Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Genel amaç, deneysel değişikliklerin hücre genişleme repertuarı üzerindeki etkisini ve bunun kanserde hücre adezyon fonksiyonu ile nasıl ilişkili olduğunu belirlemektir. Bu yöntem, hücre zarı uzatma repertuarının hücre yapışması, motilitesi ve istilası gibi hücre davranışını modüle etmedeki temel rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, gerçekleştirilmesinin nispeten basit olması ve çeşitli deneysel koşullara kolayca uyarlanabilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, lokal olarak ilerlemiş veya metastatik kanserlerin tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü adeziv ve invaziv kapasitelerde tümör hücresindeki değişikliklerle ilişkili hücre uzantısı repertuarındaki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmeye yardımcı olur. Hücre uzantısı oluşumunda ve normal fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı bilinen iyon kanalı düzenlemesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi ve kaydedilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü hücre uzatma adımlarının sayımının, zaman zaman görünümlerinin incelikleri nedeniyle öğrenilmesi zordur.

Görüntülemeden bir gün önce, bir hemositometre kullanarak 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit inkübatörde büyütülen SW 13, SW Neo ve SW DKK3 hücrelerini sayın. Steril cam lamelleri üç altı kuyulu plakadan oluşan ayrı kuyucuklara yerleştirin. Her hücre hattı için ayrı bir plaka kullanın ve üç hücre hattını bu altı kuyucuk plakasına oyuk başına 5.000 hücre yoğunluğunda kaplayın.

Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, her kuyudan büyüme ortamını aspire edin. Ardından, hücreleri bir mililitre ılık PBS'de yıkayın.

Daha sonra, hücreleri sabitlemek için her bir kuyucuğa bir mililitre yüzde 3.7 formaldehit ekleyin. Hücreleri 10 dakika fiksatifte bırakın. Fiksasyon yapıldıktan sonra formaldehiti aspire edin.

Hücreleri 30 dakika boyunca boyamak için her oyuğa bir mililitre yüzde 0.05 kristal menekşe ekleyin. Daha sonra, hücreleri kuyucuk başına üç kez bir mililitre deiyonize su ile yıkayarak fazla lekeyi temizleyin. Ardından, etiketli bir cam slayt üzerine bir damla şeffaf montaj reaktifi yerleştirin.

Ardından, ince uçlu forsepsler kullanarak, lamelleri nazikçe alın ve yüzleri aşağı bakacak şekilde montaj reaktiflerinin üzerine yerleştirin. Tüm lekeli lamellerin slaytlara monte edilmesinden sonra, ışık mikroskobu altında, her bir lamel arasından örtüşmeyen hücrelerin rastgele 20 görünümünü seçin. Her görüş alanı için 400 güç büyütmeli fotoğraf mikrografları çekin.

Ardından, 20 temsili hücrenin her birindeki uzantı türlerinin sayısını gözlemleyin ve sayın. Membran uzantısını filopodia, lobopodia veya lamellipodia olarak sınıflandırmanıza rehberlik etmesi için tanımları ve metin protokolünü kullanın. Hücre uzantısı türlerini ilk kez sayarken, gözden geçirilmek üzere bir referans görüntüsü bulundurmak yararlı olabilir.

Mümkünse, deney örneklerine göre kör bir şekilde saymak ek nesnellik sağlayacaktır. İncelenen üç hücre satırının her birinde, hücre başına her türün ortalama uzantı sayısını belirleyin. Farklı hücre tipleri arasındaki hücre zarı uzantılarının ortalama yüzdesindeki farkı test etmek için tek yönlü anova kullanın, istatistiksel olarak anlamlıdır.

Testten bir gün önce, bir hemositometre kullanarak, SW 13, SW Neo ve SW DKK3 hücrelerini sayın. Bu hücreleri, test edilecek altı belirlenmiş zaman noktasının her biri için bir plaka kullanarak altı kuyucuklu plaka halinde 100.000 hücre yoğunluğunda plakalayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin.

Ertesi gün, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücreleri bir kez ılık PBS ile yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa 0.5 mililitre tek mukavemetli enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi ekleyin. Eklenen çözeltiyi eşit şekilde yaymak için plakaları hafifçe döndürün.

Plakaları belirli süreler boyunca çözelti ile inkübe edin. Her zaman noktasının sonunda belirlenen plakayı aspire edin. Her aspirasyondan kısa bir süre sonra, hücreleri bir mililitre ılık PBS ile yıkayın.

Ardından, gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun. Yıkamayı aralıklı vurma ile birlikte iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, kalan PBS'yi aspire edin ve plakada kalan hücreleri bir mililitre yüzde 3.7 formaldehit ile sabitleyin.

Fiksasyon yapıldıktan sonra formaldehiti aspire edin. Ardından, hücreleri lekelemek için her oyuğa bir mililitre yüzde 0.05 kristal menekşe ekleyin. Boyama tamamlandıktan sonra, hücreleri kuyucuk başına üç kez bir mililitre deiyonize su ile yıkayarak fazla lekeyi temizleyin.

100 kuvvet büyütmede bir ışık mikroskobu kullanarak, her plaka için her bir oyukta kalan bağlı hücreleri sayın. Ardından, test edilen üç hücre hattı için farklı zaman noktalarında ayrılmış kalan hücrelerin yüzdesini belirleyin. İki yönlü bir varyans kullanılarak, üç hücre hattı arasındaki farkların ve hücre ayrılma oranlarının test edilmesi istatistiksel olarak anlamlıdır.

Kristal viyole lekeli kontrol SW 13 ve SW Neo hücreleri çoğunlukla filopodia ve lamellipodia oluşmuştur. Buna karşılık, DKK3 eksprese eden hücreler, lamellipodia neredeyse tamamen yokluğu ve çok az filopodia ile daha fazla lobodoria oluşturdu. Ayrıca, DKK3 eksprese eden hücreler ile kontrol hücresi hatları arasındaki polarite farklılıklarına dikkat edin.

Grafik, test edilen üç hücre dizisindeki farklı hücre uzantılarının oranını gösterir. DKK3 eksprese eden hücrelerde önemli ölçüde daha yüksek lobobodia oranına dikkat edin. Çizgi grafikler, X ekseninde belirtilen zaman noktaları için ayrışma çözeltisi ile işlemden sonra plakaya bağlı kalan hücrelerin yüzdesini gösterir.

10 dakikaya kadar olan tüm zaman noktalarında, DKK3 eksprese eden hücreler, kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hücre bağlanma gücü gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, düzgün bir şekilde uygulanıp uygulanmadığına bağlı olarak deney kurulumunuza bağlı olarak bir ila iki günlük zaman diliminde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, hücre uzantısı morfolojisindeki değişikliklerin adeziv kapasitesini nasıl etkilediğini değerlendirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücresi yapışma özelliklerindeki değişikliklerle ilgili olarak hücre uzantılarının nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız. İyi şanslar ve izlediğiniz için teşekkürler.