Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Bu protokolün genel amacı, bir antikorun veya bir serum örneğinin Fc aracılı efektör fonksiyonunu aktive etme yeteneğini değerlendirmektir. Bu yöntem, antikora bağımlı Fc aracılı bağışıklığın aktivasyonunu ölçerek immünoloji ve aşılama alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, deneyin materyal hazırlığından veri analizine kadar 24 saat içinde yapılabilmesidir.

Bu prosedürü göstermek, Peter Palese'nin laboratuvarından yüksek lisans öğrencisi Mark Bailey olacaktır. Transfeksiyon yoluyla influenza virüsü hemaglutinin ekspresyonunu indüklemek için, ilk plaka insan embriyonik böbreği 293 hücre, beyaz doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakada kuyu başına 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonunda iki kez. 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de dört saat sonra, hücreleri viral hemaglutinin için kodlayan 100 nanogram DNA ve oyuk başına 0.2 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve toplam 50 mikrolitre hacim 1X optimum indirgenmiş serum ortamı ile transfekte edin.

Plakayı 18 saat daha inkübatöre geri döndürmek ve transfekte etmek için her bir oyuğa DNA lipozom kompleksleri ekleyin. Enfeksiyon yoluyla influenza virüsü hemaglutinin ekspresyonunu indüklemek için, 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de en az 18 saatlik bir inkübasyon için 96 oyuklu plaka ile muamele edilen bir beyaz doku kültüründe kuyu başına 10 ila dördüncü hücre konsantrasyonunda iki kez plaka A549 hücresi. İnkübasyonun sonunda, influenza virüsünü, oyuk başına 100 mikrolitre 1X MEM ortamının üçünde bir çoklu enfeksiyona seyreltin ve hücre kültürü inkübatöründe bir saat boyunca A459 hücrelerini enfekte edin.

İnkübasyonun sonunda, aşıyı virüssüz 100 mikrolitre taze 1X MEM ortamı ile değiştirin ve hücreleri 18 ila 24 saat daha inkübatöre geri koyun. İlgilenilen spesifik antikorların hemaglutinin eksprese eden hücreleri hedefleme yeteneğini değerlendirmek için, viral olarak etkilenen hücre kültürlerinin süpernatantını 25 mikrolitre Antikora Bağımlı Hücre aracılı Sitotoksisite veya ADCC test ortamı ile değiştirin. Daha sonra, ayrı bir 96 oyuklu plakada, şemaya göre mililitre başına 10 mikrogramdan başlayarak ve arka planı dahil etmeye ve antikor kontrolü olmamasına dikkat ederek, taze ADCC ortamında üçlü olarak ilgilenilen antikorların dört tam seyreltmesini gerçekleştirin.

Antikorun tamamı seyreltildiğinde, seyreltilmiş antikorun 25 mikrolitresini deney hücre plakasındaki uygun karşılık gelen kuyucuklara aktarın ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 15 dakika sonra, oyuk başına 75 mikrolitre ADCC ortamının nihai hacmi için 25 mikrolitre ADCC ortamında oyuk başına uygun Fc reseptörünü eksprese eden dördüncü modifiye efektör Jurkat hücrelerine 7.5 kez 10 ekleyin. Plakayı, inkübasyonun son saatinde 37 santigrat derece su banyosunda lusiferaz substrat tamponunu çözerek altı saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Tampon hazır olduğunda, arka plan kontrol kuyusu dışındaki tüm kuyucuklara 75 mikrolitre lusiferaz substrat tamponu ekleyin ve plakayı bir luminometrede okuyun. Transfekte edilmiş veya enfekte olmuş hücre kültürlerinde antikora bağımlı hücre aracılı sitotoksisitenin kat indüksiyonu daha sonra hesaplanabilir. Bu deneyde, stoka özgü bir monoklonal antikor, murin Fc gama reseptörü dördünü eksprese eden Jurkat hücrelerini, başa özgü monoklonal ve kontrol IgG antikorlarına kıyasla yaklaşık 14 kat daha sağlam bir şekilde aktive etti ve modifiye etti.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen belirli antikorların Fc aracılı bağışıklığı aktive etme yeteneğini değerlendirmek için bir deneyin nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız.