Name: Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Öğrenin dolaşan tümör hücrelerinin akciğer kolonizasyonundaki rolünü in vivo görselleştirme yöntemiyle. Bu teknik erken evre metastatik kanser hücrelerinin akciğerde izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Ming-Min Chang ve Bayan Ya-Hsin Cheng ve teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Tayvan'ın Bakanlığı Bilim ve teknoloji tarafından desteklenmiştir (en-103-2325-B-006-009, en-104-2325-B-006-001, en-105-2325-B-006-001 ve MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ve Sağlık Bakanlığı ve refah (MOHW106-TDU-B-211-144004). Biz de onların çok foton confocal mikroskop için destek için minnettar College of Medicine, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi, temel araştırma laboratuardan vardır.

Bizim Enstitüsü (bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının, NCKU Tıp Fakültesi Kılavuzu) esaslarına göre fareler üzerinde tüm deneyler yapıldı.
1. hazırlanması aletleri, Kültür Medya ve yemekleri
<ol><li>Steril Cerrahi dikişler, 1 mL şırınga ile 26 G/0.5 cm iğne (için kuyruk ven enjeksiyon), deneysel protokoller başlamadan önce elde etmek 3 mL batar (için akciğer perfüzyon), 24G/3 cm iğne ile Dulbecco'nın modifiye kartal medya (DMEM), tripsin-EDTA çözüm (5 g/M tripsin ve 0,53 mM), fetal Sığır serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4ve 1.8 mM KH2PO4) ve 6 cm kültür yemekleri.</li>
</ol>2. hazırlık ve kurtarma süspansiyon tümör hücrelerinin
<ol><li>Steril Dulbecco'nın modifiye kartal medya (% 10 veya % 20 içeren DMEM) hazırlamak FBS ve taze eklemek 2 mM L-glutamin, 1 x PBS ve % 0.05 tripsin-EDTA.</li>
	<li>DMEM % 10 ile desteklenmiş hücrelerde kültür FBS 37 ° C'de ve kültür tabak içinde % 70-80 izdiham kadar onları büyümek.</li>
	<li>Kültür Medya (DMEM) 2 mL steril 1 x PBS ile iki yıkama ardından yemekleri kaldırın.</li>
	<li>1 mL % 0.05 ekleyin tripsin-EDTA bulaşıkları içine iyice hücrelerin tümünü kapsayacak şekilde. Çözüm 800 μL kaldırmak ve sadece 200 μL yemekleri bırakılır. Yemekler için 30 37 ° C'de kuluçkaya s 1 dk (türüne bağlı olarak hücre) ve beklemek-e kadar askıya alınmış durumda hücrelerin çoğu için.</li>
	<li>Taze DMEM 1 mL ekleyin % 10 içeren FBS doğrudan içine yemekler tripsin ve şiddetle enzimatik faaliyetleri durdurmak için hücre süspansiyon yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon hazırlamak için 1000 µL pipet ile pipette.</li>
	<li>Hücreleri yemek 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve spin 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında hücreleri aşağı.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 1,5 mL %20 FBS ve bitti sıra içeren DMEM tümör hücreleri resuspend süspansiyon için 2 h 37 ° C'de hücrelerde döndürün. Not: taze orta % 20 içeren ile eski orta orta kurtarma sırasında sarı dönüşürse, Döviz FBS.</li>
</ol>3. floresans boyama ve tümör hücreleri Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) ile süspansiyon Analizi
<ol><li>Hücre kurtarma süspansiyon sonra Trypan mavi bir Neubauer odası dozlarda boyama floresan titrating için sayma ile uygun uygun hücre sayıları saymak ve kuyruk için enjeksiyon damar.</li>
	<li>162 x g 3 dk ve resuspend pelleted hücreleri 1 ml 1 x 162 x g 3 dk de oda sıcaklığında Santrifüjü ardından PBS, steril oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin.</li>
	<li>1 X PBS 10 içeren 500 µL pelleted hücrelerde resuspend % FBS ve 0, 5, 10, 20 veya 40 µM CFSE için doz titrasyon ve hücre süspansiyon 37 oC 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık, kuluçkaya.</li>
	<li>162 x g 3 dakika oda sıcaklığında, hücreleri aşağı spin ve 4 mL % 1'i içeren DMEM pelleted hücrelerle resuspend FBS. Bu çamaşır üç kez daha tekrarlayın. DMEM için son yıkama yalnız 4 mL pelleted hücrelerle resuspend.</li>
	<li>CFSE etiketli hücreleri tek bir hücre floresans yoğunluğunu ölçmek için (FACS) analizi sıralama floresans aktif hücreye konu veya damar enjeksiyon kuyruk. Not: hücreler FACS analiz veya kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmeden önce buz üzerinde tutmak.</li>
</ol>4. akciğer kolonizasyon tahlil
<ol><li>20 µM CFSE etiketli hücreleri hazırlayın (3,4 adımları 3.1'e bakınız). Not: CFSE çalışma doz tümör hücreleri, FACS analiz titrasyon sonuçlara dayanarak etiketleme için karar (adım 3.3 için bakınız).</li>
	<li>4-6 hafta kuyruk ısınmak-eski erkek C57BL/6 (6 fareler) 5-10 dk fare fare olarak fare kuyruğu damarlar dilate için halide lambalı fareler.</li>
	<li>İyice karıştırın ve CFSE etiketli tümör hücreleri hücre süspansiyon (5 x 106 hücre/mL son hücre yoğunluğu ile) herhangi bir kabarcıkları kaçınarak bir 1 mL (26Gx1/2) şırınga ile Aspire edin.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde enjekte 1 x106 CFSE etiketli tümör hücreleri DMEM 200 µL bir fare restrainer saplanmış fare kuyruğu ven içine. Not: iğne kuyruğu ven lümen içinde doğrudan yerleştirilmişse enjeksiyon sırasında tümör hücreleri kolayca dolaşıma şırıngayı zor itmek gerek kalmadan teslim edilmelidir. İle tümör hücreleri itmek zor olsa da, onlar büyük olasılıkla kuyruk ven dışında subkutan uzaya enjekte edilmiş.</li>
	<li>İntravenöz CFSE etiketli tümör hücreleri iki gruba alınan fareler bölün: bir grup tarafından confocal mikroskobu takip akciğer perfüzyon tabi ve ImageJ miktar akciğer kolonizasyon tahlil ve diğeri sol tek başına 4-5 için hafta içinde uzun vadeli akciğer kolonizasyon tahlil.</li>
	<li>20, 38 veya 45 h ve intravenöz enjekte bir saat ders ve doz bağımlı titrasyon sırasında 1 x 106 tümör hücreleri ile tümörü taşıyan fareler ile iyi kabul edilen ve uygun anesthetizer2350-75 mg/kg zoletil 50, anestezi. Not: Kullanım veteriner merhem kuruluk anestezi iken altında önlemek için fareler'ın gözleri.</li>
	<li>Boyuna deri ve subkutan doku karın üzerinden göğüs bölgesine cerrahi makasla kesme. Plevral boşluğu cerrahi makas ve tam olarak kalp ve akciğerler duyurmak forseps ile açın. Not: kan damarları keserek önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>Üstün vena kava (SVC) ve inferior vena kava (IVC) geri tepme perfüzyon çözüm akciğer perfüzyon sırasında önlemek için steril cerrahi sütür ile kravat.</li>
	<li>Sol ventrikül duvar akciğer perfüzyon çözümden boşaltmak için bir çatlak (yaklaşık 2-4 mm) açmak için cerrahi makas ile kesme.</li>
	<li>1 x PBS 3 mL şırınga ile sağ ventrikül enjekte ve akciğerleri kırmızımsı bir renk için tamamen solgun çevirmek kadar süzülmüş çözüm sürekli emme sırasında akciğer perfüzyon kaldırın.</li>
</ol>5. confocal mikroskobik görüntüleme ve çözümleme-in akciğer kolonize tümör hücreleri
<ol><li>Şimdi-soluk akciğerler plevral boşluğundan kaldır ve beş loblar uzakta nefes borusu ve bağ dokusu bağ cerrahi makas ve forseps24ile keserek ayırın.</li>
	<li>Retiküle doku Akciğer lobları yerleşim için iki çubuklar arasında bir boşluk ile üretmek için Şekil 3B ' naylon dikiş sarma tarafından yaklaşık iki metal çubuklar gösterildiği gibi bir sedye gibi akciğer tutucu hazırlayın. Akciğer tutucu bir 6 cm tabak içinde ayarlayın. Not: Akciğer tutucu Akciğer lobları objektif lens confocal mikroskop altında stabilize etmek için kullanılır.</li>
	<li>Lodge ve Akciğer lobları akciğer tutucu retiküle dokusu üzerinde düzeltin. Kapak ve Akciğer lobları 1 x PBS ile nemlendirin.</li>
	<li>Konu Akciğer lobları akciğer kolonileşmesi tümör hücreleri kayıt floresans çekim confocal mikroskobu akciğer sahibine üzerinde barındıran 6 cm kültür çanak.</li>
	<li>Görüntüleme için objektif lens kullanımı (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, hava).</li>
	<li>NIBA (uyarma/emisyon; 470-495 nm/510-550 nm) için filtre tekerleği döndürün ve CFSE açıkça Akciğer lobları floresans nokta görüntülerini görselleştirmek için heyecanlandırmak için 488 nm lazer kullanın.</li>
	<li>(İçin MaiTai HP DeepSee lazer) R690 için filtre tekerleği döndürün 2.0 ile taramak için µs/piksel scanning hız ve HV, kazanç ve ofset iyimserlik düzeyleri.</li>
	<li>Floresan (512 x 512 piksel) bir 10 ile belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak çekim µs/piksel tarama hızı.</li>
	<li>Ölçmek ve istatistiksel analiz mikroskobik görüntüleri önceden açıklanan21ImageJ ve GraphPad yazılım kullanarak.</li>
</ol>6. uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri
Not: 4.1 4.5 aracılığıyla adımları yineleyin.
<ol><li>Tümör hücre aşılama için 4-5 hafta sonra farelerin kurban ve onların akciğer Bouin'ın sıvı25 ile 1-2 gün için tamir.</li>
	<li>Ölçmek ve istatistiksel analiz üzerinden yazılım21ile fareler akciğer tümörü nodüller.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Uzun vadeli akciğer kolonizasyon deneyleri, burada in vivo akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından uzak organlarda değerlendirmek için istihdam metodoloji açıkça örtüsünü açmak ve kolonileşmesi içinde CTCs üzerinde monte polyFN belirli rol Ayrıştırılan kısa vadeli ile birlikte akciğer, ekstravazasyonu ve metastatik işlemleri18,19,20,21yol açtı. Her ne kadar uzun vadeli hücre izci intrave...

Metastaz kanser ölüm1,2önemli nedenidir. Birincil dokulardan türetilmiş tümör hücreleri kan dolaşımı süspansiyon girin ve önce onlar are çeşitli Hematojen zorluklar, Örneğin, anoikis, bağışıklık saldırı ve zararlar tansiyon ya da geometrik kısıtları, yamultma stres nedeniyle hayatta uzak organ metastazı3,4,5,6başarı dikte önemli bir adım kolonize etmek mümkün. Bu nedenle, dinç çabaları şu anda dolaşımdaki tümör hücreleri (CTCs) karakterize ve bu özellikleri tümör habis, metastaz ve sağkalım oranları kanser hastaları7,8 ile korele yapılmıştır , 9. kanser metastaz işlemini özellikle vivo içinde olay gösterir, hayvan modelleri metastaz10,11,12 tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır .
CTCs metastatik tümör doku uzak organlara1,2kolonizasyon dahil olmak üzere birden çok hücresel olaylar aracılığıyla olur. Ancak, en yaygın kullanılan metastaz deneyleri13,14,15 değil uzak organlara kolonizasyon CTC gözlemlemek için bir yol sağlar. Bu nedenle, bir CTC kolonizasyon görselleştirme için in vivo tahlil tasarım acilen ihtiyacım vardı. Her ne kadar birkaç vivo içinde ve ex vivo kısa dönem akciğer kolonizasyon deneyleri tasarlanmış, sorunları ve dezavantajları kalır. Örneğin, yeşil floresans protein (GFP) iken-overexpressing tümör hücreleri bu kullanılmıştır deneyleri22,23, stabil transfect ve yeterli GFP floresan yoğunluğu altında ile tümör hücreleri clone için sürüyor mikroskop. Her ne kadar uzun vadeli hücre izleyici CFSE ile tümör hücrelerinin geçici boyama GFP ifade tümör hücreleri değiştirmek için istihdam edilmiş, benzer şekilde, bu zor CFSE etiketli tümör hücreleri bağlı olup olmadığını yargılamak ya da sadece mevcut içinde kalır damarlara eksize uzak organlara16,17.
Polimer fibronektin (polyFN) CTCs yüzeylerde monte eleştirel metastatik tümör doku18,19,20,21,22 son kurulması için katkıda bulundu . Burada, kısa vadeli askıya alınmış Lewis Akciğer Karsinomu (LLCs) hücreleri stabil FN-shRNA (shFN) veya scramble-shRNA (shScr) ifade ve CFSE ile önceden etiketli akciğer kolonizasyon deneyleri intravenöz C57BL/6 fareler aşısını gerçekleştirilen. 2-3 gün sonra fare akciğerler ilk fosfat tamponlu tuz (tabi önce bekâr CTCs damarlara içinde tamamen kaldırmak için PBS) ile confocal mikroskobu ve akciğer kolonileşmesi LLCs miktar periosteum. Biz açıkça akciğer kolonileşmesi shFN LLCs sayıda ve tümör nodüller önemli ölçüde shScr önemli ölçüde CTCs polyFN derlemede rolü kolonizasyon ve CTCs içinde gelişimini kolaylaştıran corroborating LLCs ile karşılaştırıldığında azalma olduğunu göstermiştir Akciğerler. Bizim çalışma daha fazla rol için incelenmesi kanser metastaz polyFN garanti eder.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Serum Albümini&nbsp; ( BSA)</td> <td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td> <td>101-9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's Fluid</td><td>MCC (tıbbi kimya şirketi) / ZEHİR</td><td>456-A-1GL</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferasyon Boya</td><td>ebiosciences</td><td>65-0850-85</td><td>Tam adı: Karboksifloresein süksinimidil ester</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)&nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td><td>101-6381-92-6</td><td>Hazırlanmış tripsin-EDTA çözeltisi için (Nihai konsantrasyon: 0.53mM)&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>(Gibco) ThermoFisher Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Lewis akciğer karsinomu (LLC)</td> <td>ATCC, Manassas, VA, ABD</td><td>CRL-1642</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, USP & nbsp;</td><td>(Gibco)ThermoFisher Scientific</td><td>21051-024</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td><td>101-7447-40-7</td><td>Hazırlanmış 1X PBS için (Nihai konsantrasyon: 2.7mM)</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td><td>101-7778-77-0</td><td>Hazırlanmış 1X PBS için (Nihai konsantrasyon: 1.8mM)</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td><td>101-7647-14-5</td><td>Hazırlanmış 1X PBS için (Nihai konsantrasyon: 137mM)</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik (Na2HPO4)</td><td>Cyrusbioscience (Taipei, Tayvan)</td><td>101-10039-32-4</td><td>Hazırlanmış 1X PBS için (Nihai konsantrasyon: 10mM)</td></tr><tr><td>Tripan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.5 g 100 mL ile karıştırın 1X PBS</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4799</td><td>Hazırlanmış tripsin-EDTA çözeltisi için (Nihai konsantrasyon: 5g / L)</td></tr> <tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td></td><td>1X PBS ile seyreltmek için&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompakt Masaüstü Santrifüj 2420</td><td>KUBOTA Co.</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Kültür kabı (6cm)</td><td>Wuxi NEST Biyoteknoloji A.Ş.</td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>Tek kullanımlık şırınga (iğneli)</td><td>Perfect Medical Industry Co.</td><td></td><td>24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml</td></tr><tr><td>Uç üstü karıştırıcı</td><td>C.T.I YOUNG CHENN</td><td>TS-20</td><td>Askıda hücrelerin geri kazanımı için&nbsp;</td></tr><tr><td>FACSCalibur (FACS)</td><td>BD biyolojik bilimler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dimeda</td><td>10.102.14</td><td></td></tr><tr><td>Forma Doğrudan Isı CO2 inkübatör</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>HEPA CLASS 100</td><td></td></tr><tr><td>Fare tutucu (Silindirik Tutucu 15-30 gm)</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton Konfokal Mikroskop BX61WI</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer sayma odası</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas</td><td>Dimeda</td><td>08.370.11</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi sütürler&nbsp;</td><td>ÜNIK CERRAHI SÜTÜRLER MFG. CO.</td><td>NO. 0034</td><td>Siyah Örgülü ipek; emilmez (25YD; U.S.P. 4/0)</td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Wuxi NEST Biyoteknoloji A.Ş.</td><td></td><td></td>615001</tr><tr><td>15 mL Greiner tüp</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr></tbody></table>

tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastaz kanser ölüm başlıca nedenidir. Tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz, içinde akciğer kolonizasyonu CTCs tarafından katkıda eleştirel için erken akciğer metastatik oluşum, teşvik dolaşan rolü şiddetle araştırmış. Bu nedenle, hayvan modelleri metastaz tam sistemik süreci yakalar tek yaklaşım vardır. Verilen bu CTCs katkılar kan damarı ekstravazasyonu incelenmesi için önceki Deneysel tasarımlar sorun oluşursa, biz hangi bir in vivo akciğer kolonizasyon tahlil kurulan bir uzun vadeli floresans hücre-izleyici, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), askıya alınan tümör hücreleri etiketlemek için kullanılan ve akciğer perfüzyon akciğer Temizleme, confocal görüntüleme ve miktar önce özellikle kapana CTCs temizlemek için gerçekleştirildi. Polimer fibronektin (polyFN) CTC yüzeylerde monte akciğer kolonizasyon metastatik tümör doku son kurulmasında aracılık tespit edilmiştir. Burada, özellikle CTCs polyFN derlemede akciğer kolonizasyon ve ekstravazasyonu için gereksinim test etmek için biz kısa vadeli gerçekleştirilen akciğer kolonizasyon deneyleri hangi askıya stabil FN-shRNA (shFN) ifade Lewis Akciğer Karsinomu Hücre (LLCs) veya Scramble-shRNA (shScr) ve önceden etiketli 20 mikron CFSE intravenöz C57BL/6 fareler aşılanmış. Biz başarıyla fare akciğerlerde kolonize etmek shFN LLC hücreleri yeteneklerini shScr LLC hücreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmış gösterdi. Bu nedenle, özellikle CTCs yeteneğini akciğerlerde kolonize dolaşım içinde göstermek için kısa vadeli bu yöntemi yaygın olarak uygulanabilir.

Vivo akciğer kolonizasyon tahlil gerçekleştirmeden önce akciğer kolonizasyon ve/veya metastaz, kolaylaştırma ekstravazasyonu polyFN askıya alınmış tümör hücreleri üzerinde aracılık olup olmadığını sınamak için Şekil 1A gösterildiği gibi biz ilk farklı titre CFSE, hücre geçirgen ve kovalent hücre içi Amin içeren moleküller26,27 ' askıya alınan tümör hücreleri conjugates ve uzun bir süre için h...

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Bu yöntem, kanser metastazı alanında, kanser metastazının gerçekleştirilmesinde akciğer kolonizasyonunun rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, erken ekstravaze kanser hücrelerinin kanser metastazı sırasında akciğerlerde görüntülenebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Cheng-Han Yang olacak.Tümör hücre kültürü yüzde 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, kültürü yıkama başına iki mililitre steril PBS'de iki kez yıkayın ve kültür kabına bir mililitre% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin. Süpernatantın 800 mikrolitresini hemen çıkarın ve hücrelerin çoğu plakadan ayrılana kadar kültür kabını 30 ila 60 saniye boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Reaksiyonu durdurmak için% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre taze ortam ekleyin ve hücre çözeltisini kuvvetlice karıştırmak için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın.Elde edilen tek hücreli süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra, tümör hücresi peletini% 20 FBS ile desteklenmiş 1.5 mililitre ortamda yeniden askıya alın ve uç uca hücreleri 37 santigrat derecede iki saat boyunca döndürün. İnkübasyonun sonunda, canlı hücreleri tripan mavisi dışlaması ile sayın ve santrifüjleme ile toplayın.İkinci bir santrifüjleme için peleti bir mililitre steril PBS içinde yeniden süspanse edin ve peleti %10 FBS ve 20 mikro mililitre CFSE ile desteklenmiş 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Karanlıkta 37 santigrat derecede on dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peleti, başka bir santrifüjleme için yüzde bir FBS ile desteklenmiş dört mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Son yıkamadan sonra, hücreleri FBS konsantrasyonu olmadan mililitre taze ortam başına beş kez on ila altıncı tümör hücresine yeniden askıya alın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin.Daha sonra, kuyruk damarlarını genişletmek için dört ila altı haftalık bir erkek C570 Black Six farenin kuyruğunu beş ila on dakika ısıtın ve hücreleri iyice karıştırmak için 26 buçuk gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Şırıngayı dikkatlice 200 mikrolitre hücre ile doldurun ve fareyi bir kısıtlayıcıya yerleştirin. Daha sonra tüm hücre hacmini genişlemiş bir kuyruk damarının lümenine enjekte edin.Enjeksiyon sonrası uygun zaman noktasında, karından göğse uzunlamasına bir cilt ve deri altı doku kesisi yapın ve kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın. Steril cerrahi dikişler kullanarak, profüzyon solüsyonunun geri akışını önlemek için superior ve inferior vena kavaları bağlayın ve perfüzatın akciğerlerden boşaltılmasını kolaylaştırmak için sol ventrikülde iki ila dört milimetrelik bir fissür yapmak için makas kullanın. Daha sonra, PBS'yi sağ ventriküle enjekte etmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın ve akciğerler kırmızımsı bir renkten tamamen solmaya dönene kadar boşaltılan çözeltiyi çıkarmak için sürekli emme kullanın.Başarılı bir akciğer perfüzyonu için superior ve inferior vena kava'yı uygun şekilde sabitlemeye özen gösterin. Akciğerleri topladıktan sonra, lobları altı santimetrelik bir tabakta özel yapım bir akciğer tutucusuna yerleştirin ve akciğerleri tutucunun ağsı dokusuna sabitleyin. Lobları PBS ile örtün ve nemlendirin ve kültür kabını konfokal bir mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin.5x hedefini seçin ve filtre tekerleğini NIBA'ya çevirin. 488 nanometrelik bir lazer kullanarak, akciğer loblarındaki floresan mavi etiketli tümör hücrelerinin net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için CFSE'yi uyarın. Piksel başına iki mikrosaniye tarama hızıyla taramak ve yüksek voltaj kazancı ve ofset seviyelerini optimize etmek için filtre çarkını R690'a çevirin.Ardından, piksel başına 10 mikrosaniye tarama hızı kullanarak beş adet 12'ye beş adet 12 piksellik floresan görüntü yakalayın. Az önce gösterildiği gibi boyama yöntemi kullanılarak, tümör hücreleri doza bağlı bir şekilde CFSE ile etkili bir şekilde etiketlenir. Etiketlemenin floresan yoğunluğu ile, 20 mikromolar konsantrasyonda mililitre başına 10 ila beşinci Lewis akciğer karsinomu hücresine altı kez neredeyse bir platoya ulaşır.Hasattan önce akciğer perfüzyonu, az önce gösterildiği gibi, görüntüleme analizinden önce akciğer damar sistemini spesifik olarak doğranmış olmayan dolaşımdaki tümör hücrelerinden temizler. Floresan konfokal mikroskopi, hasat edilen ve perfüze edilen akciğer lobları içinde kolonize edici CFSE işaretli tümör hücrelerinin varlığını ortaya çıkarır. Floresan görüntüleri siyah beyaza dönüştürmek için uygun bir görüntü analiz yazılım programı kullanmak, akciğer kolonizasyonunun nicelleştirilmesini kolaylaştırır.Lewis akciğer karsinomu hücrelerinde fibronektin eksprese eden veya karıştırılmış fibronektin eksprese eden intravenöz iletim, enjeksiyondan 38 ve 45 saat sonra toplanan akciğer dokusunda önemli ölçüde daha düşük sayıda fibronektin eksprese eden hücre gösterir ve fibronektinin akciğer lobu kolonizasyonu ve tümör gelişimindeki rolünü vurgular. Bu prosedürü denerken, bağlanmamış hücrelerin yıkanabilmesi için akciğerleri dikkatli bir şekilde perfüze etmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser metastazı alanındaki araştırmacıların, tümör hücrelerini bir fare sıfır gram modelinde dolaştırarak akciğer kolonizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücresi süspansiyonlarını floresan olarak etiketlemeyi, tümör hücrelerini intravenöz olarak inoküle etmeyi, fare akciğerlerini perfüze etmeyi ve metastaz yapmış tümör hücrelerini görüntülemek için konfokal çiçeklenme mikroskobunu kullanmayı iyi anlamış olmalısınız.

the-establishment-lung-colonization-assay-for-circulating-tumor-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama...

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Bu el yazması tümör hücresi birikimi Akciğerlerde tümör metastazı, bir hayvan modeli ölçmek için bir yöntem açıklanır.

Akciğer tümör hücre işe alım tahlil

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Akciğer kanseri için yeni tedaviler geliştirmenin en büyük zorluğu, bölgesel hastalık metastatik hastalığa ilerlerken tümör mikro çevresinin modellenmesini içerir. Burada, zaman içinde hastalığın in vivo olarak izlenmesine izin veren ortotopik bir sinjeneik akciğer kanseri modeli oluşturmanın basit bir yöntemini açıklıyoruz.

Akciğer Kanserinin Sinjeneik Ortotopik Fare Modelini Oluşturmak için Minimal İnvaziv Bir Yöntem

Bu protokol, hem sağlıklı hem de tümör taşıyan fare akciğer dokusundan yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların izole edilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu protokol scRNA-dizi, akış sitometrisi analizi ve birincil hücre izolasyonu için uygulanabilir.

Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme için tüm fare tümörü taşıyan akciğer dokusunun optimize edilmiş hazırlanması

Öğrenin dolaşan tümör hücrelerinin akciğer kolonizasyonundaki rolünü in vivo görselleştirme yöntemiyle. Bu teknik erken evre metastatik kanser hücrelerinin akciğerde izlenmesini sağlar.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Daha fazla video keşfet