İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Bu in vivo çift renkli iki fotonlu görüntüleme yönteminin genel amacı, kontüzif omurilik yaralanmasını takiben ortaya çıkan akut spinal vasküler dinamik değişiklikleri izlemektir. Bu yöntem, bu dinamik vasküler değişikliklerin patolojik ilerlemeyi ve omurilik yaralanmasından sonra ortaya çıkan fonksiyonel eksiklikleri nasıl etkilediği hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin promodern örnekler kullanan geleneksel tekniklere göre en büyük avantajı, canlı bir hayvanda omurilik yaralanmasının akut vasküler dinamiklerine dair kanıt sağlamasıdır.

Bu tekniğin etkileri, omurilik yaralanmasının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu yöntem erken vasküler onarımı hedefleyen potansiyel nöroprotektif stratejileri incelememize izin verir. Bu çift renkli görüntüleme yöntemi için ilk fikri, kontrast floresan renklerin sıralı enjeksiyonunun, omurilik yaralanmasından sonra bozulmuş damarları görselleştirmemize izin verdiğini bulduğumuzda aklımıza geldi. Prosedüre başlamadan önce, altı haftalık bir dişi Sprague Dawley sıçanının ayak parmağının sıkıştırılmasına yanıt verilmemesi ve ardından deri altı analjezi ve bir anti-enflamatuar ajan enjeksiyonu ile uygun sedasyon seviyesini onaylayın.

Fareyi servikal omurga bölgesinde ve hayvanın göğüs tarafındaki boyun bölgesinde tıraş edin ve açıkta kalan cildi bir Betadine cerrahi ovma ve% 70 alkollü mendil ile temizleyin. Hayvanın gözlerine merhem sürün ve fareyi steril bir mikroskop altında 37 santigrat derece ısıtma yastığının üzerine steril bir cerrahi ped üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Dış juguler veni bulmak için köprücük kemiğinin yakınındaki nabız noktasını bulun ve sağ mandibulanın kaudal ramusu, humerusun daha büyük tüberkülü ve manubriumun kesiştiği noktada dikey bir kesi yapmak için bir çift küçük steril yaylı makas kullanın.

Şah damarını izole etmek için yaylı makas ve ince forseps kullanın ve damarın distal ucunu bağlamak için steril bir cerrahi dikiş hattı kullanın. Daha sonra, damar duvarında küçük bir kesi yapmak için bir çift mikro makas kullanın ve tuzlu su ile doldurulmuş bir mililitrelik şırıngaya bağlı 21 gauge iğneden yapılmış özel bir kateteri damarın içine kaydırın. İğneye az miktarda kan girerse, yerleştirme başarılı olmuştur.

İğneyi proksimal ve distal uçlarından sabitleyin. Omurgayı stabilize etmek için, hayvanı yüzüstü pozisyona getirin ve cildi orta hat boyunca istenen omurga seviyelerinde kesmek için 15 numaralı bir neşter bıçağı kullanın. Kürek kemiği arasındaki sivri uçtan ikinci torasik omuru bulun ve C2 omurunu bulmak için T7'den yukarı doğru sayın.

Yan fasetleri ortaya çıkarmak için kas katmanlarını beşinci ila yedinci servikal omurlardan bilateral olarak inceleyin ve lateral vertebral kemiğin her iki tarafında bir yarık açın. Modifiye edilmiş bir dengeleme aparatının paslanmaz çelik kollarını açıkta kalan enine işlem fasetlerinin altına kaydırın ve omurgayı stabilize etmek için vidaları sıkın. Daha sonra C5 ila C7 laminaları dikkatlice çıkarın ve nemli tutmak için açıkta kalan dura materin üzerine küçük bir parça tuzlu suya batırılmış jel köpük yerleştirin.

İki fotonlu görüntüleme penceresini oluşturmak için, kaslar ve omur kemikleri arasındaki boşluğa küçük jel köpük parçaları ve omurilik ile omur kemikleri arasına ince bir jel köpük çizgisi yerleştirin. Daha sonra çevredeki kas kemiği bölgesini doku yapıştırıcı yapıştırıcı ile kapatın. Başarılı bir görüntüleme penceresi hazırlamanın en kritik adımı, pencerenin içinde küçük bir kanama olmadığından emin olmaktır.

Tutkalın yaklaşık beş dakika kurumasına izin verdikten sonra, steril bir mililitrelik şırıngayı ılık% 4 agar ile doldurun ve pencerenin kenarı boyunca bir agar duvarı dağıtın. Agar, esnek kalırken hızla katılaşacaktır. Temel bir görüntü elde etmek için önce jel köpüğü çıkarın ve pencerenin içine daldırma sıvısı ekleyin.

Stabilize edilmiş hayvanı, iki fotonlu görüntüleme penceresi doğrudan düşük büyütmeli bir objektifin altında olacak şekilde iki fotonlu mikroskop karanlık odasına yerleştirin ve lensi dikkatlice pencereye indirin. Bir mililitrelik steril şırıngayı 0,5 mililitre taze hazırlanmış Rhodamine B izotiyosiyanat dekstran çözeltisi ile doldurun ve şırıngayı katetere bağlayın. İlgilenilen alanı belirlemek için göz merceğini kullanarak boyayı iletmek için pistona çok yavaş bastırın ve yüzey kan damarı modellerinin dönüm noktası niteliğinde parlak alan görüntüsünü elde etmek için şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanın.

Ardından, gücü açmak ve uygun lazer uyarma dalga boyunu seçmek için iki fotonlu görüntüleme yazılımını açın. Ardından, enjekte edilen florofor deneyine karşılık gelen uygun iki fotonlu lazer gücünü, HV seviyesini ve floresan kanalını seçin ve hem görüntüleri hem de çizgi tarama verilerini toplamak için dokuyu görüntüleme penceresinden görüntüleyin. C7 orta hat kontüzyon yaralanmasını tanıtmak için, fareyi bir Louisville Yaralanma Sistemi Aparatı cihazına yerleştirin ve 0 nokta ayarını seçin.

Ardından doku yer değiştirmesini ayarlayın ve yaralanmayı oluşturan etkiyi veya serbest bırakmayı tetiklemek için deneyi çalıştır'a tıklayın. Ardından, açıkta kalan dura materin üzerine küçük bir parça tuzlu suya batırılmış jel köpük yerleştirin ve aynı görüntüleme parametrelerini kullanarak görüntüleme penceresinden yeni görüntüler açın. Hayvanı karanlık odaya geri aktarın ve katetere 0,5 mililitre taze hazırlanmış floresein izotiyosiyanat dekstran enjekte edin.

Daha sonra hayvanı mikroskop karanlık odasına geri koyun ve her iki florofor kanalında da görüntüler elde edin. Rhodamine dekstran floresan boya enjeksiyonu, başlangıçta vasküler ağın haritalanması için bir dönüm noktası görüntüsünün yakalanmasına izin verir. Orta derecede şiddetli bir C7 orta hat kontüzif yaralanmasının oluşmasından sonra, FITC-dekstran'ın eklenmesi, ilk boyanın çevredeki parankim'e yaralanmaya bağlı sızıntısından sonra vasküler yapının tespitini kolaylaştırır.

Yaralanmadan önce ve sonra damarın görüntülenmesi, damar çapındaki ve yaralanmaya verilen yanıttaki değişikliklerin yanı sıra yaralanma öncesi ve sonrası kırmızı kan hücresi hızındaki değişikliklerin hesaplanmasına da olanak tanır. Birlikte ele alındığında, bu veriler görüntülenen damarları damarlar veya arterler olarak sınıflandırmak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, gözle görülür solunum artefaktlarından kaçınmayı ve görüntü penceresindeki küçük kanamaları sınırlamaya çalışmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedür, omurilik yaralanmasını takiben ortaya çıkan nörovasküler etkileşimler hakkında ek soruları yanıtlamak için transgenik hayvanlar üzerinde de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, canlı bir hayvanda kontüzif omurilik yaralanmasından sonra akut vasküler dinamik değişiklikleri izlemek için iki foton mikroskobunun nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.