Name: Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Öğrenin kanser hücrelerinde DKK3'ün lobopodia oluşumunu ve hücre adezyonunu nasıl artırdığını. Bu yöntem, tümör hücresi davranışlarını anlamak için basit ve uyarlanabilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ohse Grant Vakfı Bu eser finanse.

1. hücre uzantısı özellikleri
<ol><li>SW-13, SW-Neo ve CO2 ' Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 fetal sığır serum ve 10.000 U/mL penisilin ve streptomisin ('büyüme aracı olarak' belirlenmiş) ile desteklenmiş bir standart oksijen kuluçka 37,0 ° C'de ve %5 SW-DKK3 hücreleri korumak.<ol>
<li>Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve iyi SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hat başına 5000 hücre ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme aracı olarak steril cam coverslips üzerinde büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her şey için gecede büyüme Aspire edin sonra büyüme orta, hücreleri 1 mL sıcak fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın ve hücreleri % 3.7 formaldehit 10 dk 1 mL ile düzeltin.</li>
	<li>Her şey ile 1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk. yıkama aşırı aspiratı formaldehit ve leke hücrelerinde uzak üç yıkama 1 mL deiyonize su kullanarak boya. Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için boyama arka plan çıkarmak için gerekli olabilir.<ol>
<li>İnce uçlu forseps kullanarak, coverslips almak ve yüzü aşağı bir damla temiz montaj reaktif etiketli cam Slayttaki yer onları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Işık mikroskobunda rastgele her coverslip hücre uzantısı tahlil için hücrelerin üst üste 20 sayısı seçin.<ol>
<li>Photomicrographs her görüş alanı 400 x büyütme oranında al. Doğrudan uzantısı türlerinin her biri 20 temsilcisi hücreleri için saymak. Not: Bu nedenle, güvenilir sonuçlar alabilmek sınanan her koşul için 20 izole hücreler incelenmesi gerekir. Filopodia 5 mikron veya daha az bir üs ve tek bir tepe ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lobopodia bir üs 5 ila 20 mikron, birden çok apices uzunluğu içeren uzantıları ile hücresel uzantıları tarafından tanımlanan. Lamellipodia 20 mikron uzunluğunda olan veya olmayan apices daha büyük hücre uzantıları tarafından tanımlanan. Test edilmiş hücre türüne bağlı olarak hücre uzantıları boyutları farklı olabilir ve parametreleri tanımlama arıtma gerektirebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her hücre türü (Yani, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) her hücre uzantısında muayene 6 kuyular arasında belirlemek.</li>
	<li>Bir tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) istatistiksel test kullanarak, hücre zarının uzantıları farklı test hücre tipleri arasında ortalama yüzdesini farklılıkları karşılaştırın.</li>
</ol>2. yapışma tahlil
<ol><li>SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 hücreleri 37,0 ° C ve % 5 CO2 büyüme orta'de standart bir oksijen kuluçka korumak.<ol>
<li>Bir hemasitometre kullanarak, say ve iyi başına 100.000 hücre SW-13, SW-Neo ve SW-DKK3 ayrı 6-şey kalıplara plaka ve gecede büyüme ortamında büyümek.</li>
		<li>Her biri aşağıda test 6 belirlenen zaman puan için bir tabak kullanarak tohum 6-şey plakaları her hücre türü için test. Not: Zaman Puan farklı hücre tipleri için farklı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gecede kuluçka sonra sıcak PBS bir kez yıkama hücrelerle sonra her şey için 0.5 mL 1 x enzimatik olmayan hücre ayrılma çözümü ekleyin.<ol>
<li>Hücre ayrılma çözümü yaymak için plaka girdap. Tanımlanan zaman noktaları (Yani, 1, 2, 3, 5, 10 ve 15 dk) belirlenen plaka Aspire edin ve sonra üç kez 1 mL sıcak PBS solüsyon ile yıkayın.</li>
		<li>Yıkama arasında hafifçe gevşek bağlı hücreler ayırmak plakalara dokunun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kalan PBS ve kalan hücreleri ile 1 mL % 3.7 formaldehit 10 min için plaka bağlı düzeltme Aspire edin.</li>
	<li>1 mL % 0.05 kristal Menekşe 30 dk için hücrelerle leke sonra aşırı boya uzak 1 mL deiyonize su ile yıkayın. Hücre görselleştirme tanıtmak için yıkama titre. Not: boya alımı düzeyine bağlı olarak, birkaç ek yıkar hücre görselleştirme tanıtmak için gerekli olabilir.</li>
	<li>100 x büyütme hafif bir mikroskop kullanarak, her şey her tabak içinde kalan ekli hücreleri saymak. Not: Saydam cetvelleri veya ince kalem kılavuzları plaka alt tarafında işaretleme kullanımı tekrarlanan aynı hücreleri sayma önlemek için yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Her plaka için iyi başına bağlı hücre ortalama sayısını belirleyin.</li>
	<li>SW-13, SW-Neo ve SW-DDK3 hücreleri arasında hücre dekolmanı kullanarak iki yönlü ANOVA istatistiksel test belirli bir dönem içinde oranı karşılaştırın.</li>
</ol>

<ol><li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+cancer%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li>
<li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer%3A+the+emerging+role+of+Dickkopf-3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297(2016).</li>
<li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin%3A+Invasive+filopodia+promoting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li>
<li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164(2017).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905(2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada hücre uzantıları kolaylığı, birkaç çukur-falls ve çeşitli test koşulları uygulanabilir güvenilir tekrarlanabilirlik ile karakterize bir vitro nicel yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, basit, ölçülebilir yapışma ve/veya hareketliliği deneyleri fonksiyonel önemini potansiyel: hücre zarı uzantılarında gözlenen değişiklikler ilişkilendirmek için aynı anda gerçekleştirilebilir.
Ancak, bu yöntemlerin olası bazı sınırlamalar takdim edebilir miyim? İlk, burada hücre uzantıları farklı türl...

Dysregulated WNT sinyal Adrenokortikal maligniteler1' de kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri DKK3 susturmak, WNT sinyal, negatif bir regülatör adrenal korteks dedifferentiation olayını temsil eder ve bağlamında tümör oluşumu hücre-uzantı repertuar değişir teşvik olup olmadığını araştırmak. DKK3 38 kDa ile bir N-terminal sinyal peptid glikoprotein salgılanan ve önceki çalışmalar zorunlu ifadesini hücre döngüsü tutuklama sonuçlandı, saldırgan kötü huylu davranış inhibe ve Mezenkimal epitel ters göstermiştir olduğunu geçiş2.
Adrenokortikal Karsinom (ACC) ve diğer kanser Malign davranışını tümör hücreleri çevreleyen yüzeyler ile arayüz yeteneği etkisinde bölümünde sırayla tümör hücre işgali kolaylaştırır hücre dışı matriks dahil olmak üzere ve geçiş3. Öncelikle filopodia oluşumu ile çeşitli bağlamlarda belirli hücre zarı kanseri ilerleme uzantılarında rolünün giderek gösterilen. Örneğin, overexpression L tipi kalsiyum kanal filopodia oluşumu teşvik ve tümör hücre işgali4teşvik bulundu. Benzer şekilde, Fascin, en az bağlayıcı protein bağlıdır bir aktin dokusu normal ifade de kanser hücrelerinin filopodia oluşumu5ile birlikte overexpressed mevcuttur. Lobopodia oluşumu sağlar etkili ekstra hücresel matris ile geçirmek non-Malign fibroblastlar, Fibrosarkom hücreleri metalloproteinaz etkinliği hücre geçişi kolaylaştırmak için lobopodia yerine itimat gösterilmiştir ancak, ve istila6. Biz o tümörü göstermiştir bastırıcılarının Ras Derneği etki alanı aile 1 izoformu (RASSF1A) de dahil olmak üzere ve DKK3, hücre iskeleti öğeleri değiştirebilir ve lamellipodia oluşumu teşvik ve invaziv özellikleri7,8taş koymak için işlev görebilir.
Bu nedenle, bu genlerin karsinojenezis ve hücre zarının uzantısı değişiklikler, özellikle filopodia, lobopodia ve lamellipodia oluşumu test koşullarında değerlendirilmesi ile ilişkilerini katılan etkileri karakterize etmek için önemlidir. Geçerli state-of-art teknikleri veri toplama ve yorumu giderek karmaşık mikroskobu yöntemleri, floresan etiketleme ve/veya karmaşık bilgisayar algoritmaları kullanımını içerir. Bu yöntemler yeni ve güçlü analitik araçlar sağlarken, kendi karmaşıklığı onların yaygın kullanımı ve adaptasyon hücre biyolojisi deneylerde sınırlar. Ayrıca, kesin miktar ve hücre uzantısı Morfoloji değişimler gözlenmesi değil genellikle ölçülen9,10. Buna ek olarak, biz doğru bir şekilde standart mikroskobik teknikler ve kolayca adapte vitro yöntemleri kullanarak hücre uzantısı değişiklikler quantifies bir teknik tanıtmak. Bu yöntemler aynı zamanda her hücre uzantı türü aynı anda her hücre analiz için sayısal ve hücre zarının uzantısı repertuar genel değişiklikleri belirlemek. Biz de nasıl bu değişiklikler hücre adezyon özellikleri için ilgili olabilir gösterir.
Deneysel örnek olarak, önceden oluşturulmuş hücre kültürünü SW-13, SW-DDK3, stabil pCMV6-giriş/DKK3 plazmid vektörleri ile transfected ve yapısal DKK3, böbrek üstü bezi bir farklılaştırıcı faktör overexpresses belirlenmiş kullanacağız. Sigara transfected SW-13 hücreleri ve stabil SW-Neo, belirlenmiş boş ile vektör (pCMV6-giriş), transfected SW-13 hücreleri deneysel denetimler olarak görev yapacak.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td> <td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>Fetal sığır serumu ve penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş</td></tr><tr><td>Deulbeco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X çözeltisi, doğrudan</td></tr><tr><td>% 3.7 formaldehit ve nbsp kullanılır;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Seyreltik stok çözeltisi</td></tr><tr><td>% 0.05 kristal viyole&nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>Seyreltik stok çözeltisi</td></tr> 400X büyütmeli <tr><td>deiyonize su</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Mikroskobu&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hücre ayrışma çözeltisi enzimatik olmayan 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&nbsp;</td><td>1X çözüm, doğrudan kullanılır</td></tr></tbody></table>

hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Hücre zarı'nın uzantısı repertuar onların ya da göçmen potansiyelleri de dahil olmak üzere kanser hücrelerinin çeşitli kötü huylu davranışlar modüle. Nasıl hücre sinyallemesi olayların etkisi kanser hücre davranış ve saldırganlık belirlemek için kritik doğru şekilde sınıflandırmak ve hücre uzantıları ölçmek ve bir hücrenin yapışkanlı kapasitesi üzerindeki etkisini ölçmek için yeteneğidir. Burada, vitro tasarım ve bir hücre uzantısı quantification yöntemiyle birlikte kurulan vitro modelinde bir yapışma kapasite tahlil Adrenokortikal Karsinom (ACC) için kullanımını açıklar. Özellikle, DKK3, sözde Tümör baskılayıcı ve bir yanlısı farklılaşma faktörü üzerine etkileri membran uzantısı fenotip ACC hücre satırının SW-13 test ediyoruz. Biz nispeten basit, güvenilir sağlamak için bu deneyleri teklif ve kolay yorumlanabilir ölçümleri bu özellikleri çeşitli deneysel koşullarda ölçer.

Yukarıdaki deneyleri kullanarak, hücre uzantısı morfoloji ve hücre adezyon özellikleri DKK3 overexpression etkileri kurulan ACC hücre hattında SW-13, vitrotest edildi. DKK3 overexpressing hücreleri stabil Myc-DDK etiketli pCMV6-giriş/DKK3 plazmid Vektörler ve SW-DKK3 belirlenmiş hücrelerle SW-13 transfecting tarafından üretildi. Benzer şekilde, stabil boş vektör pCMV6-giriş ile transfected hücreleri transfection ve passaging denetimi olarak oluşturulan ve SW-Neo olarak tanımlanmı...

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Genel amaç, deneysel değişikliklerin hücre genişleme repertuarı üzerindeki etkisini ve bunun kanserde hücre adezyon fonksiyonu ile nasıl ilişkili olduğunu belirlemektir. Bu yöntem, hücre zarı uzatma repertuarının hücre yapışması, motilitesi ve istilası gibi hücre davranışını modüle etmedeki temel rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin nispeten basit olması ve çeşitli deneysel koşullara kolayca uyarlanabilmesidir.Bu tekniğin etkileri, lokal olarak ilerlemiş veya metastatik kanserlerin tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü adeziv ve invaziv kapasitelerde tümör hücresindeki değişikliklerle ilişkili hücre uzantısı repertuarındaki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmeye yardımcı olur. Hücre uzantısı oluşumunda ve normal fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı bilinen iyon kanalı düzenlemesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi ve kaydedilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücre uzatma adımlarının sayımının, zaman zaman görünümlerinin incelikleri nedeniyle öğrenilmesi zordur.Görüntülemeden bir gün önce, bir hemositometre kullanarak 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit inkübatörde büyütülen SW 13, SW Neo ve SW DKK3 hücrelerini sayın. Steril cam lamelleri üç altı kuyulu plakadan oluşan ayrı kuyucuklara yerleştirin. Her hücre hattı için ayrı bir plaka kullanın ve üç hücre hattını bu altı kuyucuk plakasına oyuk başına 5.000 hücre yoğunluğunda kaplayın.Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, her kuyudan büyüme ortamını aspire edin. Ardından, hücreleri bir mililitre ılık PBS'de yıkayın.Daha sonra, hücreleri sabitlemek için her bir kuyucuğa bir mililitre yüzde 3.7 formaldehit ekleyin. Hücreleri 10 dakika fiksatifte bırakın. Fiksasyon yapıldıktan sonra formaldehiti aspire edin.Hücreleri 30 dakika boyunca boyamak için her oyuğa bir mililitre yüzde 0.05 kristal menekşe ekleyin. Daha sonra, hücreleri kuyucuk başına üç kez bir mililitre deiyonize su ile yıkayarak fazla lekeyi temizleyin. Ardından, etiketli bir cam slayt üzerine bir damla şeffaf montaj reaktifi yerleştirin.Ardından, ince uçlu forsepsler kullanarak, lamelleri nazikçe alın ve yüzleri aşağı bakacak şekilde montaj reaktiflerinin üzerine yerleştirin. Tüm lekeli lamellerin slaytlara monte edilmesinden sonra, ışık mikroskobu altında, her bir lamel arasından örtüşmeyen hücrelerin rastgele 20 görünümünü seçin. Her görüş alanı için 400 güç büyütmeli fotoğraf mikrografları çekin.Ardından, 20 temsili hücrenin her birindeki uzantı türlerinin sayısını gözlemleyin ve sayın. Membran uzantısını filopodia, lobopodia veya lamellipodia olarak sınıflandırmanıza rehberlik etmesi için tanımları ve metin protokolünü kullanın. Hücre uzantısı türlerini ilk kez sayarken, gözden geçirilmek üzere bir referans görüntüsü bulundurmak yararlı olabilir.Mümkünse, deney örneklerine göre kör bir şekilde saymak ek nesnellik sağlayacaktır. İncelenen üç hücre satırının her birinde, hücre başına her türün ortalama uzantı sayısını belirleyin. Farklı hücre tipleri arasındaki hücre zarı uzantılarının ortalama yüzdesindeki farkı test etmek için tek yönlü anova kullanın, istatistiksel olarak anlamlıdır.Testten bir gün önce, bir hemositometre kullanarak, SW 13, SW Neo ve SW DKK3 hücrelerini sayın. Bu hücreleri, test edilecek altı belirlenmiş zaman noktasının her biri için bir plaka kullanarak altı kuyucuklu plaka halinde 100.000 hücre yoğunluğunda plakalayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.Ertesi gün, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücreleri bir kez ılık PBS ile yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 0.5 mililitre tek mukavemetli enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Eklenen çözeltiyi eşit şekilde yaymak için plakaları hafifçe döndürün.Plakaları belirli süreler boyunca çözelti ile inkübe edin. Her zaman noktasının sonunda belirlenen plakayı aspire edin. Her aspirasyondan kısa bir süre sonra, hücreleri bir mililitre ılık PBS ile yıkayın.Ardından, gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun. Yıkamayı aralıklı vurma ile birlikte iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, kalan PBS'yi aspire edin ve plakada kalan hücreleri bir mililitre yüzde 3.7 formaldehit ile sabitleyin.Fiksasyon yapıldıktan sonra formaldehiti aspire edin. Ardından, hücreleri lekelemek için her oyuğa bir mililitre yüzde 0.05 kristal menekşe ekleyin. Boyama tamamlandıktan sonra, hücreleri kuyucuk başına üç kez bir mililitre deiyonize su ile yıkayarak fazla lekeyi temizleyin.100 kuvvet büyütmede bir ışık mikroskobu kullanarak, her plaka için her bir oyukta kalan bağlı hücreleri sayın. Ardından, test edilen üç hücre hattı için farklı zaman noktalarında ayrılmış kalan hücrelerin yüzdesini belirleyin. İki yönlü bir varyans kullanılarak, üç hücre hattı arasındaki farkların ve hücre ayrılma oranlarının test edilmesi istatistiksel olarak anlamlıdır.Kristal viyole lekeli kontrol SW 13 ve SW Neo hücreleri çoğunlukla filopodia ve lamellipodia oluşmuştur. Buna karşılık, DKK3 eksprese eden hücreler, lamellipodia neredeyse tamamen yokluğu ve çok az filopodia ile daha fazla lobodoria oluşturdu. Ayrıca, DKK3 eksprese eden hücreler ile kontrol hücresi hatları arasındaki polarite farklılıklarına dikkat edin.Grafik, test edilen üç hücre dizisindeki farklı hücre uzantılarının oranını gösterir. DKK3 eksprese eden hücrelerde önemli ölçüde daha yüksek lobobodia oranına dikkat edin. Çizgi grafikler, X ekseninde belirtilen zaman noktaları için ayrışma çözeltisi ile işlemden sonra plakaya bağlı kalan hücrelerin yüzdesini gösterir.10 dakikaya kadar olan tüm zaman noktalarında, DKK3 eksprese eden hücreler, kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hücre bağlanma gücü gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak deney kurulumunuza bağlı olarak bir ila iki günlük zaman diliminde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre uzantısı morfolojisindeki değişikliklerin adeziv kapasitesini nasıl etkilediğini değerlendirmeyi unutmamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücresi yapışma özelliklerindeki değişikliklerle ilgili olarak hücre uzantılarının nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. İyi şanslar ve izlediğiniz için teşekkürler.

characterization-cell-membrane-extensions-studying-their-roles-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kanser Hücreleri Endotel Hücre Tek tabakalı Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Bir yöntem olup kollajen tip I ve primer insan fibroblast oluşan bir 3-boyutlu matrisi hazırlanması için tarif edilmektedir. Bu doku stroma temel özelliklerini taklit eder ve mikroskopi birçok formları için müsait olduğundan bu organotipik jel invaziv hücre göçü değerlendirmek için yararlı bir substrat olarak hizmet vermektedir.

Organotipik Kollajen Ben Assay: 3-Boyutlu Bağlamında Hücre Davranışı değerlendirin A Dövülebilir Platformu

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu videoda, substrat sertliğine bağlı olarak varyasyonlarını anlamak için birincil insan kolon kanseri hücrelerinde hücre iskeleti ve fokal adezyonları inceleme tekniği açıklanmaktadır. Yumuşak ve sert substratlar üzerindeki bu kanser hücresi kültürü, kanser prognozu için çeşitli aşağı akış biyofiziksel ölçümlere izin verir.

Hücre İskeleti ve Fokal Adezyon Organizasyon Testi: Hücre Adezyonunu ve Substratlar Üzerine Yayılmasını İncelemek İçin İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Bu makalede, floresan daha düzeltme ve 3D-hücre kültürleri canlı görüntüleme için kullanılabilir kollajen etiketlemek için bir yöntem sunar. Ayrıca 3D ortamlarda kültür hücrelerinin endojen iskelet proteinleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir protokol sağlar.

3D İnvaziv Kanser Hücrelerinin Sitoskeletal Örgütü ortaya

Mesane kanseri istila yönetim süreçleri biyomarker ve terapötik geliştirme fırsatları temsil eder. Burada hangi 3-b kültür tümör pulcuklarının, hızlandırılmış görüntüleme ve confocal mikroskobu birleştirmek bir mesane kanseri istila modeli mevcut. Bu teknik invaziv işlem özelliklerini tanımlamak için ve terapötik ajanlar süzmek için yararlıdır.

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bu yöntem, hücresel yapışmanın erken dinamiklerini ölçmek ve ankraja bağlı hücrelerin fibronektin üzerine yayılması için yararlıdır. Ayrıca, bu tetkik hücre yayılımı ve / veya hücre adezyonu ile ilgili hücre içi sinyal yolları üzerinde değişmiş redoks homeostaz etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.

MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi

Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Öğrenin kanser hücrelerinde DKK3'ün lobopodia oluşumunu ve hücre adezyonunu nasıl artırdığını. Bu yöntem, tümör hücresi davranışlarını anlamak için basit ve uyarlanabilir bir teknik sunar.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet