Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

Cerrahi olarak rezeke edilen tümör dokusundan türetilen bu insan preklinik modelinin genel amacı, hasta kaynaklı yumuşak doku sarkomunun birincil kültürünün oluşturulmasını sağlamaktır. Bu yöntem, yumuşak doku sarkomunun patofizyolojisi ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve tedaviye yanıtı tahmin etmek için önemli bir klinik öncesi aracı temsil eder. Bu tekniğin temel avantajı, tamamen insana ait bir preklinik model olmasıdır.

Bu tekniğin etkileri yumuşak doku sarkomunun tedavisine kadar uzanır, çünkü bu preklinik model, aktivitelerini ve etki mekanizmalarını araştırmak için geleneksel yenilikçi ilaçlarla test edilebilir. Bu yöntem yumuşak doku sarkomu hakkında bilgi verebilse de, kanser hücresi yumuşak doku hücre etkileşimi çalışmasına da uygulanabilir. Bu yönteme yeni başlayan kişiler, tümör dokularının heterojenliği ve tümör hücrelerinin izole edilmesinde mücadele edeceklerdir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, ilk yumuşak doku sarkom hücre seçimi ve CD adımlarının yeterliliğe ulaşılmadan önce bir miktar deneyim gerektirmesi nedeniyle kritiktir. Tümör örnekleri, bir parafin filmi ile kapatılmış 50 mililitre DMEM düşük glikozlu ortam içeren 100 mililitrelik steril bir idrar kabında alınmalıdır. Örnekler, tümör rezeksiyonundan sonra en fazla üç saat boyunca dört santigrat derecede tutulabilir.

Doku kültürü başlığını %70 etanol ile sterilize edin ve çelik INOX cımbızları %70 etanol ile sterilize edin. Parafin filmini idrar kabından çıkarın ve atın. İdrar kabının dışını %70 etanol ile temizleyin.

Kare bir Petri kabı açın, ardından idrar kabını açın ve tümör örneklerini tabağa aktarmak için sterilize edilmiş çelik INOX cımbızını kullanın. PBS ekleyin ve tümör örneğini iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, tümör örneğini bir ila iki milimetre büyüklüğünde parçalar halinde ince bir şekilde parçalayın.

Toplam numunenin dörtte birini iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpe bir mililitre TRIzol reaktifi ekleyin ve hemen eksi 80 santigrat derecede dondurun. İnce parçalanmış tümör materyalinin geri kalanını 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve dört mililitre kollajenaz tip bir çözelti ekleyin.

Daha sonra kollajenaz tipi bir çözeltiyi dört mililitre kültür ortamı ile seyreltin, tüpü kapatın ve parafin film ile kapatın. Sindirimi etkinleştirmek için 37 santigrat derecede yuvarlanan bir çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, tüpü sarmal çalkalayıcı ile oda sıcaklığına getirin ve gece boyunca bırakın.

Ertesi gün, hücre süspansiyonunu 100 mikronluk steril bir filtreden 50 mililitrelik bir tüpe nazikçe süzün. Daha sonra filtreyi kültür ortamı ile yıkayın ve süzüntüyü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 225 kez g'de santrifüjleyin. Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve hücreleri bir ila iki mililitre kültür ortamı ile yeniden süspanse edin.

Bir hücre sayımı yaptıktan ve hücre sayısını hesapladıktan sonra, hücreleri santimetre kare başına 80.000 hücre yoğunluğunda standart bir tek katmanlı kültürde kaplayın. Sitolojik bir örnek hazırlamak için, 200 mikrolitre kültür ortamında 100.000 hücre toplayarak başlayın. Çözeltiyi, bir filtre ile donatılmış ve bir cam sürgü ile monte edilmiş tek kullanımlık bir huniye pipetleyin.

Sitosantrifüjü açın ve numuneleri yerleştirin. Sitosantrifüjlemenin ardından, filtreyle donatılmış huniyi atın. Ardından slaydı asetonda 10 dakika sabitleyin, ardından beş dakika kloroform uygulayın.

Birleşme yaklaşık% 90 olduğunda STS hücrelerini geçirinHücre tabakasını PBS ile yıkadıktan sonra, PBS'ye iki ila üç mililitre 1X Tripsin ekleyin ve 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ayrılan hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 200 ila 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için dört mililitre ortam ekleyin.

Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 225 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, bir mililitre ortam ekleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni bir kültür plakasına veya bir şişeye tohumlayın. Tümör hücreleri, 54 yaşındaki bir hastadan cerrahi olarak çıkarılan bir liposarkomdan izole edildi.

Hasta doku örneğinde MDM2 amplifikasyonunu tespit etmek için floresan in situ hibridizasyon yapıldı. İzole tümör hücrelerinde MDM2 amplifikasyonunun sitolojik analizi, hasta kaynaklı bir primer kültürün oluşumunu doğrular. Kültürler Ifosfamide, Epirubicin, Ifosfamide ve Epirubicin, Trabectedin ve Eribulin ile tedavi edildiğinde bazdan morfolojik değişiklikler indüklenmiştir.

Her canlılık deneyi için üç bağımsız kopya gerçekleştirildi. Sonuçlar, kültürlerin kemoterapiye duyarlılığını doğruladı. En aktif tedavi, ileri veya metastatik ALT-DDLPS'de kullanılan birinci basamak tedavi olan Ifosfamid ve Epirubisin ile birleştirildi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa 15-16 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, tümör örneğini ince bir şekilde parçalamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, yumuşak doku sarkomu biyolojisi ile ilgili ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyon profili, immünohistokimyasal analiz veya sitotoksisite testi dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış analizleri gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, yumuşak doku sarkomu alanındaki araştırmacıların, bu kötü keşfedilmiş malignitelerin doğal tarihini incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, hasta kaynaklı yumuşak doku sarkomunun birincil kültürünün nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. Biyolojik numuneler ve ilaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek ve çeker ocak ile çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.