MikroRNA tabanlı sıvı biyopsi: Plazma miRNA imza Sınıflandırıcısı (MSC) akciğer kanseri süzmek için bir deneyim

Bu prosedürün genel amacı, 50 yaşından büyük ağır sigara içenlerde akciğer kanseri gelişme riskini belirlemek için dolaşımdaki 24 plazma mikroRNA'nın seviyelerini ölçmektir. Bu yöntemler, yanlış pozitif nodların sayısını ve muhtemelen aşırı tanıyı azaltarak erken akciğer kanseri tespiti için düşük doz bilgisayarlı tomografi tarama programlarının maliyet etkinliğini artırabilir. Bu tekniğin temel avantajı, salgılayan mikroRNA'nın, ortak moleküler laboratuvarları benimseyen standart ekipmanla ölçülmesinin kolay olmasıdır.

Bu yöntem için ilk olarak, tümör mikroçevresinin akciğer kanseri gelişimi üzerindeki rolünü incelemeye başladığımızda aklımıza geldi. MikroRNA'lar, konakçının tepkisini ve tümör ile mikro çevresi arasındaki dinamik etkileşimi yansıtır. Bu yöntemin görsel gösterimi, bu tür moleküler analiz için izlenecek standart çalışma prosedürünü daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir.

Bu protokolü başlatmak için, 10 mililitre tam kan örneği toplamak için Vacutainer tüplerini kullanın. Oda sıcaklığında saklayın. Termal şok ve hücre parçalanmasını önlemek için tam kanı dört santigrat derece gibi düşük sıcaklıklarda saklamayın.

Bu bizi belirli bir mikroRNA salınımına götürür. Plazmayı ayırmak için bir saat içinde santrifüjleyin. Lenfositik halka ile temastan kaçındığınızdan emin olun.

Süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, süpernatanı aynı koşullarda santrifüjleyin. Bu plazma süpernatanının bir mililitresini 1.5 mililitrelik kriyo şişelerine ayırın ve plazma fraksiyonunu tüp tabanından toplamamaya dikkat edin.

RNA izolasyonunu başlatmak için, her numune için 200 mikrolitre plazmaya 200 mikrolitre önceden soğutulmuş OMG çözeltisi ekleyin. Tam homojenizasyonu sağlamak için 15 ila 30 saniye boyunca girdap. Numuneyi homojenize etmek için, numune başına 200 mikrolitre lizis tamponu ve 25 mikrolitre protein ASK ekleyin ve 20 saniye boyunca girdap yapın.

Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede bir termo karıştırıcıda 15 dakika inkübe edin. Ardından, RSC mi-RNA Doku yöntemini seçin ve pistonu düzgün bir şekilde yerleştirerek otomatik bir nükleik asit çıkarıcısının güverte tepsisine her numune için bir kartuş yükleyin. Lizatı aktarın ve beş mikrolitre DNaz bir çözeltiyi alet kartuşundaki uygun konumlarına ekleyin.

Her bir elüsyon tüpünün tabanına 60 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Otomatik arıtmaya başlamak için çalıştırmayı başlatın. Toplam RNA örneklerini 80 santigrat derecede saklayın.

Taq miroRNA ters transkripsiyon kitini kullanarak RNA'yı CDNA'ya dönüştürmek için, ilgilenilen mi-RNA'larla Taq RT astar aracını kullanın. Buz üzerine yerleştirilmiş 1,5 mililitrelik bir tüpte, kit talimatlarına göre RT reaksiyon karışımını hazırlayın. Ardından, 15 mikrolitrelik bir nihai hacme numune başına 3 mikrolitre toplam RNA ekleyin.

Beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Son olarak, numuneleri bir termodöngüleyiciye yükleyin ve RT reaksiyonunu çalıştırın. Daha sonra her bir RT reaksiyon ürününden 2,5 mikrolitreyi Taq Master Mix 2X ve Custom Taq havuzu ile karıştırın.

25 mikrolitrelik son hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Belirli bir termal profil kullanarak bir termodöngüleyicide ön amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirin. Daha sonra her bir ürünü 175 mikrolitre 0.1 XTE PH 8.0 ekleyerek seyreltin.

İlk olarak, seyreltilmiş önceden amplifiye edilmiş numunenin 1.13 mikrolitresini 0.5 mililitrelik bir tüpte 2X Taq Universal Master Mix ile karıştırın. Ve sonra nükleaz içermeyen su ekleyin. Sekiz numunede 24 spesifik miRNA'nın plazma seviyelerini aynı anda ölçmek için 384 oyuklu mikroakışkan özel Taq dizisi mikroRNA kartı kullanın.

Karta PCR reaksiyon karışımı ile sekiz adede kadar reaksiyon yükleyin. Özel kartı iki dakika boyunca 311 kez G'de santrifüjleyin ve dizi kartı mühürleyici ile kapatın. Son olarak, kartı gerçek zamanlı bir PCR sistemine yerleştirin ve gerçek zamanlı PCR reaksiyonunu çalıştırın.

Verileri tahmin etmek ve analiz etmek için uygun yazılımı kullanın ve ham CT değerleri elde edin. Arka plan sinyallerini kaldırmak için otomatik bir taban çizgisi ve tüm tahliller ve numuneler için 0,15'lik sabit bir eşik ayarlayın. MiRNA'nın kan hücreleri tarafından spesifik olmayan salınımından kaynaklanan yanlış sonuçların ortaya çıkabileceği, analiz edilemeyen hemolize plazma örneklerini tanımlamak için bir preanalitik kalite kontrol adımı gerçekleştirilmelidir.

A414 ve A375 dalga boyları arasındaki absorbans oranını ölçen plazma numunelerinin spektrofotometrik analizi, hemolize edilmiş analiz edilemeyen numuneler ile hemolize edilmemiş numuneler arasındaki farkı gösterir. Herhangi bir teknik sorunu belirlemek için RT-QPCR performansı değerlendirilir. Dört kaliteli mikroakışkan kart, düşük performanslı RT-QPCR ile sonuçlanır ve bu durumda preamplifikasyon ürünü yeni bir mikroakışkan karta yeniden yüklenmelidir.

Kaliteli mikroakışkan kartlar iyi performansla sonuçlanır ve bunlar daha sonra iki analitik kalite kontrol adımına tabi tutulur. Kalite kontrol adımları gerçekleştirildikten sonra mikroRNA imza sınıflandırıcısı uygulanır. MSC'yi oluşturan miRNA oranlarının dört imzası üretilir.

Hastalık riski, agresif hastalık riski, hastalık varlığı ve agresif hastalık varlığı. Dört imzayı birleştirerek, risk seviyesi son olarak düşük, orta veya yüksek olarak tanımlanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, 80 santigrat derecede bir haftalık plazma depolaması hariç, bu teknik on saat içinde yapılabilir.

Sekiz numuneyi aynı anda analiz etmek. MicroRNA imza sınıflandırıcısı şimdiye kadar BioMed Lancaster Tarama Denemesine kayıtlı 4.000'den fazla gönüllüden toplanan 10.000'den fazla örnek üzerinde test edilmiştir. Potansiyel olarak bu testler, tanılama algoritmasının daha fazla tutarlılığını sağlayabilir.

Ayrıca tarama maliyetlerini de düşürürler. Bu videoyu izledikten sonra, kanser teşhisi ve diğer ciddi hastalıklar için biyobelirteç olarak kullanmak üzere dolaşımdaki miRNA seviyelerini ölçmeye izin vermelisiniz.