Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından

Bu prosedürün genel amacı, santrifüjlü elütriasyon kullanarak hücreleri farklı hücre döngüsü fazlarına izole etmektir. Bu yöntem, kanser terapötiği alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Çünkü hücrelerin ayrı fazlara ayrılması, anti-kanser bileşiklerinin faza bağlı etkilerinin sorgulanmasına izin verir.

Bu tekniğin temel avantajı, kimyasal bozulmalar yerine fiziksel özellikleri kullanarak hücrelerin belirli fazlara ayrılmasına izin vermesidir. Deneyi başlatmak için, flaş düzeneğini, güç kablosu soldaki bağlantı noktasından odadan dışarı beslenecek şekilde santrifüje takın. Flaş lambasını, santrifüj kapalıyken görüntüleme penceresiyle aynı hizada olacak şekilde ayarlayın.

Her braketin üst kısmındaki iki yıldız başlı vidayı sıkarak tertibatı yerine sabitleyin. Ve sonra braketin altındaki kelebek vidaları sıkarak. Güç kablosunu, santrifüjün arkasında bulunan flaş güç bağlantı noktasına takın.

Ardından, rotorları düz bir şekilde santrifüj tahrik göbeğine yerleştirin ve bir T kollu altıgen anahtarla sıkıca sabitleyin. Ardından, elütriasyon odasını, karşı dengeyi, döner conta tertibatını ve bir montaj plakasını içeren tertibatı rotorun üzerine yerleştirin. Rotor üzerindeki cıvatalar yerine oturana kadar bir elinizi aydınlatma odasına, diğer elinizi de karşı dengeye yerleştirerek eşit şekilde aşağı doğru itin.

Kablonun bir ucunda bulunan pimi, dönen conta tertibatındaki deliğe yerleştirin. Ve diğer uçtaki göz deliğini, ankraj kablosunu bağlamak için brakete takılan yıldız başlı vidalardan biriyle sabitleyin. Akış sistemini monte etmek, tamponu elütriasyon odasının içine ve dışına pompalamak için 16 numara boruyu değişken hızlı bir pompaya bağlayın.

Bu borunun bir serbest ucunu, santrifüj odasının sol üst köşesindeki bir bağlantı noktasından, odaya girecek şekilde yerleştirin. Bu borunun serbest ucuna bir bağlantı parçası takın ve ardından bağlantı parçasını dönen conta tertibatının giriş deliğine yerleştirin. Son olarak, dönen conta tertibatının üst kısmındaki transfer borusuna takmak için çıkış borusunu bir bağlantı noktasından geçirin.

Elütriasyon sistemi monte edildikten sonra, giriş borusunun diğer serbest ucunu %5 çamaşır suyu ile doldurulmuş 500 mililitrelik bir şişeye yerleştirerek sterilize edin. Ve çıkış borusunu bir litrelik boş bir atık şişesine yerleştirin. Ardından, pompayı açın ve çamaşır suyunun atık şişesine pompalanana kadar elütriasyon sistemi boyunca tamamen akmasına izin verin.

Şimdi, santrifüjü açın ve kabarcıkları ve geri basıncı serbest bırakmak için belirlenen maksimum hıza gelmesine izin verin. Ayarlanan hıza ulaşıldığında, santrifüjü durdurun. Rotor tamamen durduktan sonra kapağı açın ve haznede sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Daha sonra, benzer bir şekilde, daha önce tarif edildiği gibi, sistemden 10 dakika boyunca steril su akıtın. Su ile yıkadıktan sonra, su haznesini 100 mililitre elütriasyon tamponu ile doldurulmuş steril bir cam şişe ile değiştirin. Giriş borusunu en altta olacak şekilde bu şişeye yerleştirin.

Santrifüjü başlatın ve tamponun sistemden akmasına izin verin. Rezervuar şişesi boşalmaya yakın olduktan ve su sistemden tamamen boşaltıldıktan sonra, çıkış borusunu atık şişesinden rezervuara taşıyın, böylece tampon sistem boyunca sürekli olarak geri dönüştürülür. Son olarak, flaş lambasını açın ve aydınlatma düğmesini en sola çevirin.

Şimdi, düğmeyi yavaşça sağa çevirerek görüntüleme penceresini ayarlayın, böylece elütriasyon odası net bir şekilde görülür ve flaş ışığı rotorun hızıyla senkronize olur. Hücre örneğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın. Yeniden askıya alınan hücreleri, geri dönüşüm lütriasyon tamponunu içeren rezervuar şişesine ekleyin.

Hücrelerin sisteme girmesine ve elütriasyon odası içinde dengeye ulaşmasına izin verin. Tüm hücrelerin haznede tutulduğundan emin olmak için, bir cam slayt üzerine bir damla eluent alın ve mikroskop altında görüntüleyin. Numune sağlam hücrelerden yoksunsa, odadaki tutmayı doğrular.

Tüm hücreler odaya girdikten ve odanın en beyaz kısmında, hücreleri ve dengeyi içeren belirgin bir sınır görüldükten sonra, fraksiyonları toplamaya başlayın. Çıkış borusunu W1 etiketli, önceden soğutulmuş 50 mililitrelik bir konik tüpe taşıyın. Bu tüpte 50 mililitre elütriasyon tamponu toplayın ve buz üzerinde saklayın. W1 fraksiyonunu topladıktan kısa bir süre sonra, santrifüj hızını 821 G'ye düşürün ve çıkış tüpünü W2 etiketli konik tüpe taşıyın ve bu hızda 50 mililitre daha toplayın.

Hızı değiştirmeye ve kesirleri toplamaya devam edin. Rezervuar tankında orta olduğundan emin olun ve toplanan fraksiyonları daima buz üzerinde saklayın. Tüm fraksiyonlar toplandıktan sonra, santrifüjü durdurun ve durdur etiketli konik bir tüpte 50 mililitre toplayın.

Fraksiyonların her birinde toplanan pelet hücreleri ve gerektiği gibi akış sitometrisi veya batı lekeleme gibi aşağı akış analizi kullanılır. Ardışık elütriasyon fraksiyonlarındaki hücrelerin ortalama çapını gösteren bir çizgi grafiği gösterilir. Hücre çapı ne kadar büyükse, çıktığı kesir sayısının o kadar yüksek olduğunu unutmayın.

Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama analizinden elde edilen sonuçlar, 20 elütriasyon fraksiyonunun her birindeki hücrelerin DNA içeriğini gösterir. Erken fraksiyonlar, F1'den F5'e kadar, neredeyse sadece G1 fazındaki hücreleri temsil eden 2N DNA içeriğine sahip hücreleri içerir. G1 ve S fazlarındaki hücrelerin bir karışımı, F6 ila F9 arasındaki ara fraksiyonlarda görüldü. Ve G2'den M'ye kadar olan hücreleri temsil eden 4N DNA içeriğine sahip hücreler, F10'dan başlayarak gözlendi.

Burada gösterilen, G1 fazındaki ve G2'den M fazına kadar olan hücrelerin havuzlanmış fraksiyonlarında hücre döngüsü ile ilgili proteinlerin seviyelerinin araştırılmasından elde edilen western blot sonuçlarıdır. G2'den M'ye Havuz, beklendiği gibi G1 Havuzuna kıyasla daha yüksek Fosfo-Rb ve Siklin B seviyelerine sahipti. Cyclin D bir sinyal zayıftı, ancak yine de G1 Havuzunda tespit edilebilirdi ve G2 ila M Havuzunda tespit edilemedi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa üç saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, zaman ayırmayı unutmamak ve elütriasyon sisteminin doğru bir şekilde monte edildiğinden ve tüm malzeme ve solüsyonların hazırlandığından emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, terapötik bileşiklerin hücre döngüsü fazına bağlı bir şekilde nasıl hareket edebileceğini sorgulamak için hücre döngüsü analizi, hücre canlılığı deneyleri ve immünoblotlar gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.