Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Bu yöntem, kanser metastazı alanında, kanser metastazının gerçekleştirilmesinde akciğer kolonizasyonunun rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, erken ekstravaze kanser hücrelerinin kanser metastazı sırasında akciğerlerde görüntülenebilmesidir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Cheng-Han Yang olacak.

Tümör hücre kültürü yüzde 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, kültürü yıkama başına iki mililitre steril PBS'de iki kez yıkayın ve kültür kabına bir mililitre% 0.5 Tripsin-EDTA ekleyin. Süpernatantın 800 mikrolitresini hemen çıkarın ve hücrelerin çoğu plakadan ayrılana kadar kültür kabını 30 ila 60 saniye boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Reaksiyonu durdurmak için% 10 FBS ile desteklenmiş bir mililitre taze ortam ekleyin ve hücre çözeltisini kuvvetlice karıştırmak için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın.

Elde edilen tek hücreli süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Daha sonra, tümör hücresi peletini% 20 FBS ile desteklenmiş 1.5 mililitre ortamda yeniden askıya alın ve uç uca hücreleri 37 santigrat derecede iki saat boyunca döndürün. İnkübasyonun sonunda, canlı hücreleri tripan mavisi dışlaması ile sayın ve santrifüjleme ile toplayın.

İkinci bir santrifüjleme için peleti bir mililitre steril PBS içinde yeniden süspanse edin ve peleti %10 FBS ve 20 mikro mililitre CFSE ile desteklenmiş 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Karanlıkta 37 santigrat derecede on dakika sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peleti, başka bir santrifüjleme için yüzde bir FBS ile desteklenmiş dört mililitre ortamda yeniden süspanse edin. Son yıkamadan sonra, hücreleri FBS konsantrasyonu olmadan mililitre taze ortam başına beş kez on ila altıncı tümör hücresine yeniden askıya alın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

Daha sonra, kuyruk damarlarını genişletmek için dört ila altı haftalık bir erkek C570 Black Six farenin kuyruğunu beş ila on dakika ısıtın ve hücreleri iyice karıştırmak için 26 buçuk gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Şırıngayı dikkatlice 200 mikrolitre hücre ile doldurun ve fareyi bir kısıtlayıcıya yerleştirin. Daha sonra tüm hücre hacmini genişlemiş bir kuyruk damarının lümenine enjekte edin.

Enjeksiyon sonrası uygun zaman noktasında, karından göğse uzunlamasına bir cilt ve deri altı doku kesisi yapın ve kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarmak için plevral boşluğu açın. Steril cerrahi dikişler kullanarak, profüzyon solüsyonunun geri akışını önlemek için superior ve inferior vena kavaları bağlayın ve perfüzatın akciğerlerden boşaltılmasını kolaylaştırmak için sol ventrikülde iki ila dört milimetrelik bir fissür yapmak için makas kullanın. Daha sonra, PBS'yi sağ ventriküle enjekte etmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın ve akciğerler kırmızımsı bir renkten tamamen solmaya dönene kadar boşaltılan çözeltiyi çıkarmak için sürekli emme kullanın.

Başarılı bir akciğer perfüzyonu için superior ve inferior vena kava'yı uygun şekilde sabitlemeye özen gösterin. Akciğerleri topladıktan sonra, lobları altı santimetrelik bir tabakta özel yapım bir akciğer tutucusuna yerleştirin ve akciğerleri tutucunun ağsı dokusuna sabitleyin. Lobları PBS ile örtün ve nemlendirin ve kültür kabını konfokal bir mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin.

5x hedefini seçin ve filtre tekerleğini NIBA'ya çevirin. 488 nanometrelik bir lazer kullanarak, akciğer loblarındaki floresan mavi etiketli tümör hücrelerinin net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için CFSE'yi uyarın. Piksel başına iki mikrosaniye tarama hızıyla taramak ve yüksek voltaj kazancı ve ofset seviyelerini optimize etmek için filtre çarkını R690'a çevirin.

Ardından, piksel başına 10 mikrosaniye tarama hızı kullanarak beş adet 12'ye beş adet 12 piksellik floresan görüntü yakalayın. Az önce gösterildiği gibi boyama yöntemi kullanılarak, tümör hücreleri doza bağlı bir şekilde CFSE ile etkili bir şekilde etiketlenir. Etiketlemenin floresan yoğunluğu ile, 20 mikromolar konsantrasyonda mililitre başına 10 ila beşinci Lewis akciğer karsinomu hücresine altı kez neredeyse bir platoya ulaşır.

Hasattan önce akciğer perfüzyonu, az önce gösterildiği gibi, görüntüleme analizinden önce akciğer damar sistemini spesifik olarak doğranmış olmayan dolaşımdaki tümör hücrelerinden temizler. Floresan konfokal mikroskopi, hasat edilen ve perfüze edilen akciğer lobları içinde kolonize edici CFSE işaretli tümör hücrelerinin varlığını ortaya çıkarır. Floresan görüntüleri siyah beyaza dönüştürmek için uygun bir görüntü analiz yazılım programı kullanmak, akciğer kolonizasyonunun nicelleştirilmesini kolaylaştırır.

Lewis akciğer karsinomu hücrelerinde fibronektin eksprese eden veya karıştırılmış fibronektin eksprese eden intravenöz iletim, enjeksiyondan 38 ve 45 saat sonra toplanan akciğer dokusunda önemli ölçüde daha düşük sayıda fibronektin eksprese eden hücre gösterir ve fibronektinin akciğer lobu kolonizasyonu ve tümör gelişimindeki rolünü vurgular. Bu prosedürü denerken, bağlanmamış hücrelerin yıkanabilmesi için akciğerleri dikkatli bir şekilde perfüze etmeyi unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kanser metastazı alanındaki araştırmacıların, tümör hücrelerini bir fare sıfır gram modelinde dolaştırarak akciğer kolonizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör hücresi süspansiyonlarını floresan olarak etiketlemeyi, tümör hücrelerini intravenöz olarak inoküle etmeyi, fare akciğerlerini perfüze etmeyi ve metastaz yapmış tümör hücrelerini görüntülemek için konfokal çiçeklenme mikroskobunu kullanmayı iyi anlamış olmalısınız.