dk. yordamı alır</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde kan/boncuk karışımı eşit karıştırma sağlamak ve parafin film kapaklı mühür eğimli.</li>
	<li>(Sadece nazik devirme ayarları ile) yatay devirme tablo iç 37 ° C kuluçka ve kayıt kez pıhtılaşma tüpler yerleştirin.
	<ol><li>Saati ayarla aralıklarla, örneğin 10, 20, 30, 50, 70, 90 dk, sonra en az 1.5-2 mL serum veya plazma analiz için kan-boncuk karışımı kaldırmak. 
		Not: aynı derecede kan örnekleme farklı tüplerde bitmiş 6 saat puan için 3'ten fazla çoğaltır hücreleri, bir grup içinde sahip öneririz.</li>
		<li>Koagüle kan serumu koleksiyonu için bırakın. Plazma toplamak için EDTA veya sitrat 2 mL tüpler için kan örnekleri eklemeden önce ekleyin.</li>
		<li>Tüpler buza depolamak, santrifüj kapasitesi 2500 x g 4 ° C'de 10 dakika ve serum/plazma 80 ° C'de kullanmak kadar saklamak. 
		Not: Tablo malzemeler malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi sağlanır</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sunulan model koagülasyon için uygundur ile ilgili çalışmalar koagülasyon ve EC ile etkileşimi farklı yönlerini analiz izin 8 xenotransplantation araştırma, insan kanı 9kuluçka sonra farklı genetik olarak değiştirilmiş domuz ECs antikoagülan özelliklerini sınamak için kullanışlı bir sistem olduğunu.
Bu deney başlamadan önce tam hücre kapsama (confluency) lastikteki sağlanması ve bu dikkatli koleksiyonuna ait ve sigara anticoagulated tam ka...

Vasküler endotel kan damarlarının Lümen satır endotel hücreleri (EC) monolayer oluşur. Fizyolojik bir durumda deneniyor EC bir antikoagülan ve anti-inflamatuar çevre bakımı için sorumludur. 1 bu ifade antikoagülan ve EC yüzeyinde anti-inflamatuar proteinler tarafından aracılık ettiği. Örneğin, EC harekete geçirmek iskemi/reperfüzyon tarafından kaynaklanan yaralanma veya vasküler reddedilmesi (xeno-) nakledilen bir değişiklik endotel yüzeyinden bir antikoagülan ve anti-inflamatuar devlet yanlısı koagulant ve pro-inflamatuar sonuçlarında organları Devlet. 1
Endotel ve koagülasyon faktörleri, olarak taklit vitro modelleri arasında büyüleyici ve karmaşık etkileşim çalışmaya mümkün olduğunca vivo içinde durum son derece cazip. Geleneksel vitro koagülasyon testleri karakterize yaygın bir sınırlama koagülasyon-aracılı etkileri analiz zorlu kılan anticoagulated kan kullanılır ve citrated tam kan bile recalcification yeniden olamaz sonuçları taze sigara anticoagulated kan ile elde edilebilecek. 2 Ayrıca, geleneksel Düz Yataklı hücre kültürü sistemlerinde bu yeterli bir endotel hücre yüzey kan birim başına ulaştı olarak endotel antikoagülan özelliklerini yararlanmak mümkün değildir. Burada sunulan model EC küresel microcarrier boncuk, yüzeyde kültür tarafından bu sınırlamalar üstesinden gelir böylece bir EC yüzey kan oranı &#62; 16 cm2/mL ulaşılabilir, hangi küçük arteriyoller ya da damarlar, durumda benzer ve hangi kan "doğal" anticoagulation izin vermek yeterli olmak EC yüzey tarafından tanımlanmıştır. 3 , 4 tam kan olmadan eklenen antikoagülanlar bu ortamda kullanılabilir. Kan örnekleri toplanan deney ve sitokinler, koagülasyon faktörleri sırasında ve çözünür tamamlayıcı aktivasyon belirteçleri algılanır ve sayılabilir. Ayrıca, EC kaplı microcarrier boncuk ifade EC harekete geçirmek işaretleri yanı sıra tamamlayıcı ve immünglobulin ifade tarafından confocal mikroskobu analiz. Başka bir ilginç uygulama endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek gerekiyordu uyuşturucu testi içerir. 5 her ne kadar bu model tamamen hayvan deney yerini alamaz, belirli fonksiyonel hipotezler ex vivo hücre kullanarak test etmek ve böylece iskemi/reperfüzyon üzerinde temel araştırmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için bir yöntem sunar yaralanma ya da (xeno) nakli.
Açıklanan modeli domuz aort endotel hücreleri (PAEC) microcarrier boncuk büyüdü ve tüm, anticoagulated insan kanı ile inkübe ayarlama bir xenotransplantation taklit etmek için kullanıldı. Kompleman sistemi ve/veya thrombomodulin (hTBM) düzenleme koagülasyon sisteminin düzenlenmesi için CD46 gibi birçok insan genleri taşıyan farklı transgenik PAEC onların antikoagülan özelliklerini analiz. Endotel hücre harekete geçirmek, tamamlayıcı ve koagülasyon sistemleri sıkı kontrol ve birbirine bağlı. 6 bu nedenle nasıl adezyon molekül ifade ve sitokin yayın, insan kanı maruz kaldıktan sonra farklı transgenik hücreleri davrandığını anlamak önemlidir glycocalyx ve antikoagülan protein kaybı dökülme. 7

<table><tbody><tr><td>Laboratuvarımızda domuz aortundan izole</td>edilen <td>PAEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro taşıyıcı boncuklar (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen I, Sığır</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Nötr tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen tüpler</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırıcı şişeleri</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyolojik karıştırıcı</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan anti CD31</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB33871</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan IgG-Cy3</td><td>Jackson İmmüno Araştırması</td><td>112-166-003</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti VE-cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6458</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Tavşan anti vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Dk anti Gt IgG &ndash; Alexa 488</td><td>Moleküler Problar</td><td>A11055</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti Tavşan - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>Seyreltme 1 ve mikro; g/mL</td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Konsantrasyon: Hücre kültürü ortamında %10</td></tr><tr><td>Adaptör</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Image J</td><td></td><td>Ücretsiz olarak şu adresten edinilebilir: https://imagej.net</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Ortamı Takviyesi Mix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td> içinde 2 mL <td>Konsantrasyon: hücre kültürü ortamında% 1</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Konsantrasyon: Hücre kültürü ortamında% 1</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>Stok konsantrasyonu: 5000 U.I./ mL</td></tr><tr><td>Oda kaydırakları</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> x 2H<alt>2</alt>O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<alt>2 </alt>x6 H<alt>2</alt>O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Axon</td><td>Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Glisejel montaj ortamı</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

endotel hücreleri kullanarak 3d hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vivo, endotel hücreleri kan dolaşan doğal anticoagulation için büyük önem taşımaktadır. Sonuç olarak, endotel hücre aktivasyonu kan pıhtılaşması için yol açar. Bu olay xenotransplantation, dahil olmak üzere önceden biçimlendirilmiş Anti-donör antikorların varlığında organ nakli gibi birçok klinik durumlarda yanı sıra iskemi/reperfüzyon hasarı görülmektedir. Endotel hücre etkisini incelemeye 3R standartları (azaltma, değişim ve arıtma), vitro modellerine göre hayvan deney azaltmak için harekete geçirmek üstünde kan pıhtılaşması son derece cazip olurdu. Ancak, endotel hücre kültürünün ortak Kafesli döşeme sistemleri 1-5 cm2 . endotel mL doğal, endotel aracılı anticoagulation için yeterli değil kan başına bir yüzey hacim oranı sağlar. Microcarrier boncuk endotel hücre kültürü çalışmalarının 40-160 cm2/mL için yüzey hacim oranı artabilir. Böylece antikoagülan kullanımı önlenebilir artan bu oran tam kan, "doğal" anticoagulation emin olmak yeterlidir. Burada vitro microcarrier tabanlı bir sistemin tüm, Sigara anticoagulated insan kan pıhtılaşması domuz endotel hücrelerinin genetik değişikliği etkilerini incelemek için tanımlanır. Açıklanan tahlil, birincil domuz aort endotel hücreleri, vahşi türlerinden (WT) veya transgenik insan CD46 ve thrombomodulin, microcarrier boncuk üzerinde yetiştirilen ve taze çekilmiş sigara anticoagulated insan kanı için maruz. Bu modeli ölçüm ve miktar sitokin yayın hem de harekete geçirmek için tamamlayıcı ve kan plazma koagülasyon işaretleri verir. Buna ek olarak, düşsel aktive endotel hücre ve immünglobulin birikimi, tamamlayıcı ve pıhtılaşma proteinleri endothelialized boncuk üzerinde confocal mikroskobu tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu tahlil de endotel hücre aktivasyonu ve böylece, koagulasyon önlemek için gereken ilaçlar test etmek için kullanılabilir. Bu tür araştırmalar için kullanılan hayvan sayısını azaltmak için potansiyel üzerine, açıklanan tahlil gerçekleştirmek kolay ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.

Kültür spinner şişeye (şekil 1) 7-10 gün sonra hücreleri microcarrier boncuk (Resim 2) tüm yüzeyini örten Konfluent. Doğrulama confluency devletin önemli bir adım çünkü EC lastikteki üzerinde bir sigara birleşmesi monolayer Pıhtılaşma zamanı kadar belirgin bir azalma götürecek, microcarrier boncuk yüzey şiddetle yanlısı koagulant (pıhtılaşma Zamanı: 4 ± 1 dk) ( Şekil 3).
<p class="jove_content" f...

Biz bütün, anticoagulated kan çalışma ve koagülasyon analizini sağlayan bir vitro modeli mevcut. Anticoagulation sistemi sağlıklı endotel hücreleri doğal anticoagulation etkisi bağlıdır ve endotel hücre aktivasyonu pıhtılaşma içinde sonuçlanır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Bu deneyin genel amacı, antikoagülan uygulanmamış tam kan kullanarak endotel hücrelerin antikoagülan özelliklerini değerlendirmektir. Bu yöntem; kardiyovasküler araştırmalar, taşımacılık ve cerrahi ile ilgili araştırmalarla bağlantılı araştırma sorularını yanıtlamak için kullanılabilir. Temel olarak, anti-immünite ve endotel hücrelerin aktivasyonu ile ilgili tüm sorular için kullanılabilir.Bu tekniğin temel avantajı, antikoagülasyonun endotel hücreler tarafından garanti edilmesi sayesinde antikoagülan içermeyen tam kanın kullanılabilmesidir. Protokole başlamak için, 50 mililitrelik bir tüp içerisinde yedi mililitre mikrotaşıyıcı boncuğu 42 mililitre koagülan çözeltisi ile karıştırın ve boncukları oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, boncukları 25 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın ve pipetle yukarı-aşağı çekerek durulayın.Süpernatantı atmadan ve işlemi tekrarlamadan önce, boncukların tüpün dibine çökmesini bekleyin. Ardından, boncukları bir kez 25 milliliters Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM ile yıkayın. Sonrasında, boncukların üzerini 10 milliliters medium 199 ile kapatın ve daha sonraki kullanım öncesinde 10 dakika boyunca dengelenmeye bırakın.PAEC içeren T175 flaskındaki hücre kültürü besiyerini uzaklaştırın ve beş mililitre PBS ekleyin. Ardından, T175 flaskındaki PBS'yi uzaklaştırın ve yerine %0,05 EDTA içeren beş mililitre tripsin ekleyin. Hücreleri 37 °C'de üç ila dört dakika boyunca inkübe edin.Balonu 15 mililitre hücre kültüre ortamı ile durulayarak hücreleri toplayın ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüjleyin, santrifüj işleminden sonra fazla ortamı uzaklaştırın ve peleti beş mililitre hücre kültüre ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 20 mililitre hücre kültüre ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin.500 mililitrelik bir manyetik karıştırıcı erlene hücre içermeyen 20 mililitre hücre kültür ortamı ekleyin. Hücreleri yıkanmış mikro taşıyıcı boncuklara ekleyin ve çözeltiyi 25 mililitrelik bir serolojik pipetle dikkatlice karıştırın. Boncuk-hücre karışımını manyetik spinner erlene aktarın.Kalan hücreleri toplamak için tüpü 10 milliliters hücre kültür ortamı ile durulayın. Spinner flask içerisine ek olarak 85 milliliters hücre kültür ortamı ekleyin. Flaskı bir çalkalayıcı üzerinde, 37 degree celsius sıcaklıktaki inkübatöre gece boyunca yerleştirin.Toplam hacim 200 milliliters olacak şekilde 50 milliliters hücre kültür medyumu ekleyin. Bir çalkalayıcı üzerinde 24 saat boyunca karıştırmaya devam edin. Toplam hacim 320 milliliters olana kadar renksiz rockwell park memorial institute veya RPMI medyumu ekleyin.Her 48 saatte bir, 100 mililitre eski medyumu uzaklaştırın ve 100 mililitre taze, desteklenmiş renksiz RPMI ekleyin. Hücre kaplı boncukların konflüens durumuna bağlı olarak hücreleri beş ila yedi gün boyunca kültüre edin. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, hücre kaplı boncukları manyetik karıştırıcılı flasktan çıkarın ve 12 mililitrelik yuvarlak tabanlı polipropilen tüplere aktarın.Boncuklar çöktükten sonra, bir ila iki dakika bekleyip fazla medyumu uzaklaştırın. Her tüp tam olarak iki milimetre boncuk içerene kadar tüplere daha fazla boncuk ekleyin. Ardından, her tüpe beş mililitre berrak RPMI ekleyin ve çözeltiyi 10 mililitrelik bir serolojik pipet ile dikkatlice karıştırın.Boncukların çökmesini bekleyin ve fazla medyumu uzaklaştırın. Yıkama prosedürünü RPMI ile bir kez daha tekrarlayın ve tüm fazla medyumu uzaklaştırın. Sağlıklı bir gönüllüden dikkatlice ve yavaşça kan alın ve antikoagülan içermeyen dokuz mililitrelik nötr polipropilen bir tüpe toplayın.Toplam hacmi 10 mL yapmak için, iki mL hücre kaplı boncuk içeren polipropilen tüplerin her birine yavaşça sekiz mL kan aktarın. Erken EC aktivasyonunu önlemek için kanı ve boncukları dikkatli bir şekilde taşıdığınızdan emin olun. Eşit karışımı sağlamak için kan-boncuk karışımını dikkatlice eğin ve kapağı parafin film ile mühürleyin.Tüpleri, 37 °C'lik bir inkübatör içinde, düşük ayarlara sahip yatay bir sallama tablasına yerleştirin ve pıhtılaşma sürelerini kaydedin. Belirlenen zaman aralıklarında, serum veya plazma analizi için kan-boncuk karışımından en az 1,5 ila 2 mL örnek alın. Serum toplamak için kanın pıhtılaşmasını bekleyin.Son olarak, tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 2,500 G'de santrifüjleyin. Serumu veya plazmayı kullanana kadar -80 °C'de saklayın. CD31 ve çekirdekler için boyanmış mikrotaşıyıcı boncuklar konfluensiyi net bir şekilde göstermektedir.Görsel gözlem, mikrotaşıyıcı boncukların yüzeyinde bir endotel hücresi (EH) tek tabakası mevcut olduğunda pıhtılaşma süresinde uzamanın gözlemlenebileceğini belirlemiştir. Porcine aortik endotel hücreleri, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM mikrotaşıyıcı boncuklar üzerinde mevcut olduğunda pıhtılaşma süresinde belirgin bir artış gözlemlenmiş olup, bu durum hem kompleman hem de koagülasyon sistemlerinin başarılı bir şekilde modüle edildiğini göstermektedir. Yöntem uzmanlaşıldığında, endotel hücresi kaplı boncukların antikoagülan içermeyen insan kanı ile inkübasyonu yaklaşık altı saatte tamamlanabilmektedir.Deneyin gerçek süresi, esas olarak deney sırasında gözlemlenen pıhtılaşma süresine bağlıdır. Bu prosedürü uygularken, mikro boncukların endotel hücreleri ile tamamen kaplandığından emin olmak ve insan kanının vaktinden önce aktivasyonunu önlemek önemlidir.

assessment-anticoagulant-anti-inflammatory-properties-endothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Mikrovasküler ölçekli kanallar (&lt;30 um) ile bir mikroakışkan cihazın bütün iç yüzeyi boyunca kültürün 3B, endotel hücre mono tabakasında için bir yöntem tarif edilmiştir.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.

On-Chip Endotel İnflamatuar fenotipleme

İnsanlarda vasküler kan etkileşimlerini araştırmak için güvenilir modellerin erişilebilirliği eksiktir. Hem kandaki (ELISA) hem de vasküler kompartmandaki (mikroskopi) hücresel etkileşimleri araştırmak için insan tam kanı ile birleştirilmiş kültürlenmiş primer insan endotel hücrelerinin in vitro bir modelini sunuyoruz.

A Novel In vitro İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

Vasküler endotel sıkıca lökosit işe alım denetler. Yetersiz lökosit ekstravazasyonu insan inflamatuar hastalıklar için katkıda bulunur. Bu nedenle, roman yasal unsurları endotel harekete geçirmek için arama enflamatuar bozuklukları için geliştirilmiş terapiler tasarlamak gereklidir. Burada, lökosit enflamasyon sırasında kaçakçılığı değiştirebilirsiniz roman endotel düzenleyiciler ayırdetmek için kapsamlı bir metodoloji açıklayın.

Deneyleri roman endotel düzenleyiciler inflamatuvar yanıtta yer alan karakterize etmek için eleme

Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Burada, prelabelled Mezenkimal hücrelerin sıçan aort kaynaklı endotel ağları ile birlikte kültürlü nerede aort yüzük testin yeni bir uygulama mevcut. Bu roman yöntemi görselleştirme Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) posta ve endotel ağları ile entegrasyon, miktar ağ özellikleri ve MSC immunophenotypes ve gen ifade değerlendirme sağlar.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Üç boyutlu eş-kültür spheroid anjiyogenez tsay sistemi fizyolojik anjiyogenezi taklit etmek için tasarlanmıştır. Co-kültür sheroidler iki insan vasküler hücre öncüleri, ECFCs ve MSCs oluşur ve kollajen jel gömülü. Yeni sistem anjiyojenik modülatörlerin değerlendirilmesinde etkilidir ve in vivo çalışmaya daha uygun bilgiler sağlar.

Endotel Kolonisi Oluşturan Hücreler ve Mezenkimal Kök Hücreler tarafından Oluşturulan Eş Kültür Sfaoidler Kullanılarak Üç Boyutlu Anjiyogenez Tsay Sistemi

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Burada, fizyolojik akış altında imal edilmiş, gerçek boyutlu, üç boyutlu insan arter modellerinde ilaç taşıyıcılarının hedeflenen birikimini incelemek ve endotel hücreleriyle haritalamak için yeni bir protokol sunuyoruz. Sunulan yöntem, damar sistemi içindeki ilaç taşıyıcılarını hedeflemek için yeni bir platform görevi görebilebilir.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

Keşfedin endotel hücrelerinin antikoagülan özelliklerini, antikoagülan içermeyen tam kan kullanarak. Bu 3D hücre kültürü yöntemi, kardiyovasküler ve cerrahi araştırmalar için pahalıdır.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet