Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu deneyin genel amacı, kuyruklu yıldız testi olarak da adlandırılan tek hücreli bir elektroforez testi kullanarak kanser hücrelerinde genotoksik ajanların etkinliğini araştırmaktır. Bu prosedür, dört genetik toksikolojik çalışmayı ölçmek için bir anlam ifade eder. Ve daha önceki ilaç adayı seçimi ve DNA hasarı ve onarımındaki temel araştırmalar gibi farklı değerlendirmeler için geçerlidir.

Bu teknik, DNA hasarını kantitatif olarak değerlendirmek için doğrudan bir yol sağlar. Ve verimli, gerçekleştirmesi kolay ve nispeten ucuzdur. Yüzde bir agarozu bir mikrodalgada iki ila üç dakika veya agaroz tamamen eriyene kadar eriterek agarozu slayt kaplama için hazırlayın.

Bir cam mikroskop slaytını agarozun içine batırın ve slaytın bir tarafını silmek için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Slaytı kuruması için düz bir yüzeye koyun. Kuruduktan sonra şeffaf bir agaroz filmi oluşturulmalıdır.

Kaplanmış slaytları kullanmadan önce 37 santigrat dereceye yerleştirin. Kemoterapinin terapötik etkisi, %10 FBS, mililitre başına 100 birim penisilin ve mililitre başına 10 mikrogram streptomisin ile desteklenmiş DMEM / Ham F-12 ortamında kültürlenen U251 glioma hücrelerinde değerlendirilir. Hücreleri üç dakika boyunca bir mililitre tripsin kullanarak sindirin ve ardından FBS ile DMEM / Ham F-12 ortamı kullanarak tripsini nötralize edin.

Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Ve dört dakika boyunca 300 kez G'de döndürün. Ortamı aspire edin.

Ve hücreleri 1x PBS'de mililitre başına 10 ila beşinci hücre olmak üzere iki kez askıya alın. Hücreler ve teste başlamadan hemen önce hazırlanmalıdır. Ve karanlıkta ele alınmalıdır.

Hasarı önlemek için hepsi loş ışıkta. Hücre süspansiyonunu, bir ila 10 hacim oranında yüzde bir erimiş, düşük erime noktalı agaroz ile birleştirin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.

Ve hemen 30 mikrolitreyi bir slayta pipetleyin. İnce bir tabaka oluşumunu sağlamak için agaroz karışımını yaymak için pipet ucunun sürgüsünü kullanın. Slaytları karanlıkta 10 dakika boyunca dört santigrat derecede düz bir şekilde yerleştirin.

Slaytları karanlıkta bir saatten gece boyunca dört santigrat derece lizis çözeltisine daldırın. Alkali kuyruklu yıldız tahlili için, slaytları lizis çözeltisinden nazikçe çıkarın, fazla sıvıyı boşaltın ve DNA'nın gevşemesine izin vermek için slaytları karanlıkta bir saat boyunca dört santigrat derecede AES'e yavaşça daldırın. Elektroforez slayt tepsisine önceden soğutulmuş AES ekleyin.

Slaytların üzerinde 0,5 santimetreyi aşmayın. Slaytları içine yerleştirin ve bir kapakla örtün. Güç kaynağı voltajını santimetre başına bir volta ayarlayın ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede çalıştırın.

Elektroforez tamamlandığında, slaytlardaki fazla AES'yi boşaltın. Slaytları her seferinde beş dakika boyunca oda sıcaklığında damıtılmış suya iki kez yavaşça batırın. Bundan sonra, slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 70 etanole yavaşça batırın.

Nötr kuyruklu yıldız tahlili için, slaytları lizis çözeltisinden nazikçe çıkarın, fazla sıvıyı boşaltın ve karanlıkta 30 dakika boyunca dört santigrat derecede NES'e yavaşça daldırın. Elektroforez slayt tepsisine, slaytların 0,5 santimetreyi aşmayacak şekilde önceden soğutulmuş NES ekleyin. Slaytları içine yerleştirin ve bir kapakla örtün.

Güç kaynağı voltajını santimetre başına bir volta ayarlayın ve 45 dakika boyunca dört santigrat derecede çalıştırın. Slaytlardaki fazla tamponu boşaltın. Slaytları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında DNA çökeltme çözeltisine yavaşça daldırın.

30 dakika sonra, slaytları 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 70 etanole yavaşça daldırın. Slaytları karanlıkta 37 santigrat derecede 10-15 dakika kurutarak bu işleme başlayın. Daha sonra, 50-100 mikrolitre yeşil floresan nükleik asit boyama solüsyonunu her bir slaydın kurutulmuş agarozun üzerine yerleştirin ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyayın.

Slaytları damıtılmış suda kısa bir süre durulayın ve karanlıkta 37 santigrat derecede tamamen kurulayın. Kuyruklu yıldız slaytlarını boyadıktan hemen sonra görüntü elde etme ve analiz yapın. Slayt tutuculu bir floresan mikroskobu altına bir slayt yerleştirin.

10X objektif lensini seçin ve agaroz jelin objektif lensine baktığından emin olun. Her lekeli kuyruklu yıldız slaytından rastgele görüntüler yakalayın. Kenarlardan ve hava kabarcıklarının etrafındaki alanlardan kaçının.

Her kuyruklu yıldız kuyruğunun yatay olarak dağıtıldığından emin olun. Kuyruklu yıldız başları soldan, kuyruk ise sağdan çıkmalıdır. Her resmi parlak DNA lekesi ve koyu arka plan ile ikili bir formatta kaydedin.

Görüntü analizi için, önce araç çubuğunun solunda bulunan Analiz Edilecek Dosyaları Seç düğmesini kullanarak tüm görüntüleri kuyruklu yıldız tahlil yazılımına yükleyin. Bir görüntü görüntüleme penceresi görünmelidir. Ekranda bir ölçüm çerçevesi çizin ve boyutunu hücrenin kuyruklu yıldızına göre ayarlayın.

Görüntüye göre baş, kuyruklu yıldız ve kuyruğun eşiğini ayarlamak için ayarla'ya tıklayın. Ve sonra Ölçümleri Başlat'ı tıklayın. Çerçeveyi kullanarak bir hücre seçin ve Kuyruklu Yıldızı Tahlil Et düğmesine tıklayarak ölçümü etkinleştirin.

Profiller penceresinde, seçilen ölçüm parametreleriyle birlikte bir yoğunluk görüntüsü görünecektir. Sonuçları Sakla düğmesine tıklayarak sonuçları kaydedin. Tedavi başına en az 50 hücreyi analiz edin.

Alkali ve Nötr kuyruklu yıldız tahlillerinden elde edilen sonuçlar, doksorubisin ile muamele edilen UT51 hücrelerinin kuyruklu yıldız kuyruklarının daha uzun olduğunu ve daha yüksek DNA yoğunluğuna sahip olduğunu göstermektedir, bu da önemli bir parçalanmış DNA birikimine işaret etmektedir. Alkali veya Nötr kuyruklu yıldız tahlili için kantitatif analiz, doksorubisin tedavilerinden sonra önemli ölçüde artmış kuyruklu yıldız kuyruğu oluşumunu gösterdi ve bu da DNA hasarını gösterdi. Bir PARP inhibitörü, olaporib ve bir alkilleyici ajan olan temozolomidin bir kombinasyon tedavisi, kuyruklu yıldız kuyruğu sinyalinin artan uzunluğu ve yoğunluğu ile yansıtılan glioma hücrelerinde DNA hasarını önemli ölçüde arttırdı.

Olaporib tek başına, DNA hasarına neden olmadı. Temozolomidin genotoksik etkisini güçlendirdiği gibi. Tek ve kombinasyon tedavileri altındaki glioma hücrelerinin temsili görüntüleri, temozolomid ve olaporib ile tedavi edilen hücrelerin daha uzun ve daha yüksek yoğunluklu kuyruklu yıldız kuyruklarını gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa beş saat içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, genotoksisite alanındaki araştırmacıların birçok ukaryotik hücre tipinde DNA dizisi kopmalarını ölçmesinin yolunu açtı. Kültürlenmiş hücreler veya organizmalardan izole edilen hücreler gibi.

Bu videoyu izledikten sonra, tek hücre düzeyinde bir genotoksik ajanın etkinliğini araştırmak için kuyruklu yıldız testinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Hasar reaktifi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Ve bu prosedürü uygularken laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemler her zaman alınmalıdır.