Name: Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin santrifüj elutriasyon yöntemiyle akut lenfoblastik lösemi hücrelerini farklı hücre döngüsü aşamalarına ayırmayı. Bu teknik, anti-kanser bileşiklerin aşamaya bağımlı etkilerini incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH CA109821 (TCC için) tarafından desteklenmiştir. Beckman Coulter cömertçe yayın maliyetlerini karşılamak için fon sağlamak için ve teknik yardım kurulum ve elutriation sisteminin çalışması için teşekkür ederiz. Biz Dr Fred Falkenburg ilk İlköğretim tüm kültürler için teşekkür ederiz.

Not: bu protokolü birincil B-tüm 13 µm (G2/M aşama) için yaklaşık 8 µm (G1 evresi) üzerinden çapı değişen hücreleri için optimize edilmiştir. Böylece, belirli santrifüj hızları ve pompa akış oranları farklı boyut aralıkları içeren hücreler için geçerli olmayabilir. Yine de, uygun elutriation parametreleri sedimantasyon hızı denklemi kullanarak tahmin edilebilir. Hücreleri tanımlanmış bir serum-Alerjik Orta olarak açıklanan 16 / 1-3 x 10 6 hücre/mL en uygun bir yoğunluk, kültürlü. Buz-serin borular kullanarak 4 ° C'de yürütülen topluluğu kesirler hariç, oda sıcaklığında ve en fazla 24 20 ° C'de ayarla santrifüj tüm adımları yapılmaktadır ° C.
 1. hazırlık Elutriation tampon ve malzeme hücrelerinin topaklanma azaltmak, Hank, bir elutriation arabellek hazırlamak için <ol><li>&#39; s fenol kırmızı takıma % 2 fetal sığır serum () ile tuzlu çözüm (HBSS) dengeli Elutriation süreci ve 1.6 g/M 2-naftol-6,8-disulfonic asit dipotassium tuz (NDA), olumsuz ücret hücre dış işler ve topaklanma azaltır sırasında mekanik stres hücreleri korumak için FBS).
	<ol><li>NDA 1.6 g 50 mL konik tüp ekleyin.</li>
		<li>Steril koşullarda, HBSS 35 mL 1 L şişeden NDA içeren 50 mL konik tüp ekleyin. NİV eriyene kadar tüp girdap.</li>
		<li>0.2 µm filtre kullanarak yeni bir steril 50 mL konik tüp içine çözünmüş NİV transfer. HBSS kalan 1 L için NİV ekleyin.</li>
		<li>Son olarak son konsantrasyonu % 2 (v/v) elde etmek için HBSS 21 mL FBS ekleyin. 
		Not: Elutriation arabellek olabilir hazırlanmış ve HBSS veya kadar pH büyük bir değişiklik bir göstergesi boya sararma tarafından belirtildiği şekilde sona erme tarihine kadar 4 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li> <li>Böylece etiketli tüpler 1 ve 2 (W1 ve W2), kesirler 1-20 (F1 - F20) yıkama ve DURDURMAK 50 mL konik tüpler kesirler topluluğu için etiket.
	<ol><li>Bu tüpler buzda kesirleri toplama önce önceden chill.</li>
	</ol></li></ol> 2. Derleme Elutriation sisteminin <ol><li>önce yükleyin strobe derleme santrifüj böylece güç kablosunu dışarı sol tarafındaki bağlantı noktası ile odaya besleniyor. Santrifüj kapatıldığında bu görüntüleme penceresi ile aynı hizada şekilde flaş flaş lamba odası ön tarafta olduğundan emin olun.
	<ol><li>İlk başta-in belgili tanımlık her destek iki delik içine iki-yıldız tornavida vida sıkma ve yanında parmak vidası her dirseğinin dibinde sıkma tarafından derleme yerde güvenli.</li>
		<li>Flaş güç bağlantı santrifüj arkasındaki güç kablosunu takın.</li>
	</ol></li> <li>Sonra rotor santrifüj sürücü hub düz aşağı ve T-kolu onaltılık anahtarıyla güvenli. 
	Not: santrifüj elutriation olmayan amaçlar için gerekli değilse, strobe derleme ve rotor santrifüj arasında çalıştırır içinde tutulabilir.</li>
	Rotor güvenli bir kez, <li>mühür montaj ve montaj plakası rotor döner içeren elutriation odası, sayaç ayarı, hızlı çıkarma derleme yerleştirin.
	<ol><li>Aşağı doğru itin eşit tek eliyle elutriation odası ve sayaç denge Öte yandan Open End civatalar Montaj plakası üzerinde delik içine snap kadar.</li>
		<li>Son olarak, pin kablo bir tarafında dönen mühür derleme deliğe yerleştirip sol tarafında o dirsek üzerinde biriyle (2.1.1 içinde belirtilen)-yıldız tornavida vidaları kablonun diğer tarafında eyehole güvenliğini sağlama bağlantı kablosunu takın f odası.</li>
	</ol></li> <li>Sonra bir değişken hız pompa kullanarak akış sistemi montajı ve pompa arabelleğe elutriation boru Kamara ve toplamak arabellek elutriation odadan akarken.
	<ol><li>Değişken hızlı pompa üst bağlantı noktası üzerinden gelen boyutu 16 giriş boru yaptı santrifüj TMMOB odasına girer böylece INSERT.</li>
		<li>Uygun bir ücretsiz giriş hortumunun sonuna eklemek ve dönen mühür derleme tarafında giriş deliği montaj takın.</li>
		<li>Boyutu 16 bağlantı noktası üzerinden boru çıkış ve transferi tüp dönen üst ekleyin Ekle mühür derleme. 
		Not: Akış sistemi de elutriation çalışmaları arasında birleştirilmiş kalabilir.</li>
	</ol></li> <li>Son olarak, santrifüj açmak ve teknik özellikleri deneme için gereken şekilde ayarlayın.
	<ol><li>Değişiklik rotor kimliği.</li>
		<li>Santrifüj zaman giriş gerektiriyorsa, çalıştırmak bir elutriation tamamlamak daha--dan yeterli 2 h için ayarla.</li>
		<li>İle maksimum geçici 24 + 20 ° C sıcaklık ayarla ° C.</li>
		<li>Max için hızlanma ve yavaşlama için yavaş ayarla.</li>
		<li>Son olarak, 867 x g. hıza ayarlayın</li>
	</ol></li></ol> 3. Elutriation sistemi priming ilk elutriation sistem sterilize etmek, rezervuar boru %5 çamaşır suyu içeren bir 500 mL plastik şişe içine yerleştirin ve çıkış boru boş 1 L plastik atık şişe içine yerleştirmek için <ol><li>.
	<ol><li>Pompa açmak ve 25 mL/dk için hızını ve %5 çamaşır suyu atık şişe içine çıktı tüp dışarı pompalanır kadar sonuna kadar elutriation sistemi üzerinden akmasına izin.</li>
		<li>Santrifüj açmak ve hız (867 x g) serbest kabarcıklar ve backpressure için belirlenmiş maksimum gelmesini izin.</li>
		<li>Santrifüj durdurmak. Rotor döner durdu sonra kapağını açmak ve herhangi bir sızıntı için odası incelemek.</li>
		<li>Hiçbir sızıntı varsa, çamaşır suyu çözüm izin en az 5 dakika süreyle sistem ile akışı</li>
	</ol></li> <li>Çamaşır suyu hangi kurşun hücreleri topaklanma için hem de hücreleri zarar elutriation arabellek precipitates oluşumu için kurşun gibi daha sonra autoclaved su ile sistem floş.
	<ol><li>Ve su ile en az 10 dk. temizlemek izin yer autoclaved 1 L şişe içine rezervuar boru</li>
	</ol></li> <li>Su ile yıkama sonra elutriation arabellek sisteme tanıtmak. Elutriation arabellek ve hücreler için su deposu oluşturmak için autoclaved olmuştur 150 mL cam şişe kullanın.
	<ol><li>Elutriation arabellek 100 mL şişe ekleyin ve tüp çok altında olması rezervuar cam şişe Boru taşımak.</li>
		<li>Ve suyu floş için sistemi aracılığıyla akış arabellek izin santrifüj başlayın.</li>
		<li>Arabellek sistem üzerinden geri dönüştürülmüş böylece çıkış atık şişe için rezervuar boru rezervuar şişe neredeyse boş ve su tamamen sistemden aktarılmadan kez hareket.</li>
	</ol></li> <li>Son olarak, izleme penceresi geçerli hızda elutriation odası görülebilir şekilde ayarlayın.
	<ol><li>Basın flaş lamba güç düğmesi santrifüj dışındaki böylece lamba yanar. Elutriation k açmaksantrifüj sol sonuna kadar dışarıdan da Nob.</li>
		Elutriation odası görünümü ve strobe ışık gelene sağdaki düğmeyi rotor dönüşü ile zamanında edip inceleyen pencereden yavaş yavaş <li>çevirmek. 
		Not: hücreleri prepped kadar elutriation sistemi bu durumda bırakılabilir.</li>
	</ol></li></ol> 4. Hücre örneği hazırlanması <ol><li>Kont hücreleri ve aliquot 300-400 milyon içinde büyüme orta birkaç 50 mL konik tüpler içine. Spin aşağı vasıl 1210 x g 3 dakika süreyle hücre</li>
	<li>Aspiratı büyüme medya ve resuspend hücreleri yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından elutriation arabellek 25 ml.</li>
	Azaltmak için <li>topaklanma hücre, bir 25 ile iki kez geçiş hücreleri iğne ölçmek.
	<ol><li>10 mL şırınga kullanarak hücreleri çizin ve sonra 25 gauge iğne takmak ve hücreler arasında iç geçmek bir steril 50 mL konik tüp duvarına. Tüm 25 mL geçti kadar iğne ile bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Yeni iğne ve şırınga elde etmek ve bir kez yukarıda tekrarlayın. 
		Dikkat: Şırınga iğneleri "Sharps" kaplarda yerleştirilmelidir. 
		Not: Bu hücreleri iğne ile daha önce hemen onları tanıştırmak elutriation sisteme hücre minimumda topaklanma tutmak için itilir bu önemlidir.</li>
	</ol></li></ol> 5. Hücre örnek giriş içine belgili tanımlık Elutriation sistemi ve kesirler koleksiyonu <ol><li>tanıtmak hücre örnek hücre örnek üzerinden geri dönüşüm kalan elutriation tampon vardır rezervuar tankı içine dökme tarafından elutriation sistemine .
	<ol><li>İzin girmek belgili tanımlık sistem ve denge elutriation odası içinde ulaşmak hücreleri. 
		Not: Bu işlem yaklaşık 5 dakika sürer ve ilerleme izleme penceresi Odaya girerken hücreleri izleyerek izlenebilir. Tüm hücreleri odasında emin olmak için bir damla alın eluent, yer bir cam slayt üzerinde ve mikroskop altında görüntülemek. Örnek sağlam hücreleri serbest ise, bu onların saklama odasında onaylar.</li>
	</ol></li> <li>Bir kez tüm hücreleri odasına girdiniz ve denge içinde olduğu hücreleri odası geniş kısmında ayrı bir sınır kesirler toplamaya başlamak.
	<ol>50 mL konik tüp çıktı tüp hareketli tarafından <li>Begin W1 etiketli. Toplamak için rezervuar tank göz kulak ve elutriation arabellek gerektiğinde yeniden doldurmak emin bu kesir elutriation arabellek 50 mL. 
		Not: ilk kez depo dolum önce neredeyse boş olmak rezervuar tank tüm hücreleri içine belgili tanımlık sistem girdiğinizden emin olun için olanak verir. Sonra ilk dolum havzanın neredeyse boş olmak beklemek gerekmez. Ayrıca, yapmak değil hiç bu sistemde kabarcıklar ve geri dönüş basıncı yaratacak gibi boş olmak tank izin.</li>
		<li>50 mL toplanan bir kez W1 için aynı anda 821 x g hızla değiştirin ve W2 etiketli konik tüp çıktı tüp taşımak ve 50 mL bu hızda daha fazla toplamak.</li>
		<li>Değiştirme hızı ve tablo 1'de gösterildiği gibi kesirler toplamaya devam ediyor. Havzanın medyada tank ve buz üzerinde konik tüp her zaman tutmak emin olun. Son olarak, yavaş yavaş hızı azaldıkça sağdaki düğmeyi çevirerek görüntüleme penceresi ayarlamak.</li>
		<li>Bir kez tüm 20 kesirler toplanmıştır, santrifüj durdurmak ve STOP etiketli konik tüp içinde 50 mL toplamak.</li>
	</ol></li></ol> 6. Flushing Elutriation sisteminin <ol>santrifüj tamamen gömme rezervuar tüp autoclaved su ve çıkış tüpünde geri atık şişe 1 L şişe koyarak sistem durduktan sonra <li>.
	<ol><li>Pompa hızı 50 mL/dk'ya kadar açın ve onu tükenmiş kadar sistem üzerinden çalıştırmak su izin.</li>
	</ol></li> <li>Çevirmek pompa kapatmak giriş ve çıkış hortumu hızlı çıkarma derlemesinden kaldırmak ve ankraj kablo iğnesinden dışarı çıkarmak.
	<ol><li>Kaldır rotor hızlı çıkarma derlemesinden. 
		Not: ne santrifüj için kullanılan bağlı olarak, elutriation sistem şimdi olduğu gibi bırakılabilir. Aksi takdirde, tüm montaj ters sırada yukarıda açıklandığı gibi alınabilir. Elutriation odası hızlı çıkarma derlemesinden kaldırıldı ve ultrasonik su banyosu kullanarak çalışmaları arasında temizledim. Bu enkaz ve kirletici daha sonra ishal olumsuz yönde etkileyebilecek odası duvardan kaldırır.</li>
	</ol></li></ol> 7. Kesirler ve koleksiyon G1 ve G2/M havuzları analizi.
 Not: elutriation etkinliğini göstermek için her kesir sayısı, hücre çapı ve DNA içeriği için analiz edilir ve havuzları oluşturulur hücrelerinin immunoblot analizleri, G1 ve G2/M aşamasında açıklandığı gibi Temsilcisi sonuçları. Bu iletişim kuralı bölüm bu havuzları oluşturmak ve onları deneysel kullanım için hazırlamak nasıl anlatacağım.
<ol><li>Her kesir 2000 x g 4 ° C ve elutriation arabellek kapalı aspiratı 5 min için de spin.</li>
	<li>Birlikte bir G1 evresi havuzu ve G2/M aşamaları havuzu elde etmek için birleştirin kesirler.
	<ol><li>İçin G1 aşama Havuzu, toplam fosfat tampon tuzlu çözüm (PBS) ve 15 mL konik tüp transfer 1 mL 788 x g hız aralığında 661 x g (F1 - F5) toplanan kesirler resuspend. G2/M aşamaları havuzu için 387 x g ve 333 x g (F17 - F20) hız aralığında toplanan kesirler resuspend.</li>
		<li>2000 x g 4 ° C ve aspiratı PBS kapalı 5 min için hücreleri aşağı spin.</li>
	</ol></li> <li>Resuspend 10 mL büyüme ortamının hücreleri ve hücre sayısı alır.</li>
	<li>Bir aliquot için DNA analiz edilecek her havuzundan propidium iyodür boyama yoluyla içeriği almak ve akış sitometrik analiz 15. 
	Not: Her havuzu geri kalanı için daha fazla deney kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote%2C+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+cell+res%22%5BJournal%5D)">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li>
<li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755438">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li>
<li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li>
<li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755441">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+biochem+physiol+Toxicol%2Cpharmacol+CBP%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+biochem%2Cbiotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li>
<li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+cells+by+targeting+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+diff%22%5BJournal%5D)">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinic+oncol%22%5BJournal%5D)">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li>
<li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perspective+on+old+drugs%3A+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li>
<li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+res%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li>
<li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+hematol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li>
<li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+biochem+sci%22%5BJournal%5D)">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li>
<li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+biochem+biophys%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li>
<li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

Anisha Kothari şu anda bölümü hücre ve moleküler biyoloji St. Jude çocuk araştırma hastanesinde çalışıyor.

CCE kullanarak hücre döngüsünün farklı aşamalarında tüm hücreleri birincil elde etmek için bir yöntem anlatmıştık. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus kolayca mükemmel verim elde edilebilir ve son derece S aşamasında zenginleştirilmiş hücreleri de istenirse edinilebilir. Sonuçları burada sunulan bir birincil tüm kültür (özellikle, ALL-5) ve temelde aynı sonuçlar elde edilen bağımsız bir kültür ile ALL-215kullanarak el...

Genellikle zaman uyumsuz olarak kültürlü hücrelerin büyümesine ve tek tek hücreler hücre döngüsünün farklı aşamalarında mevcuttur. Bazı organizmalar doğal olarak zaman uyumlu hücre döngüsü sergi veya belirli fizyolojik uyaranlar tarafından eşitlenebilir. Örneğin, bir çok zaman uyumlu moda1ve Desmodesmus quadricauda açık ve koyu alternatif tarafından senkronize edilebilir yeşil algler hücrelerinin çekirdekleri içinde sümük kalıp Physarum polycephalum dev plasmodia bölmek dönem2. Bu tür organizmalar benzersiz deneysel öznitelikleri sunarken, yeterli ölçüde memeli hücreleri karmaşıklığı modeli. Memeli hücre popülasyonlarının yapay olarak eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ve hücre döngüsü kontrol noktaları moleküler temeli ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak yöntemleri serum yoksunluğu, kimyasal blok ve yayın veya fiziksel özellikleri3,4istismar olabilir. Serum geri çekilmesi kez sendika girmek hücreleri neden olur ve yeniden ekleme serum G1 faz5hücre döngüsü iniş teşvik etmektedir. Kimyasal inhibitörleri aşırı timidin G1/S sınır hücreleri engellemek hidroksiüreye veya genellikle hücre M faz3,4tutuklama Mikrotubul inhibitörleri gibi ajanlar içerir. Mitotik sallamak-onlar Interphase hücreleri6' dan daha az yapışık olduğundan kullanılabilecek zenginleştirmek için Mitotik hücre dışı fiziksel özellikleri istismar bir yaklaşım içerir. Ancak, tüm bu tekniklerin potansiyel sakıncaları var. Örneğin, Mitotik sallamak-off olmadan önceki eşitleme Mitotik inhibitörleri ile sınırlıdır sonra tüm hücre tipleri canlılığı serum veya kimyasal inhibitörleri varlığı yokluğu ve hücreleri verimini korumak.
Nerede onlar7bölmek gibi hücreleri aşamalı olarak boyutu küçülür, erken embriyonik hücre döngüsü dışında çoğu hücre döngüsü boyunca ilerleyen büyüme fazları geçmesi ve daha büyük hale. Bu özellik boyut olarak farklı hücreleri ayırmak için kullanılan ve dolayısıyla Hücre döngüsünde8,9aşama kanatlı santrifüj elutriation (CCE), teknikte istismar edilir. CCE sırasında iki karşıt güç etkisi altında hücrelerdir: hücreler dönüş ekseni uzak sürücüler, merkezkaç kuvveti ve dönüş (şekil 1) eksenini karşı hücreleri sürücüler akışkan hızı (kanatlı),. Elutriation odası hücrelerde bu kuvvetlerin eşit olduğu bir denge konuma ulaşmak. Hücre çapı ve yoğunluk denge konumu dikte anahtar faktörlerdir. Akış Arabellek çözüm oranı artar ve kanatlı sürükle kuvvet merkezkaç kuvveti daha ağır basar, hücrelerin odası içinde konumunu bir değişiklik neden yeni bir denge kurulmuştur. Tüm hücreleri ise kanatlı oranı yeterince kendi çıkış tanıtmak için artış kadar büyük hücreleri odası içinde kal küçük olanlar öncelikle, oda bırakarak kaynaklanan odası çıkış doğru kaydırılır. Elutriation odası ardışık kanatlı oranı artış ile kaçan hücreleri belirli kesirler toplanabilir ve her kesir sırayla boyutları artan hücreler içerir. Artımlı kanatlı oranı artış ile elutriation iletken yerine, merkezkaç kuvveti tarafından Santrifüjü hızı azalan sıralı düşüşler aynı sonuca ulaşmak. Elutriation süreç optimizasyonu bağlı olarak hücre tipi, istihdam elutriation arabellek ve kullanılan belirli cihazları gerektirir. Bu koşullar altında hücre sedimantasyon oranı en iyi Stokes yasa ile anlatılan: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2r, nereye SV = sedimantasyon hızı; d = çap parçacık; Ρp = yoğunluğu parçacık; Ρm = yoğunluğu arabelleği; Η viskozite arabelleği; = Ω = açısal hızı Open End; ve r = parçacığın Radyal konumu. Böylece, SV hücre çapı ve yoğunluğu ile doğru orantılıdır ve çapı ikinci kuvvetine yükseltilmiş beri daha da önemlisi hangi hücre döngüsünün genellikle sabittir yoğunluğu daha katkıda bulunur.
CCE önemli bir avantajı hücreleri kimyasal arıtma veya besin yoksunluğu sert koşullara tabi değil ve mükemmel verim aslında soğukkanlı kurtarılabilir olduğunu. Hücre döngüsü Travers olarak söz konusu hücreler çapı, en az % 30, önemli bir artış geçmesi zorunludur. Ana dezavantajı ise özel santrifüj, rotor ve aksesuarları maliyetidir. Yine de, hücreleri belirli hücre döngüsü aşamalarında CCE tarafından zenginleştirilmiş hazırlamak yeteneği büyük ölçüde hücre döngüsü araştırma memeli hücreleri9,10üzerinden Maya organizmalarda kolaylaştırdı. Ayrıca, son gelişmeler kullanır üzerinden kanserli doku, farklı hücre tipleri heterojen karışımları ve belirli hücre tiplerinin immünoterapi9üretim için ayrılması karşı sağlıklı hücreleri ayırma için arttırıyoruz.
Bizim büyük ilgi ajanlar (MTAs) Cezayir menekşesi alkoloidler ve taxanes gibi hedefleme Mikrotubul hareket mekanizması anlamakta olmuştur. Bu ilaçların iğ Mikrotubul işlevi11,12, engelleme sadece mitoz içinde hareket düşünüldü ama onlar da Interphase mikrotübüller13,14hedefleyebilir son kanıtlar gösteriyor. Biz son zamanlarda birincil Akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücreleri ya da ölümde G1 evresi geçmesi veya M yılında vincristine ve hücre döngüsü bağlı şekilde15dakika sonra diğer MTAs ile tedavi ederken aşama bildirdi. Farklı hücre döngüsü aşamaları CCE tarafından tüm hücreler ayrı yeteneği bu sonuca ulaşmada vesile oldu. Bu makalede, biz teknik ayrıntıları açıklamak ve CCE uygulamaya İlköğretim hazırlanması için pratik ipuçları tüm hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Hanks'in dengeli tuz çözeltisi</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L şişe</td></tr><tr><td>Fetal Plus sığır serumu</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL şişe</td></tr><tr><td>2-naftol-6,8-disülfonik asit dipotasyum tuzu</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g toz</td></tr><tr><td>50 mL konsiyel tüpler</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/kutu</td></tr><tr><td>PES Membran 0.22 &mikro; m filtre ünitesi</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/paket</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI w/ Elut. IVD Olmayan - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>santrifüj, elütriasyon sistemi JE</td></tr><tr><td>5.0 elutriator rotor kiti</td><td>ile uyumlu Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>rotor kiti, rotor, T-kollu altıgen anahtar, hızlı serbest bırakma tertibatı (elütriasyon odası olmadan), ankraj kablosu ve flaş tertibatı</td></tr><tr><td>Odası, standart, 4 mL, "A"</td> <td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>Standart Elütriasyon Odası&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Kolay Yük pompa kafası</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Değişken Hızlı Sürücü</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm platinle kürlenmiş silikon pompa hortumu, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1,5 Hassas Kayar iğne</td><td>BD</td><td>305127</td><td>steril, tek kullanımlık iğneler</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok şırınga</td><td>BD</td><td>309604</td><td>steril, tek kullanımlık şırıngalar</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI / RNase boyama tamponu</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>propidyum iyodür / RNaz boyama tamponu</td></tr><tr><td>siklin B1 (GNS1) fare monoklonal IgG antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>siklin D1 (DCS-6) fare monoklonal IgG antikoru</td><td>Noel Baba Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR tavşan monoklonal antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) tavşan monoklonal antikoru</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG (H + L) -HRP konjugatı</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG (H + L) -HRP konjugatı</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

birincil akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj elutriation tarafından

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Hücreleri eşitlemek için yetenek hücre döngüsü Yönetmeliği anlayışımızı ilerleyen merkezi olmuştur. Ortak teknikler istihdam serum yoksunluk içerir; hücreleri farklı hücre döngüsü aşamaları tutuklama kimyasallar; veya Mitotik sallamak-hangi azaltılmış onların bağlılık yararlanan kapalı kullanımı. Ancak, tüm bu dezavantajları var. Örneğin, serum açlık normal hücreleri için iyi ama daha az tümör hücreleri nedeniyle onkogen harekete geçirmek ya da Tümör baskılayıcı kaybı güvenliği aşılan hücre döngüsü kontrol noktaları ile iyi çalışır. Benzer şekilde, kimyasal tedavi hücre popülasyonlarının ilaçla zarar liman ve stres ile ilgili değişiklikler gösterir. Hangi bu sorunları circumvents bir akışlı santrifüj elutriation (CCE), nerede hücreleri iki karşıt güç, merkezkaç kuvveti ve hücre boyutu ve yoğunluğu temelinde ayrılması sonucunda sıvı hız tabi tekniktir. Hücreler arasında geçiş yapma genellikle ilerleyen büyütmek, CCE hücreler farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için kullanılabilir. Burada birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri için bu tekniği uygulamak. Optimal koşullar altında G1 evresi hücrelerde aslında saf bir nüfusa ve G2/M aşama hücre zenginleştirilmiş bir nüfus içinde mükemmel verim elde edilebilir. Bu hücre popülasyonlarının ideal eğitim hücre döngüsü bağlı mekanizmaları eylem antikanser ilaçların ve diğer uygulamalar için uygundur. Biz de nasıl değişiklikler standart bir prosedür olabilir suboptimal performansa yol göstermek ve teknik sınırlamaları tartışıyorlar. Sunulan ayrıntılı metodoloji uygulama ve araştırma tekniği hücreleri diğer türleri için kolaylaştıracaktır.

Birincil tüm hücreleri (3-4 10 x8) için santrifüj elutriation tabi ve toplanan iki yıkama kesirler ve yirmi ana kesirler, iletişim kuralında tanımlandığı gibi. Tablo 1 nerede her kesir hem de karşılık gelen rotor hızı toplam sayısı sunulmaktadır temsilcisi verileri gösterir. Genel olarak verim genellikle üzerinde % 80 oldu. Bu hücre çapı elutriation (Şekil 2) ilerleyen ile artan bireysel kesirler hücre çapı ölçümü doğruladı. Bu sonuçlar iki bağımsı...

Bu iletişim kuralı birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri farklı hücre döngüsü aşamalar halinde ayırmak için santrifüj elutriation açıklar.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Bu prosedürün genel amacı, santrifüjlü elütriasyon kullanarak hücreleri farklı hücre döngüsü fazlarına izole etmektir. Bu yöntem, kanser terapötiği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Çünkü hücrelerin ayrı fazlara ayrılması, anti-kanser bileşiklerinin faza bağlı etkilerinin sorgulanmasına izin verir.Bu tekniğin temel avantajı, kimyasal bozulmalar yerine fiziksel özellikleri kullanarak hücrelerin belirli fazlara ayrılmasına izin vermesidir. Deneyi başlatmak için, flaş düzeneğini, güç kablosu soldaki bağlantı noktasından odadan dışarı beslenecek şekilde santrifüje takın. Flaş lambasını, santrifüj kapalıyken görüntüleme penceresiyle aynı hizada olacak şekilde ayarlayın.Her braketin üst kısmındaki iki yıldız başlı vidayı sıkarak tertibatı yerine sabitleyin. Ve sonra braketin altındaki kelebek vidaları sıkarak. Güç kablosunu, santrifüjün arkasında bulunan flaş güç bağlantı noktasına takın.Ardından, rotorları düz bir şekilde santrifüj tahrik göbeğine yerleştirin ve bir T kollu altıgen anahtarla sıkıca sabitleyin. Ardından, elütriasyon odasını, karşı dengeyi, döner conta tertibatını ve bir montaj plakasını içeren tertibatı rotorun üzerine yerleştirin. Rotor üzerindeki

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, üç lösemik hücre alt popülasyonunun uzamsal olarak ayrılması için bir yöntem açıklanmaktadır: ortamda serbestçe yüzen asılı lösemik hücreler, mezenkimal stromal hücre tek tabakasının yüzeyine yapışan faz parlak lösemik hücreler ve 2D ko-kültürden mezenkimal stromal hücre tek tabakasının altına göç eden faz karartılmış lösemik hücreler.

Lösemik Alt Popülasyon Hasadı: Lösemik Hücre Alt Popülasyonlarının 2D Ko-kültürden Mekansal Olarak Ayrılması İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinin periferik kandan izole edilme tekniği açıklanmaktadır. Bu protokolle, daha sonra nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların verimli bir şekilde üretilmesi için insan hasta kan örneğinden KLL hücrelerini izole edeceğiz.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme: CLL Hücrelerini Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Bu video, lösemik hücrelerden hücresel ve nükleer fraksiyonlar oluşturmak için bir yöntem olan lösemik hücrelerden hücre altı fraksiyonların hazırlanmasını açıklar. Nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlar, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Lösemik Hücrelerden Hücre Altı Fraksiyonların Hazırlanması: Lösemik Hücrelerden Hücresel ve Nükleer Fraksiyonlar Üretmek İçin Bir Yöntem

Kromozomlar gibi lenfositler ya da deri fibroblast gibi canlı hücrelerden izole edilir ve insan ya da fare gibi organizmalardan elde edilebilir. Bu kromozom preparatları ayrıca rutin G-bantlama ve bu in situ hibridizasyon (FISH) floresan, karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH), ve spektral karyotip (SKY) gibi moleküler sitogenetik işlemler için kullanılabilir.

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Mevcut rapor, kemik iliği mikroçevre nişinin lösemik hücreler üzerindeki etkisini, en kemodirençli alt popülasyonun zenginleştirilmesine vurgu yaparak modellemek için kullanılabilecek bir protokolü özetlemektedir.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

Nötrofiller en bol bulunan beyaz kan hücresi türüdür. Nötrofillerin insan kanından yoğunluk gradyan ayırma yöntemi ile izolasyonu ve insan promiyelositik (HL60) hücrelerinin granülositik yol boyunca farklılaşması burada açıklanmaktadır; lenfoma hücrelerinin anti-lenfoma ajanlarına duyarlılığı üzerindeki rolünü test etmek.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

B-LCLs'in kurulması için basit bir kırmızı kan hücre parçalama yöntemi kan küçük bir miktar gerektiren ve dondurarak saklama için başlangıcından itibaren zaman tasarrufu, yüksek ölümsüzleşme verimliliği ile geliştirilmiştir.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil

Bu protokol, primer kronik lenfositik lösemi hücrelerinden nükleer ve sitoplazmik fraksiyonların optimizasyonu ve daha sonra verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu örnekler protein lokalizasyonunun yanı sıra hücre stimülasyonu ve ilaç tedavisi üzerine nükleer ve sitoplazmik bölmeler arasında gerçekleşen protein ticaretindeki değişiklikleri belirlemek için kullanılır.

Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları

Bu protokol, enjeksiyondan 4 gün sonra meydana gelen, hasta kaynaklı B ve T akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerinin in ovo ksenogreftlemesini tanımlar.

Burada: Ovo Hasta Kaynaklı Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) Hücrelerinin Ksenogreftlenmesi (PDX-ALL)

Protokol, indüksiyon kemoterapisine yanıtın dinamiklerine dayalı olarak akut lenfoblastik löseminin nüksetmesine neden olan bir fare modelini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Akut Lenfoblastik Lösemi için İndüksiyon Kemoterapisine Nüks Löseminin Murin Modeli

Öğrenin santrifüj elutriasyon yöntemiyle akut lenfoblastik lösemi hücrelerini farklı hücre döngüsü aşamalarına ayırmayı. Bu teknik, anti-kanser bileşiklerin aşamaya bağımlı etkilerini incelemeye olanak tanır.

Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

Daha fazla video keşfet